腦原位缺血預(yù)處理通過Nrf2/HO-1信號通路減輕大鼠缺血再灌注損傷

王歡歡 王剛 仲婷婷 孫健 賀宏梅 寇文輝 宋愛霞 鄒玉安 薛茜

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 張家口 075000)

急性缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，占我國腦卒中的69.6%～70.8%〔1，2〕，已嚴(yán)重危害當(dāng)今社會中老年人的健康和生命，每年約有數(shù)百萬人新發(fā)腦卒中。目前急性腦梗死的特異性治療包括改善腦血循環(huán)(靜脈溶栓、血管內(nèi)治療、抗血小板、抗凝、降纖、擴(kuò)容等方法)、他汀及神經(jīng)保護(hù)等〔3〕。其中靜脈溶栓現(xiàn)認(rèn)為有效搶救半暗帶組織的時間窗為4.5 h內(nèi)或6 h內(nèi)〔3〕，隨著DAWN或DEFUSE-3研究急性前循環(huán)大血管閉塞的時間窗被擴(kuò)展到16或24 h〔4〕，但由于嚴(yán)格的適應(yīng)證和短暫的時間窗限制，以上治療僅適用于少數(shù)患者。因此還需要進(jìn)一步了解缺血病理過程的復(fù)雜機(jī)制來開發(fā)缺血性疾病的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。以往研究證實(shí)，腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)理有若干因素包括：(1)興奮性氨基酸毒性作用；(2)Ca2+超載；(3)線粒體損傷；(4)氧化應(yīng)激；(5)炎癥損傷；(6)細(xì)胞凋亡等，而氧化應(yīng)激損傷是腦缺血再灌注損傷的核心病理環(huán)節(jié)。目前，急性缺血性腦血管病內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的研究受到廣泛關(guān)注，通過給予組織一個低于損傷劑量的刺激如缺血、低氧等，激活機(jī)體自身的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，已達(dá)到減輕嚴(yán)重?fù)p傷所帶來的傷害〔5〕。這種機(jī)制主要包括缺血預(yù)處理和后處理，而缺血預(yù)處理又包括原位缺血預(yù)處理和遠(yuǎn)隔器官缺血預(yù)處理。以往研究表明，眾多的神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白及信號通路可能參與腦缺血預(yù)處理的過程，但其作用機(jī)制尚未完全明確〔6〕。而核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2/血紅素加氧酶(HO)-1信號通路是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)控因子之一〔7〕。本研究旨在探討腦原位缺血預(yù)處理是否可通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路，提高缺血打擊的耐受能力。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 250～280 g雄性SD大鼠180只，由河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，并獲得河北北方學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)管理委員會批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動物中心室溫(24±1)℃、相對濕度(45±5)%、日光燈照射12 h明暗交替。將180只雄性SD大鼠編號并按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(sham組)、 缺血再灌注組(model組)、缺血預(yù)處理組(CIPC組)，每組又分別分為術(shù)后6、12、24、48和72 h。

1.2模型制作及評價 采用Zea-Longa大腦中動脈線栓法建立大鼠模型〔8〕。大鼠水合氯醛腹腔注射全麻后，分離頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈及頸總動脈近心端，從頸總動脈遠(yuǎn)心端將線栓送至頸內(nèi)動脈(18±2)mm，2 h后抽出線栓造成再灌注損傷。CIPC組行右側(cè)頸內(nèi)動脈短暫性血流阻斷10 min，3 d后，同model組方法建立模型，sham組暴露并結(jié)扎血管，不插入線栓。動物清醒后，參照longa 5級評分法篩選動物模型，選取1～3分的動物為造模成功。

1.3主要試劑 MCAO栓線(北京西濃科技有限公司)；兔抗Nrf2多克隆抗體(美國Santa Craz)；兔IgG兩步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(博士德生物)；RNAiso Plus(寶生物工程有限公司)；Fast Quant RT Kit(with gDNase，天根生化科技有限公司)；Super Real PreMix Plus(SYBR Green，天根生化科技有限公司) 。

1.4方法

1.4.1神經(jīng)功能評分 實(shí)驗(yàn)大鼠在術(shù)后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h進(jìn)行改良Garcia J H評分，包括：自主運(yùn)動、體態(tài)、前肢伸展運(yùn)動、抓持和攀爬鐵籠能力、兩側(cè)身體觸覺反射和兩側(cè)胡須觸碰反應(yīng)6部分內(nèi)容，功能正常時得分最高，18分。

1.4.2蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組化檢測Nrf2 將腦組織制成5 μm厚的組織切片分別進(jìn)行HE染色和免疫組化，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4.3qRT-PCR 方法檢測Nrf2和HO-1 mRNA的表達(dá)量 麻醉大鼠，生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，取缺血側(cè)腦組織，在液氮中研磨充分后，按Trizol 試劑說明書提取總RNA，紫外分光光度計檢驗(yàn)RNA 純度，要求波長在260 nm和280 nm處吸光度比值為1.8～2.0。用 RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，建立qPCR體系20 μl，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，退火60℃15 s，40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，Nrf2 上游引物：5＇-CACATCCAGACAGACACCAGT-3＇，下游引物：5＇-CTACAAATGGGAATGTCTCTGC-3＇；HO-1上游引物5＇-GAACTGTGGTCGGTAGAGGC-3＇，下游引物5＇-ATCAAAGTGGCCATGACGCT-3＇；β-actin上游引物5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3＇，下游引物5＇-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3＇。

設(shè)置熔解曲線判斷是否有非特異性的擴(kuò)增。校正每個樣品的Ct值，得ΔCt值。以2-ΔΔCt法計算各組間mRNA的表達(dá)量。ΔΔCt=各組(Ct目的基因-Ct β-actin)-對照組(Ct目的基因-Ct β-actin)，2-ΔΔCt=各組基因表達(dá)量/假手術(shù)組基因表達(dá)量〔9〕。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠不同缺血再灌注時間改良Garcia J H評分比較 model組和CIPC組在各個時間點(diǎn)的神經(jīng)缺損評分均明顯低于sham組(均P<0.01)。再灌注24 h、48 h和72 h時CIPC組的神經(jīng)缺損評分明顯高于model組(均P<0.05)，見表1。

2.2大鼠HE染色 sham組大鼠神經(jīng)細(xì)胞大而圓，形態(tài)規(guī)則，連接緊密。model組6 h出現(xiàn)細(xì)胞水腫，細(xì)胞周圍間隙增寬，細(xì)胞間隙出現(xiàn)大小不等的空泡，無明顯細(xì)胞壞死；12 h時細(xì)胞明顯水腫、上述癥狀逐漸加重；24、48 h時神經(jīng)元核固縮、濃染，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)明顯破裂、排列紊亂，細(xì)胞核呈深染、固縮，周圍出現(xiàn)較大空泡，細(xì)胞壞死明顯；72 h時神經(jīng)元水腫逐漸減輕，部分細(xì)胞出現(xiàn)不可逆性壞死。CIPC組各時間點(diǎn)較缺血再灌注組均可見神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變減輕。見圖1。

表1 各組大鼠不同缺血再灌注時間改良Garcia J H評分比較分，n=6)

圖1 各組大鼠腦梗死神經(jīng)元形態(tài)變化(HE，×400)

2.3各組大鼠 Nrf2表達(dá)情況 sham組Nrf2表達(dá)無明顯改變，在6 h時model組及CIPC組Nrf2核著色的陽性細(xì)胞開始增多，24 h達(dá)高峰，48 h開始下降。model組與CIPC組在各時間點(diǎn)Nrf2核陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于sham組(P<0.01)。CIPC組在各個時間點(diǎn)Nrf2核陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于model組(P<0.05，P<0.01)，見表2、圖2。

表2 各組大鼠不同缺血再灌注時間Nrf2表達(dá)情況比較個，n=6)

2.4各組大鼠Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)情況 sham組Nrf2、HO-1呈低水平表達(dá)且隨著時間的延長無明顯變化。model組、CIPC組Nrf2、HO-1 mRNA在缺血6 h時表達(dá)開始增加，24 h時達(dá)到高峰，48 h開始下降；model組與CIPC組在各時間點(diǎn)Nrf2、HO-1mRNA的表達(dá)均明顯高于sham組(P<0.05，P<0.01)。CIPC組在各個時間點(diǎn)Nrf2、HO-1 mRNA的表達(dá)均明顯高于model組(P<0.05，P<0.01)。見表3。

圖2 各組大鼠免疫組織化學(xué)染色(DAB，×400)

表3 各組大鼠不同缺血再灌注時間Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)比較

3 討 論

缺血性腦卒中是由于腦血管阻塞導(dǎo)致血流供應(yīng)障礙引起的腦卒中，腦細(xì)胞由于能量供應(yīng)障礙引發(fā)了瀑布式級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷〔10，11〕。目前關(guān)于腦缺血神經(jīng)保護(hù)劑的研究眾多，但結(jié)果尚存爭議。其主要原因在于目前研究主要針對單一靶點(diǎn)的藥物，這與缺血性腦損傷瀑布式級聯(lián)反應(yīng)過程是相悖的。因此努力探究全面的神經(jīng)保護(hù)治療方案至關(guān)重要。Correia等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)冠狀動脈缺血預(yù)處理可引起再發(fā)心肌梗死，但其體積減小75%。由此揭示了缺血再灌注損傷的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，并率先提出缺血預(yù)處理(IPC)的概念。最開始，大多數(shù)學(xué)者對IPC研究的重點(diǎn)在如何增強(qiáng)心肌對缺血的抵抗力方面，后期大部分的實(shí)驗(yàn)證明IPC所帶來的缺血耐受是一種較普遍的現(xiàn)象，可在各個器官中發(fā)生，包括心臟、大腦、腎臟、視網(wǎng)膜等〔12〕。心肌和腦組織是相對缺血較敏感的組織，因此也是開展IPC最有希望的部位。以往研究證實(shí)，眾多的神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白和信號通路可能參與IPC的保護(hù)作用〔13，14〕。在臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)有TIA病史的患者腦卒中發(fā)病率及卒中嚴(yán)重程度都有所下降，這一現(xiàn)象為研究腦缺血預(yù)處理提供了思路。

既往研究表明，Nrf2/HO-1信號通路具有抗氧化應(yīng)激損傷的重要作用〔15〕。靜息狀態(tài)下，Nrf2與其抑制因子 Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap)1在細(xì)胞質(zhì)中耦聯(lián)，處于相對抑制的狀態(tài)〔16～20〕，當(dāng)細(xì)胞缺血缺氧時，Nrf2與Keap1解離，Nrf2核轉(zhuǎn)位并結(jié)合HO-1。 HO-1在細(xì)胞應(yīng)激過程中發(fā)揮抗氧化、抗炎的作用。此外，研究證實(shí)HO-1還可作為細(xì)胞應(yīng)激的保護(hù)性應(yīng)答標(biāo)志〔18，19～22〕。Tanaka等〔23〕發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注模型中，Nrf2的表達(dá)是一個動態(tài)變化的過程，Nrf2在缺血組織中2 h時表達(dá)量上升，8 h時達(dá)到高峰，24 h和72 h時表達(dá)下降。而在本研究中，腦缺血預(yù)處理也顯著增加了Nrf2核轉(zhuǎn)移陽性細(xì)胞的數(shù)量及Nrf2 mRNA的表達(dá)，也呈現(xiàn)一動態(tài)變化過程，這與上述研究是一致的。

本研究結(jié)果推測CIPC通過Nrf2/HO-1信號通路對缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果為缺血缺氧性腦病防治提供了新的治療策略，有望改善病人預(yù)后。