攜帶H1N1 pdm09基因的重配豬流感病毒分子流行特征研究進展

余良政，丁仰保，何劍橋，劉林林，崔柏楊，郭嘉寧，曾 昊，郭金凡，韋祖樟，歐陽康，黃偉堅，陳 櫻

(動物傳染病與分子免疫學實驗室，廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530004)

豬流感(Swine influenza，SI)是由豬流感病毒(Swine influenza viruses，SIV)引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。此外，SIV還是豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)的原發(fā)性致病原，它能使豬群繼發(fā)或者混合感染多種病原體，嚴重制約著我國生豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。豬作為流感病毒的 “混合容器”，其呼吸道上皮細胞表面同時存在人流感病毒結合受體(唾液酸α-2,6-半乳糖苷，SAα-2,6-Gal)和禽流感病毒結合受體(唾液酸α-2,3-半乳糖苷，SAα-2,3-Gal)。當兩種或多種流感病毒同時侵染一種宿主細胞時，伴隨著病毒在宿主細胞內(nèi)的不斷增殖，它們的基因片段之間可以隨機互換[1]，即來自不同宿主或者譜系的流感病毒可能在豬體內(nèi)通過基因重配的方式產(chǎn)生比親本毒株更具有感染和復制能力的新型流感病毒[2]。

人類總共經(jīng)歷過4次流感大流行，均與流感病毒的基因重配密切相關，基因的交替重配會驅動病毒的進化和對宿主的適應性。特別是2009年甲型H1N1大流感(2009 Pandemic H1N1，H1N1 pdm09)的暴發(fā)進一步證實了SIV可以感染人。遺傳進化分析表明，H1N1 pdm09是一種新型的四重重配的豬源流感病毒，可能是由“人-禽-豬”三源流感病毒的基因片段在豬體內(nèi)經(jīng)過數(shù)十年的進化才得以形成，直至2009年跨種傳播感染人，最終成為人類流感大流行毒株。近年來，H1N1 pdm09已與本地流行毒株頻繁發(fā)生基因交換，產(chǎn)生了許多不同來源和重配形式的SIV變異株[3-6]。本文綜述了2010年-2020年與SIV流行病學調查工作相關的研究成果，重點圍繞攜帶H1N1 pdm09內(nèi)部基因的新型重配SIV的分子流行征展開論述，為今后更好地應對新發(fā)人獸共患傳染病提供參考。

1 分子流行情況

1.1 新型重配H1N1亞型SIV

2010年，我國廣東最早發(fā)現(xiàn)了一種表面基因HA和NA來源于歐亞類禽H1N1譜系(Eurasian Avian-like H1N1，EA H1N1)，內(nèi)部基因全部來源于H1N1 pdm09譜系的三源重配SIV(A/swine/Guangdong/1361/2010 H1N1，GD-1361)。動物試驗表明GD-1361株不僅能在豬與豬或者豬與雪貂之間傳播，也可以在人肺組織中復制。在此之后，我國其他省份也陸續(xù)報道了類似重配的H1N1亞型SIV，但不同的是，這些毒株的M基因來源于EA H1N1譜系、NS基因來源于北美三源重組H1N2譜系(North America triple reassortant H1N2，TR H1N2)，它們的重配形式較于早期發(fā)現(xiàn)的GD-1361株發(fā)生了顯著的變化。有研究從國內(nèi)10個省豬場中分離獲得了228株SIV，其中EA H1N1亞型SIV的數(shù)量占比60%，這些毒株可分為兩類不同的抗原群，其抗原性均有別于當時人群中主要流行的H1N1 pdm09。它們能夠優(yōu)先甚至完全同人型受體結合，并且部分毒株還可以在雪貂之間通過飛沫高效地傳播[7]。研究發(fā)現(xiàn)，“純”EA H1N1逐漸消失，而攜帶H1N1 pdm09內(nèi)部基因的新型重配EA H1N1開始在豬群中流行起來[8]，甚至在犬群[9]中也有所發(fā)現(xiàn)。有學者不僅發(fā)現(xiàn)了廣西豬群中存在著新型重配EA H1N1毒株的流行，而且血清學研究證實了EA H1N1亞型SIV一直都是該地區(qū)豬群中最主要的優(yōu)勢毒株之一[10]。H1N1 pdm09譜系的內(nèi)部基因不僅可以與EA H1N1毒株的表面基因，而且還可以與季節(jié)性H1N1人流感病毒的表面基因發(fā)生重配。有研究從俄羅斯同一家私人農(nóng)場中連續(xù)2年得到相同基因型的新型重配H1N1亞型SIV，它們的內(nèi)部基因全都來自H1N1 pdm09譜系，表面基因分別與20世紀80年代的季節(jié)性H1N1人流感病毒的HA和NA基因同源性最高[11]。還有研究從廣東地區(qū)分離獲得3種不同基因型的H1N1亞型SIV，它們均包含有至少4個H1N1 pdm09的內(nèi)部基因，其中GD101/16毒株在豬群中的血清陽性率連續(xù)兩年高達32%左右[12]。最新研究表明一種新型G4 EA H1N1在我國豬場中占據(jù)了主導地位，它們具有與H1N1 pdm09毒株類似的特征，該類型毒株既能夠與人型受體結合，又能夠在人呼吸道上皮細胞上大量增殖，而且在雪貂中表現(xiàn)出高效的感染能力和氣溶膠傳播能力[13]?？傊?，攜帶H1N1 pdm09內(nèi)部基因的新型EA H1N1亞型SIV是目前我國豬群中廣為流行的毒株，它們已經(jīng)危害到了人類的健康。

1.2 新型重配H1N2亞型SIV

H1N2亞型SIV分離株最早于1978年從日本豬體內(nèi)獲得，之后H1N2亞型SIV在東南亞地區(qū)的豬群中廣泛流行。直到2004年中國才首次分離鑒定出H1N2亞型SIV，該毒株只是一種人源H3N2與豬源H1N1的二源重配病毒。H1N1 pdm09暴發(fā)后的第3年，我國學者從全國10個省份共計2 600份樣品中，分離獲得2株攜帶有6個H1N1 pdm09內(nèi)部基因的新型重配H1N2亞型SIV，其HA、PB2、M、NS基因片段來自于H1N1 pdm09譜系，NA、PB1、PA、NP基因來源于類人H3N2譜系(Human-like H3N2，HL H3N2)。隨后，2016年從遼寧省發(fā)現(xiàn)另外一種H1N2亞型SIV(A/swine/Liaoning/FX575/2016)，該毒株的HA基因來自EA H1N1譜系，NA基因來源于TR H1N2譜系，其余6個內(nèi)部基因全部來自H1N1 pdm09譜系，體內(nèi)試驗結果表明FX575株對小鼠呈現(xiàn)中等致病力[14]。2018年在韓國豬群中也監(jiān)測到了2株不同的新型重配H1N2亞型SIV，盡管PA基因、NP基因均來自H1N1 pdm09譜系，但是它們的表面基因HA分別來自類禽和豬流感(Classical SIV，CS)譜系，深入研究發(fā)現(xiàn)同時攜帶禽源HA基因和H1N1 pdm09毒株PA、NP基因的H1N2亞型SIV在豬和小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出更高的毒力[15]。

1.3 新型重配H3N2亞型SIV

2010年-2011年，我國香港、廣西地區(qū)報道了攜帶有H1N1 pdm09基因片段的新型重配H3N2亞型SIV的出現(xiàn)。這些毒株的表面基因HA和NA均來源于HL H3N2譜系，內(nèi)部基因全部來自于H1N1 pdm09譜系。2013年-2014年在廣西豬群中同樣發(fā)現(xiàn)了類似重配方式的H3N2亞型SIV[10]，經(jīng)過連續(xù)5年的追蹤，2019年，又在同一豬場分離獲得與5年前基因型完全一致的新型重配H3N2亞型SIV。序列分析發(fā)現(xiàn)，新分離毒株的HA蛋白仍舊保持了與人受體結合的分子特征(190D、226I和228S)，卻也出現(xiàn)了V223I或P227S的新變化[16]。2009年-2016年對美國豬群的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)了44種不同基因型的重配SIV，其中6種H3N2亞型SIV能夠非常高效地感染豬，且不同程度地影響豬肺臟組織的損傷以及病毒的排毒情況，這些毒株至少攜帶有1個H1N1 pdm09基因，尤其是PA、NP、M基因來自H1N1 pdm09譜系的SIV相比于其他重配形式的毒株在豬體內(nèi)表現(xiàn)出了較高的致病性以及較長的排毒期。

2 傳播力和致病性相關的分子基礎研究

2.1 傳播力

H1N1 pdm09毒株內(nèi)部基因NP、M和NS 3個片段的共同作用可使重組H9N2病毒獲得豚鼠間高效的氣溶膠傳播能力，并且增強重組病毒對小鼠的毒力[17]。M基因是支持H1N1 pdm09大流行的關鍵因素，研究證實H1N1 pdm09病毒M基因的引入能夠明顯提高重組病毒在空氣中的傳播能力。PB1-F2是一種促凋亡蛋白，然而H1N1 pdm09的PB1-F2蛋白，由于終止密碼子的存在，其編碼框僅能編碼11個氨基酸，PB1-F2蛋白上出現(xiàn)的截短突變可能是促進H1N1 pdm09在人群中快速傳播的原因。PB2/627K和PB2/701N是決定禽流感病毒在哺乳動物間傳播能力的關鍵因素，但是H1N1 pdm09病毒的PB2蛋白在627與701位仍保持禽源病毒的特征(627E和701D)，H1N1 pdm09上的“PB2/590S+591R”組合似乎彌補了PB2/627和701位點為禽類病毒氨基酸特征時病毒在哺乳動物細胞及體內(nèi)的適應性。

2.2 致病力

H1N1 pdm09的病毒核糖核蛋白復合物(virus ribonucleoprotein，vRNP)在病毒哺乳動物適應性、復制能力、致病性等方面均發(fā)揮作用[18]。發(fā)生在H1N1 pdm09毒株PB1蛋白上的單個T296R氨基酸位點突變，影響了變異株體內(nèi)外的復制動力學，增強了病毒在人細胞中的聚合酶活性以及對小鼠的致病力。H1N1 pdm09的PA和PB2基因均來自北美禽流感病毒，是發(fā)生過適應性變化的基因片段，其上具備感染哺乳動物的分子特征。PA蛋白上的一些氨基酸殘基85I、186S和336M能夠提高禽流感病毒在哺乳動物細胞中的聚合酶活性，同時也與H1N1 pdm09 毒株在哺乳動物身上的適應性和致病力有關；而PB2蛋白上的T271A的突變同樣也能夠提升H1N1 pdm09在人細胞中的聚合酶活性，促進病毒的增殖。H1N1 pdm09上的PB2蛋白T588I突變可以通過提升病毒復制能力以及增強病毒對β干擾素的抑制作用來提高其自身毒力。此外，H1N1 pdm09的聚合酶復合體蛋白，即PA+PB1+PB2+NP(3P+NP構造)能夠為重配病毒提供較好的聚合酶活性，有助于提高重配病毒的復制能力。被攜帶有“3P+NP構造”的重配病毒感染的小鼠肺部細胞能夠顯著地高效表達病毒蛋白，高產(chǎn)量的病毒蛋白會引起機體過度的免疫反應，從而造成小鼠肺臟的嚴重損傷[19]。

2.3 兼容性

H5N1、H7N9、H9N2亞型禽流感病毒，都有導致人患流感重癥而死亡的情況，但是這些病毒并不具備有效且持續(xù)的“人傳人”的能力。無論是人為試驗條件，還是自然感染條件，H5N1、H7N9、H9N2亞型禽流感病毒都能夠感染豬，但是這些禽源SIV在豬群中無法建立穩(wěn)定的遺傳譜系。H9N2[20]、H5N1[21]等亞型禽流感病毒與pdm/09 H1N1均存在著基因適配性，自然情況下兩者發(fā)生重配的概率非常高。假如在豬的體內(nèi)兩者關鍵的“功能性基因片段”能夠高效地組合，產(chǎn)生了兼具高致病力和人際間快速傳播等特點的優(yōu)勢流行株，這必將嚴重威脅到人類健康[22]。通過人為重組試驗發(fā)現(xiàn)攜帶有H1N1 pdm09內(nèi)部基因的H9N2亞型重配病毒相較于親本毒株在豬的體內(nèi)有著增強的復制、傳播能力，并且在豬體內(nèi)連續(xù)傳代之后，重組病毒還能夠獲得“豬傳豬”的能力。同樣有研究證實了攜帶有H1N1 pdm09內(nèi)部基因的禽源H5N1流感病毒也能夠在豬群當中更好地復制和傳播。

3 公共衛(wèi)生學意義

我國學者研究發(fā)現(xiàn)，由于長期在豬體內(nèi)得以進化，一些本土的EA H1N1亞型SIV早已獲得了感染人的能力，具有了在人群中有效傳播的潛能，而且人群中普遍缺乏針對這類病毒的中和抗體，因此它們被視作是最有可能引起下一輪人類流感大流行的病毒[7]。EA H1N1亞型SIV同H1N1 pdm09存在基因兼容性，它們能夠在豬體內(nèi)發(fā)生重組，產(chǎn)生的子代病毒在小鼠和豚鼠模型上均有增強的毒力以及傳播能力。國內(nèi)已經(jīng)報道了5例EA H1N1亞型SIV感染人的事件。其中，2015年首次報道了1株三重重配EA H1N1毒株感染人的事件。2016年和2019年，福建[23]、天津地區(qū)[24]也相繼出現(xiàn)了新型重配EA H1N1亞型SIV(A/Fujian-cangshan/SWL624/2016、A/Tianjin-baodi/1606/2018)感染人的情況，SWL624和TJ1606這類基因型的毒株(G4 EA H1N1)具有高度適應和感染人類的特征[13]。H1N1 pdm09的內(nèi)部基因很可能逐漸替代了早期感染人的“純”EA H1N1亞型SIV的內(nèi)部基因，并且新型重組SIV仍然保留了感染人的能力。自H1N1 pdm09暴發(fā)后，美國發(fā)現(xiàn)了一種攜帶了H1N1 pdm09毒株M基因的豬源H3N2亞型變異病毒(H3N2 variant，H3N2v)，監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，H3N2v不僅能夠感染人，而且還存在有限的“人傳人”的跡象。研究進一步證實了H1N1 pdm09的M基因在多種動物模型中均可以增強重配毒株的傳播能力。此后，H3N2v長期存在于美國的人群當中，每年都會引發(fā)零星感染，而且病毒本身也在不斷地發(fā)生變異[25]。在澳大利亞同樣存在豬源H3N2v(A/South Australia/85/2018，SA85)感染人的情況，但是SA85株的內(nèi)部基因全部來源于H1N1 pdm09譜系，表面基因HA和NA均來自10年至25年前澳大利亞本地流行的人流感病毒[26]。2019年，中國廣東也發(fā)生了的豬源H3N2v(A/Guangdong/YueFang 277/2017，GD-YF)感染人的事件，該病毒的內(nèi)部基因同SWL624株、TJ1606株保持一致，區(qū)別在于GD-YF株的表面基因HA和NA均來源于較早期的HL H3N2譜系[27]。綜上所述，H1N1 pdm09的內(nèi)部基因具有廣泛的基因兼容性，能夠接受不同亞型或來源流感病毒的HA和NA基因的替換。當抗原性發(fā)生改變，必然會導致動物機體中的抗體不能有效阻斷病毒的入侵，從而引起免疫失敗或保護效力低下。此外，H1N1 pdm09的內(nèi)部基因還可能增強重組病毒的傳播能力，一旦新型重配SIV能夠適應新宿主，進行自我復制，極有可能會導致新一輪的人類大流感大暴發(fā)。

4 展望

H1N1 pdm09的暴發(fā)證實了通過中間宿主“豬”產(chǎn)生的新型重配SIV能夠跨越種間屏障感染人，并且可能進一步引發(fā)人類流感大流行。自從2009年H1N1 pdm09暴發(fā)以來，該病毒在其10年的進化過程中逐漸成為了一種季節(jié)性的流感病毒，在人群中持續(xù)傳播。更重要的是，它們還不斷地潛伏到豬群當中，與本地SIV流行株頻繁發(fā)生重組，產(chǎn)生不同傳播能力、致病性等的新型優(yōu)勢毒株。當前，世界各地的豬群中廣泛分布著攜帶有1～6個H1N1 pdm09內(nèi)部基因的新型重配SIV，它們的重組形式復雜多樣，在流感病毒的生態(tài)循環(huán)中起到了關鍵推動的作用。H1N1 pdm09在人際間高效、迅速地傳播能力與其獨特的內(nèi)部基因構造有著密切的聯(lián)系，鑒于其廣泛的基因兼容性，一些禽源流感病毒的NS和M基因片段也都能夠與H1N1 pdm09的內(nèi)部基因發(fā)生重配。如果在特定的重配模式下，參與重配的關鍵性基因片段之間能夠發(fā)揮協(xié)同作用，那么重組后病毒不僅能很好地適應新的哺乳動物，而且還具有顯著的致病性、感染力、復制力和傳播力。無論是2015年-2018年發(fā)生在中國的“EA H1N1亞型SIV感染人致死”的事件，還是2011年-2016年期間發(fā)生在美國的“豬源H3N2v在人群中小規(guī)模暴發(fā)，造成有限人傳人”的事件均說明了攜帶H1N1 pdm09內(nèi)部基因的新型重配SIV具有感染人的特性，并且已經(jīng)開始對人類健康造成了一定程度的危害。因此，持續(xù)加強對SIV 的監(jiān)測將有助于防控流感病毒的人類大暴發(fā)。