不同比例氯化鑭正畸粘接劑抗菌性和粘接性能的實驗研究

繆 羽，王慧娟，韓 赫

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院口腔科，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

固定矯治是目前正畸臨床使用最普遍的方法，但是由于固定矯治器的托槽、弓絲及附件都會妨礙牙面的清潔，牙釉質(zhì)脫礦成為固定矯治治療中較多見的并發(fā)癥之一，且發(fā)病率較高，經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)達20%～50%[2]。由于正畸治療周期長、病人以依從性較差的青少年為主，正畸治療期間成為牙釉質(zhì)脫礦的高發(fā)期，若沒有引起醫(yī)生及病人的足夠重視，就有可能導(dǎo)致齲齒的發(fā)生。因此，貫通于整個正畸矯治過程、不需要病人高度配合的措施更適合青少年病人。具有持續(xù)穩(wěn)定防齲效果的粘接材料研究為牙釉質(zhì)脫礦的預(yù)防提供了一個思路。

近年來稀土元素不僅備受現(xiàn)代高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)的青睞，在農(nóng)牧業(yè)、漁業(yè)、醫(yī)療方面也被廣泛應(yīng)用和研究。目前很多學(xué)者熱衷于探索鑭元素在燒傷、腫瘤、腎臟和口腔材料等領(lǐng)域的生物學(xué)作用，并且證實鑭元素具有抗炎、抗菌和抗腫瘤等作用[3]。本研究在正畸粘接劑中添加氯化鑭，并對其抗菌性能和粘接性能進行檢測。為固定矯治時脫礦和齲病的預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

氯化鑭（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；光固化型牙釉質(zhì)粘合樹脂（西湖巴爾，杭州西湖生物材料有限公司）；遠緣鏈球菌（ATCC 33478，廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心）；腦心浸出物培養(yǎng)基（BHI，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；瓊脂（Agar，Biosharp 公司）；樹脂改良型玻璃離子粘固劑（GC FujiOrtho LC，日本）；離體前磨牙（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬包頭口腔醫(yī)院提供）；正畸直絲弓托槽（杭州新亞）；自凝樹脂（上海二醫(yī)張江生物材料有限公司）。

1.2 設(shè)備

LED 光固化燈（Elipar S10，美國3M 公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（SQ510C，重慶雅馬拓科技有限公司）；電子天平（BSA124S-CW，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺（HFaafe-1200LC，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；旋渦混合儀（XW-80A，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（PYX-DHS-35 X 40，上海醫(yī)療器械七廠）；酶標儀（Multiskan GO，芬蘭賽默飛世爾科技公司）；空氣浴振蕩器（HZQ-C，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；萬能試驗機（CMT5101，深圳市新三思計量技術(shù)有限公司）；恒溫水浴箱（DK-600S，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；光學(xué)顯微鏡（SMZ1500，日本尼康）。

1.3 氯化鑭正畸粘接劑的制備

精密電子天平稱量1%、2%、3%、4%、5%質(zhì)量分數(shù)的氯化鑭與正畸光固化型牙釉質(zhì)粘合樹脂充分攪拌均勻，分別作為實驗組A 組、B 組、C 組、D 組、E組，密封避光保存?zhèn)溆谩２缓然|的正畸粘接劑為對照組F組。

1.4 正畸粘接劑抗菌性能測試

1.4.1 實驗試件制備將六組光固化型粘合樹脂制備為直徑6mm，厚1mm 的圓柱狀試件，A～F 組各20個，用無菌生理鹽水沖洗試件表面以去除未固化的樹脂單體，試件用75%酒精浸泡3min后置于超凈工作臺內(nèi)，雙面各經(jīng)紫外燈光照射30min備用。

1.4.2 遠緣鏈球菌的復(fù)蘇和培養(yǎng)將凍干菌株遠緣鏈球菌復(fù)蘇后，使用接種環(huán)挑取形態(tài)特征明顯的單菌落，接種于裝有5mL BHI液體培養(yǎng)基的離心管中，置于空氣浴振蕩器中37℃恒溫厭氧培養(yǎng)48h備用。

1.4.3 實驗用菌液制備將1.4.2制備的遠緣鏈球菌菌液在旋渦混合儀上混勻，移液器吸取菌液于酶標板孔中，測菌液OD540值，若OD540值小于1，則繼續(xù)37℃恒溫厭氧培養(yǎng)直到OD540值大于或等于1，稀釋菌液直到OD540=1，備用。

1.4.4 抑菌環(huán)法測試抗菌性能使用無菌接種環(huán)蘸取稀釋好的菌懸液在90mmBHI 固體平板培養(yǎng)基上均勻涂抹3 次，每涂抹1 次后將平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)動60°繼續(xù)涂抹，最后再繞平板培養(yǎng)基的四周涂抹一圈。將一個對照組（F組）的樹脂試件置于BHI固體平板培養(yǎng)基中央，將實驗組A～E組中各一個試件等距離地放置在以F 組試件為圓心、直徑25mm 的同心圓上，蓋好培養(yǎng)皿，置于電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃厭氧條件（80%N2、10%H2、10%CO2）下培養(yǎng)48h 后，觀察實驗結(jié)果。

1.4.5 測量A～F 組菌液OD540值 取 60 只無菌離心管，各加1mL BHI 液體培養(yǎng)基，并接種1.4.3 已備好菌液200μL，隨機將離心管分為6組，分別放入消毒好的粘合樹脂樣本片，37℃厭氧條件（80%N2、10%H2、10%CO2）下培養(yǎng)48h，離心管置于旋渦混合儀上振蕩30s，移液器吸取200μL 混勻的菌液滴入96 孔酶標板孔中，用酶標儀檢測各孔的OD540值，測量3次，取平均值。

1.4.6 5%氯化鑭正畸粘接劑和樹脂改良型玻璃離子（RMGIC）抗菌性能的對比實驗試件制備：制作直徑6mm，厚1mm 的5%氯化鑭正畸粘接劑試件20個，RMGIC試件30個，分為1組、2組和3組，每組又包括5%氯化鑭組和RMGIC 組試件各10 個（1 組的5%氯化鑭組即1.4.5 實驗的E 組），1、2、3 組試件在蒸餾水中分別浸泡0h、48h 和1 周。消毒后備用。OD540值測量：測量方法同1.4.5。

1.5 正畸粘接劑粘接性能測試

1.5.1 離體牙準備選取2018-10～2019-02 于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬包頭口腔醫(yī)院頜面外科因正畸治療拔除的60 顆前磨牙。納入標準：（1）15～22 歲，平均（18.87±2.07）歲；（2）釉質(zhì)完整無缺損、色澤正常；（3）病人及監(jiān)護人知情同意。排除標準：（1）牙體形態(tài)顏色異常；（2）有釉質(zhì)脫礦、齲壞、氟斑牙、四環(huán)素牙、釉質(zhì)發(fā)育不全等。60顆離體牙用75%乙醇浸泡30min后，蒸餾水沖洗，用慢速手機沾拋光膏清潔并拋光牙冠表面，將清潔劑沖洗干凈，置于生理鹽水中備用。

1.5.2 試件制備60 顆離體牙隨機分成6 組，每組10 顆，選擇金屬前磨牙托槽。托槽粘接方法如下：氣槍吹干牙面，用35%磷酸酸蝕劑酸蝕冠部頰側(cè)30s，加壓沖洗30s，并用氣槍吹干牙面呈白堊色。每組離體牙均使用小毛刷將粘接劑預(yù)處理劑均勻涂布到酸蝕的釉質(zhì)表面，光固化10s，根據(jù)分組不同，分別將A～F 組相應(yīng)的粘合樹脂均勻涂布到金屬托槽的網(wǎng)底，將托槽置于頰面牙冠中央，輕壓托槽10s 保持粘接劑厚度均勻一致，用探針小心刮去托槽周圍多余的樹脂粘接劑，分別從托槽的近中、遠中、齦向及向用LED 光固化燈近距離各照射10s。托槽粘接完成的離體牙的根部包埋于高2cm，直徑1.5cm 的圓柱形自凝樹脂中，冠部完全暴露，自凝樹脂固化前調(diào)整包埋角度，使托槽的齦邊緣平行于地面。將60 個試件浸泡于生理鹽水中，置于37℃恒溫水浴箱中24h。

1.5.3 剪切強度測試（見圖1）實驗試件于37℃恒溫水浴浸泡24 h 后，固定于萬能試驗機夾具中，置于檢測臺上，調(diào)節(jié)夾具位置使加載力的方向垂直于托槽水平槽溝并平行于牙長軸，刃狀加載頭以0.5 mm/min 的速度由上到下進行剪切試驗，電腦記錄力值變化，托槽脫落后停止記錄，托槽脫落瞬間的加載力為最大載荷，正畸前磨牙金屬托槽網(wǎng)底面積約為9.84mm2，根據(jù)最大載荷和托槽底網(wǎng)面積計算剪切強度，計算公式如下[4]：剪切強度（MPa）=最大載荷（N）/托槽底網(wǎng)面積（mm2）。

1.5.4 粘接劑殘留指數(shù)（ARI）計分10 倍顯微鏡下觀察剪切強度測試后托槽脫落的離體牙釉質(zhì)表面樹脂粘接劑的殘留量，記錄ARI 計分。本實驗采用ARI 四級經(jīng)典計分法進行計分[5]。0 分：釉質(zhì)表面無樹脂粘接劑殘留；1分：釉質(zhì)表面殘留樹脂粘接劑的面積小于粘接總面積的50%；2分：釉質(zhì)表面殘留樹脂粘接劑的面積大于粘接總面積的50%；3分：釉質(zhì)表面樹脂粘接劑完全殘留。

圖1 剪切強度實驗示意圖

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS 20.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。菌液OD540值和剪切強度以表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗，按檢驗水準P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。ARI計分采用χ2檢驗，多組間比較采用Kruskal Wallis H 多組秩和檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑菌環(huán)實驗結(jié)果

經(jīng)48h 厭氧培養(yǎng)，A-F 組的實驗試件均未出現(xiàn)抑菌環(huán)（見圖2）。

圖2 抑菌環(huán)實驗前后對比圖

2.2 菌液OD540值測量結(jié)果

A～F 組菌液 OD540值統(tǒng)計結(jié)果顯示，A～E 組的菌液OD540值均低于F 組，說明實驗組粘接劑的抗菌性均強于對照組。隨氯化鑭比例增加，實驗組A～E組的菌液OD540值逐漸下降，E 組的菌液OD540值最小，抗菌性最強。實驗組A～E組的OD540值分別與對照組F 組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組與B 組、B 組與C 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；其余組兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（見表1，圖3）。

表1 A～F組菌液OD540平均值比較（）

表1 A～F組菌液OD540平均值比較（）

注：＊表示與A組相比，P＜0.05；#表示與B組，P＜0.05；△表示與C組，P＜0.05；□表示與D組，P＜0.05；◇表示與E組，P＜0.05。

n F P＜0.001images/BZ_94_1409_1241_1537_1302.pngimages/BZ_94_1280_1241_1409_1302.pngimages/BZ_94_1537_1241_1881_1302.pngimages/BZ_94_1409_1362_1537_1423.pngimages/BZ_94_1881_1241_2036_1302.png組別A組C組E組images/BZ_94_1881_1362_2036_1423.png22.040images/BZ_94_1280_1362_1409_1423.pngimages/BZ_94_1537_1362_1881_1423.pngimages/BZ_94_1280_1483_1409_1543.pngimages/BZ_94_1409_1483_1537_1543.png10 10 10images/BZ_94_1537_1483_1881_1543.pngOD值0.72±0.16 0.60±0.09*0.37±0.10*#△images/BZ_94_1881_1483_2036_1543.png

圖3 A～F組菌液OD540

1、2、3組菌液OD540值測量，統(tǒng)計結(jié)果顯示：未經(jīng)蒸餾水浸泡的RMGIC 組OD540小于5%氯化鑭組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明RMGIC 48h內(nèi)的抗菌性強于5%氯化鑭的正畸粘合樹脂；分別浸泡48h后的RMGIC 組OD540大于5%氯化鑭組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明浸泡48h 后5%氯化鑭正畸粘接劑的抗菌性強于RMGIC；浸泡1周后RMGIC 組OD540和5%氯化鑭組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明浸泡1 周后的兩種粘接劑的抗菌性基本消失。5%氯化鑭組和RMGIC 組隨著試件浸泡時間增加，菌液OD540均逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明隨著試件浸泡時間增加5%氯化鑭的正畸粘合樹脂和RMGIC抗菌性均逐漸下降，試件浸泡1周后抗菌性基本消失（見表2，圖4）。

表2 1、2、3組菌液OD540平均值比較()

表2 1、2、3組菌液OD540平均值比較()

注：＊表示與1組比較，P＜0.05；#表示與2組比較，P＜0.05。

3組(1周)1.02±0.20*#0.97±0.09*#0.779 0.446 nimages/BZ_95_255_576_482_640.png組別5%氯化鑭組images/BZ_95_482_576_570_640.png10images/BZ_95_570_576_782_640.pngimages/BZ_95_782_576_983_640.pngimages/BZ_95_255_703_482_767.pngt images/BZ_95_482_703_570_767.pngimages/BZ_95_570_703_782_767.png1組(0h)0.37±0.10 3.398images/BZ_95_782_703_983_767.png2組(48h)0.62±0.08*2.950

圖4 1、2、3組OD540比較

2.3 剪切強度測試結(jié)果

對照組F組剪切強度最高，E組最低，隨著粘合樹脂中氯化鑭的比例增加，剪接強度呈現(xiàn)下降趨勢，說明A～E組粘接強度逐漸降低。實驗組A～E組的剪切強度與對照組F 組比較，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明氯化鑭添加后使正畸粘接劑的粘接強度降低；A～E 組任意兩組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明當氯化鑭摻入比例在1%～5%時，其比例變化對剪切強度的影響不顯著，即當比例在5%之內(nèi)可以忽略氯化鑭摻入量對剪切強度的影響（見表3，圖5）。

表3 A～F組剪切強度平均值比較()

表3 A～F組剪切強度平均值比較()

注：＊表示與F組相比，P＜0.05。

n F P 3.2780.012images/BZ_95_254_2247_383_2308.pngimages/BZ_95_383_2247_489_2308.pngimages/BZ_95_489_2247_856_2308.pngimages/BZ_95_856_2247_1011_2308.pngimages/BZ_95_254_2368_383_2429.pngimages/BZ_95_383_2368_489_2429.pngimages/BZ_95_489_2368_856_2429.pngimages/BZ_95_856_2368_1011_2429.pngimages/BZ_95_254_2489_383_2549.png組別A組C組E組images/BZ_95_383_2489_489_2549.png10 10 10images/BZ_95_489_2489_856_2549.png剪切強度MPa 7.85±1.37*7.68±0.93*7.36±0.53*images/BZ_95_856_2489_1011_2549.png

圖5 A～F組剪切強度

2.4 粘接劑殘留指數(shù)（ARI）計分結(jié)果

A～F 組均在牙面看到樹脂殘留，殘留程度不一，以2 分居多（見圖6）。ARI 計分統(tǒng)計學(xué)分析表明：任意兩組間ARI 分值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表4）。

圖6 ARI四級計分圖

表4 A～F組ARI 計分比較 (單位：個)

3 討論

正畸過程中矯治器及附件等的戴入破壞口腔微生態(tài)平衡，促進致齲菌的增殖和代謝產(chǎn)酸，釉質(zhì)中的無機物溶解于酸，釉柱間形成大量微孔，導(dǎo)致釉質(zhì)折光系數(shù)改變，表面質(zhì)地粗糙，通透性改變呈形態(tài)不規(guī)則的白堊色斑[6]，即釉質(zhì)白斑損傷（white spot lesions，WSL）。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)佩戴固定矯治器的正畸病人口內(nèi)的致齲菌水平高于非正畸病人，是造成正畸病人牙釉質(zhì)脫礦和齲變進程加快的主要原因[7]。有研究表明，和變形鏈球菌相比，遠緣鏈球菌與齲病的活躍性和光滑面齲的發(fā)生更密切[8]。由于遠緣鏈球菌在光滑面齲中的重要致病作用，本研究選用遠緣鏈球菌作為實驗菌株，檢測氯化鑭的抗菌作用。鑭元素一方面通過結(jié)合并破壞細菌磷脂壁酸結(jié)構(gòu)，改變菌體胞膜的通透性，從而使細菌內(nèi)外離子交換發(fā)生變化，另一方面通過抑制糖酵解過程中菌體內(nèi)的激酶活性干擾細菌的生長和增殖[9]。在口腔生理條件下，氯化鑭可以在脫礦的釉質(zhì)表面沉積形成含鑭的羥基磷灰石，具有使牙體硬組織再礦化的潛力[10]，具有雙重抗齲的作用。

抑菌環(huán)試驗是抑菌劑溶解通過瓊脂擴散形成不同濃度梯度，根據(jù)抑菌環(huán)的大小判斷其有無抑菌性。經(jīng)48h 培養(yǎng)后A～F 組均沒有抑菌環(huán)，說明氯化鑭正畸粘合樹脂不是一種溶出性的抑菌物質(zhì)，不能通過溶解擴散產(chǎn)生抑菌作用，也可能是氯化鑭在固體培養(yǎng)基中溶解極少達不到抑菌效果。本實驗通過測量A～F 組菌液OD540值可以間接的反應(yīng)各組粘接劑的抗菌性能，OD540值越大，樣本的抗菌性越小。5%氯化鑭組的OD540值最小，對遠緣鏈球菌的抗菌性最強；浸泡1周后5%氯化鑭正畸粘合樹脂的抗菌性消失，可能是因為此粘接劑是將氯化鑭粉末直接與正畸粘合樹脂混合而成，樹脂固化后只有表面的氯化鑭可以起到抗菌作用，固化樹脂內(nèi)部大量的氯化鑭不能釋放產(chǎn)生抗菌性。

本實驗將不同比例的氯化鑭添加到牙釉質(zhì)粘合樹脂中，通過剪切強度測試分析氯化鑭摻入比例對牙釉質(zhì)粘合樹脂粘接強度的影響。有研究報道正畸粘接劑在粘接托槽24h后的剪切強度遠高于粘接固化后的即刻剪切強度[11]。所以本實驗在離體牙托槽粘結(jié)后于37 ℃恒溫生理鹽水中浸泡24h 后再測試剪切強度。實驗結(jié)果顯示對照組剪切強度的平均值高于實驗組，說明氯化鑭的添加使得牙釉質(zhì)粘合樹脂的粘接強度下降。劉秀菊等[12]經(jīng)實驗研究發(fā)現(xiàn)，將0.5%氧化鑭和1%納米二氧化硅添加到氧化鋯陶瓷中，可以在一定程度上有效提升陶瓷的機械強度。臧旖欣經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)添加了2%～3%氯化鑭的樹脂基托對白色念珠菌有較強抗菌性，且不影響樹脂基托的機械性能[13]。正畸粘接劑中添加氯化鑭后，粘接強度卻下降，可能是因為本實驗是在正畸牙釉質(zhì)粘接劑中直接添加氯化鑭，通過此類方法所得的粘接劑粘接完成后會有過多的游離單體殘留在粘接界面，破壞粘接樹脂的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和與酸蝕釉質(zhì)間的微機械鎖結(jié)，從而導(dǎo)致粘接強度降低[14]。如果將無機物氯化鑭和季銨抗菌單體結(jié)合后共同添加到樹脂基質(zhì)中，共價聚合后不僅可以增加粘接劑抗菌的持久性，還不會降低粘接劑的機械強度[15]。氯化鑭的摻入雖然會降低正畸粘接劑的粘接強度，但各實驗組剪切強度均大于7.0MPa，仍可滿足正畸臨床固定矯治所需的剪切強度7～9MPa[1]，因而可以考慮將氯化鑭作為抗菌活性物質(zhì)應(yīng)用到牙釉質(zhì)粘合樹脂中。

ARI評分是用來評估剪切實驗后牙釉質(zhì)粘合樹脂的斷裂方式，ARI 評分能夠量化釉質(zhì)表面上殘留的粘接劑。ARI計分低表示托槽脫落后釉質(zhì)表面殘留的粘接劑少，粘接劑的斷裂位置在粘接劑—牙釉質(zhì)界面，利于托槽脫落后的二次粘接或矯治完成后釉質(zhì)表面殘留粘接劑的清理，反之亦然。所以在剪切強度足夠的情況下低ARI 計分的粘接劑臨床使用更方便。本實驗ARI 評分結(jié)果顯示六組粘接劑的粘接劑殘留指數(shù)無明顯區(qū)別，即1%～5%的氯化鑭不會影響托槽脫落后牙面的ARI 計分，因此該材料斷裂時不會增加損傷牙釉質(zhì)的風(fēng)險。

綜上所述，添加5%氯化鑭的正畸粘接劑對致齲菌的抑制作用較強，可滿足正畸臨床固定矯治所需的粘接強度，且脫粘接后不會增加損傷牙釉質(zhì)的風(fēng)險，因此，本實驗為氯化鑭新型粘接劑用于托槽的粘接提供可能性。