服用扶正抗癌方后非小細(xì)胞肺癌晚期患者CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒活性的變化

吳姍姍 王柏山 嚴(yán)峰 張寧 張程

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,遼寧 沈陽(yáng) 110032)

肺癌已成為全世界范圍威脅人類健康，發(fā)生率和死亡率最高的腫瘤疾病，而且其發(fā)生率和死亡率還在持續(xù)升高〔1〕。其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占85%,主要包括小細(xì)胞肺癌以外的鱗癌、腺癌、腺鱗癌等病理類型，早期并無(wú)明顯癥狀，多數(shù)病例在發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，所以生存率偏低〔2,3〕。近年新興眾多針對(duì)患者具體情況的個(gè)性化治療，但是大部分NSCLC仍發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)扶正抗癌方不但可以提高機(jī)體對(duì)放、化療的敏感性，還可明顯降低其毒副作用〔5,6〕。扶正抗癌方可提升免疫力抵抗癌細(xì)胞抑制瘤體生長(zhǎng)，但具體機(jī)制尚不清楚。CD8+T細(xì)胞又稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，CTL表面的T細(xì)胞受體與靶細(xì)胞上的抗原肽-主要組織相溶性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類分子結(jié)合,CTL的溶解顆粒被轉(zhuǎn)運(yùn)到與靶細(xì)胞的接觸點(diǎn)，穿孔素和顆粒酶B被釋放到CTL與靶細(xì)胞之間的免疫突觸中，上述釋放出的顆粒成分可作用于靶細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡，對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮免疫監(jiān)視作用〔7〕。我們之所以認(rèn)為CTL在抗腫瘤的過(guò)程中發(fā)揮重要作用主要基于以下原因:經(jīng)常在腫瘤組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)CTL，患有腫瘤的小鼠進(jìn)行過(guò)繼性的CTL移植對(duì)于腫瘤的治療是有效的，而且CTL效應(yīng)機(jī)制的缺陷會(huì)提升罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)〔8〕。CTL通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶殺傷腫瘤細(xì)胞〔9〕。CTL如若表達(dá)CD107a可激活其自身脫顆粒，繼而分泌胞內(nèi)穿孔素〔10〕?？乖禺愋訲細(xì)胞可分泌干擾素(IFN)-γ和腫瘤壞死因子(TNF)-α等多種細(xì)胞因子，上述細(xì)胞因子可以刺激腫瘤細(xì)胞上MHC Ⅰ類分子的表達(dá)，使CTL更靈敏的識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞〔11，12〕。因此顆粒酶、CD107a和IFN-γ可作為評(píng)價(jià)CD8+T細(xì)胞效應(yīng)功能的指標(biāo)。本研究旨在探索晚期NSCLC患者按療程規(guī)范服用扶正抗癌方前后CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒活性是否有改善。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2018年5月至2019年1月遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院31例有明確病理診斷的晚期NSCLC患者，男18例，女13例;平均年齡(45.5±3.8)歲，其中鱗癌14例，腺癌17例；TNM Ⅲa期8例，Ⅲb期11例，Ⅳ期12例，據(jù)服用抗癌方前后，分別定義為治療前組和治療后組。選擇21例健康體檢者作為健康對(duì)照(NC)組，男11例，女10例，平均年齡(42.3±3.5)歲。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合原發(fā)性NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)〔13〕，無(wú)其他腫瘤病史。②無(wú)激素或免疫抑制劑治療。③排除活動(dòng)性感染。Karonfsky功能狀態(tài)(KPS)評(píng)分≥70分。

1.3藥物干預(yù) 扶正抗癌方(主要成分：苦參15 g，生白術(shù)12 g，生甘草5 g，半夏15 g，大貝20 g，半枝蓮15 g，白花蛇草30 g，茯苓20 g，陳皮15 g，生苡仁30 g)可根據(jù)具體情況辨證加減，醫(yī)院制劑科按標(biāo)準(zhǔn)流程制備，1劑水煎至150 ml/d，分早、中、晚3 次服用，30 d為1個(gè)療程〔12〕。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值 具體步驟： 20 μl BD公司CD4/CD8/CD3試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，逆向加樣50 μl外周靜脈全血，室溫避光15 min，加10倍稀釋免洗溶血素450 μl，室溫避光15 min，樣本溶血后FACSCalibur檢測(cè)，Multiset軟件分析。

1.4.2CD8+T細(xì)胞體外功能 具體步驟：用Ficoll-Hypaque提取外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞用包含10%胎牛血清的RPMI1640調(diào)整濃度為2.0×105/ml，加入50 ng/ml的PMA和1 μg/ml的離子霉素，同時(shí)加入抗 CD107a 抗體和GolgiStop進(jìn)行培養(yǎng)，孔板底部加入100 μg/ml的鏈霉素和100 U/ml的青霉素。37℃ 5%CO2濃度的培養(yǎng)箱孵育4 h，抗體CD3-PE/CD8-Percp做細(xì)胞表面染色。BD破膜試劑盒在4℃破膜30 min， 然后胞內(nèi)染色 IFN-γ-FITC和顆粒酶B-FITC，最終用200 μl含1%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮。FACSCalibur的Cellquest軟件檢測(cè)，F(xiàn)lowJo7.6軟件分析。

1.5生存質(zhì)量評(píng)價(jià) KPS評(píng)分評(píng)價(jià)患者的生存質(zhì)量。提升：比治療前評(píng)分升高≥10分；平穩(wěn)：治療前后評(píng)分變化幅度<10分；降低：比治療前評(píng)分減少≥10分〔14〕。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、Spearman秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1NC組與NSCLC治療前后CD4+T和CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值比較 NSCLC組治療前后CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值均顯著低于NC組(P<0.01)；NSCLC組治療前和治療后各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NSCLC組治療前和治療后CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值顯著低于NC組(P<0.01)；NSCLC組治療后CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值顯著高于治療前(P<0.01)。見表1。

表1 治療前、治療后和NC組的比較〔M(Q25,Q75)，個(gè)/μl〕

2.2NC組與NSCLC組治療前和治療后CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒活性的比較 NSCLC組治療前和治療后CD107a+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著低于NC組(P<0.01)；NSCLC組治療前和治療后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。NC組顆粒酶B+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著高于NSCLC組治療前和治療后(P<0.01)；NSCLC組治療前和治療后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。NC組IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著高于NSCLC組治療前和治療后(P<0.01)；NSCLC組治療后IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著高于治療前(P<0.01)，見表1。

2.3不同TNM分期NSCLC患者各細(xì)胞水平比較 Ⅳ期患者CD4+T細(xì)胞、絕對(duì)值、CD107a+CD8+T細(xì)胞的百分比、顆粒酶B+CD8+T細(xì)胞百分比、IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比顯著低于Ⅲ期(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，見表2。

2.4不同病理類型NSCLC患者各細(xì)胞水平比較 CD4+和CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值、表達(dá)CD107a和釋放顆粒酶B及分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞占百分比無(wú)論鱗癌還是腺癌，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.5治療前組性別差異 CD4+和CD8+T細(xì)胞絕對(duì)值、表達(dá)CD107a、釋放顆粒酶B及分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞占百分比性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同臨床特征NSCLC患者各細(xì)胞水平比較〔M(Q25,Q75)，個(gè)/μl〕

2.6相關(guān)性分析 NSCLC患者CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值與CD107a+CD8+呈正相關(guān)(r=0.483，P<0.01)。

2.7生存質(zhì)量評(píng)價(jià) 接受治療的31例患者KPS評(píng)分的改變，7例(22.6%)分?jǐn)?shù)升高≥10分；19例(61.2%)分?jǐn)?shù)升高<10分；5例(16.1%)分?jǐn)?shù)減少≥10分。83.9%的患者治療后生存質(zhì)量穩(wěn)中有升。

3 討 論

中醫(yī)古籍雖沒(méi)有記載“肺癌”專病，但可歸為“肺積”“咯血”和“息賁”等。肺癌患者正氣內(nèi)虛，虛損情況突出，應(yīng)始終顧護(hù)正氣。肺癌進(jìn)行放化療、靶向治療時(shí)均可輔以扶正補(bǔ)虛療法，研究證實(shí)可明顯增加放化療療效減低其毒副作用并且改善機(jī)體免疫功能〔5,6〕。Shankaran 等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)CTL可抑制惡性實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。CD8+T細(xì)胞可通過(guò)一些細(xì)胞溶解酶(顆粒酶、穿孔素)和分泌細(xì)胞因子(IFN-γ)等對(duì)腫瘤發(fā)生免疫應(yīng)答。

CD107a是溶酶體相關(guān)膜蛋白(LAMP)-1，只有當(dāng)T細(xì)胞活化后發(fā)生脫顆粒才會(huì)暴露于細(xì)胞表面，CD8+T細(xì)胞一旦表達(dá)說(shuō)明其發(fā)生脫顆粒〔16〕。Mittendorf等〔17〕將CD107a脫顆粒試驗(yàn)與傳統(tǒng)的測(cè)定細(xì)胞毒性的51Cr釋放試驗(yàn)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：CD107a與51Cr釋放試驗(yàn)一樣可以用于測(cè)定細(xì)胞溶解活性，并可應(yīng)用于腫瘤研究。而且CD107a不具有放射性，不會(huì)污染環(huán)境，基于上述優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于評(píng)價(jià)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。本研究結(jié)果說(shuō)明NSCLC晚期患者CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力均較健康人明顯降低?；颊咴诜梅稣拱┓胶?CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性可有提升但并未產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，我們推測(cè)納入的樣本量偏少是可能的原因。而且CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值高的患者其CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性就高，提示其預(yù)后可能較好。

顆粒酶B主要存在于CD8+T細(xì)胞的顆粒內(nèi)，必須依賴穿孔素才能破壞靶細(xì)胞〔18,19〕。Hodge等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織較非癌肺組織內(nèi)的CD8+T細(xì)胞表達(dá)顆粒酶B的百分比顯著下降。這與我們?cè)谕庵苎械贸龅慕Y(jié)論是一致的，上述結(jié)論表明顆粒酶B+CD8+T細(xì)胞百分比的顯著減低直接影響CD8+T細(xì)胞破壞腫瘤細(xì)胞的功能。本研究發(fā)現(xiàn)服用扶正抗癌方后患者顆粒酶B+CD8+T細(xì)胞的百分比較服用前有所升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，我們推測(cè)納入的樣本量偏少是可能的原因。

表達(dá)IFN-γ的Th1細(xì)胞可以介導(dǎo)對(duì)抗病原微生物的免疫應(yīng)答，這種應(yīng)答被認(rèn)為有利于清除腫瘤細(xì)胞和助力抗原特異性細(xì)胞毒性反應(yīng)〔21〕。IFN-γ除了誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞的提呈作用，還可上調(diào)抗原提呈細(xì)胞上的MHC Ⅰ/肽復(fù)合物，使抗原特異性的CD8+T細(xì)胞再次發(fā)生活化和增殖，此時(shí)活化的腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞可識(shí)別腫瘤細(xì)胞并向其釋放致死量的細(xì)胞毒性分子〔22〕。所以IFN-γ是抗腫瘤的核心細(xì)胞因子。上述證據(jù)表明扶正抗癌方能有效增加CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ，有利于消滅體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。83.9%的患者服用扶正抗癌方后生存質(zhì)量評(píng)價(jià)穩(wěn)步提升也恰恰印證了這一事實(shí)。這與CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒活性的改善是密不可分的。

本研究結(jié)果表明NSCLC晚期患者隨著疾病的進(jìn)展CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性是逐漸下降的。但是CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD107a、顆粒酶B及IFN-γ在鱗癌和腺癌之間以及不同性別間并無(wú)顯著性差異。

綜上，NSCLC晚期患者連續(xù)服用扶正抗癌方一個(gè)月，大部分患者生存質(zhì)量可穩(wěn)步提升，CD8+T細(xì)胞的數(shù)量增加并且其細(xì)胞毒活性提升，有利于患者預(yù)后。