煙草秸稈纖維素納米晶的制備及表征分析

孟冬玲，劉 彬，鄒 琳，薛 云，賈學(xué)偉，吳 彥**，許春平**

(1. 廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廣西 南寧 530001；2. 鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

纖維素是一種大分子多糖類物質(zhì)，是存在于自然界中的天然可再生物質(zhì)，且儲量豐富，廣泛存在于植物細胞壁中. 近年來對于纖維素的資源化利用，成為國內(nèi)外的研究熱點[1-3]. 木材是纖維素主要來源之一，但從木材、棉花等物質(zhì)中提取纖維素，成本較高. 我國是世界上煙草總種植面積最大的國家，每年有大量的煙草秸稈無法處理，且煙草秸稈成分復(fù)雜，還田處理會造成環(huán)境污染，因此對煙草秸稈的再利用成為煙草行業(yè)關(guān)注的焦點. 由于煙草的行業(yè)特殊性，使得煙草秸稈廢棄物更加集中，相較于其他作物秸稈煙草秸稈更易于集中利用. 煙草秸稈主要組成成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，宋麗麗等[4]研究發(fā)現(xiàn)煙草秸稈中纖維素含量比玉米秸稈、稻草秸稈和小麥秸稈更高，為38.39%，半纖維素含量更低，且生物轉(zhuǎn)化效率高，說明煙草秸稈中的纖維素具有高的利用價值，且煙草秸稈再利用的產(chǎn)物可應(yīng)用到煙草薄片的制備中，可使廢棄物循環(huán)利用，因此利用煙草秸稈中的生物質(zhì)資源意義更加重大.

納米纖維素是一種新型的高分子材料物質(zhì)，具有高純度、高比表面積、高結(jié)晶度、高彈性模量等特點，具有巨大的應(yīng)用價值. 納米纖維素（NC）是至少有一維空間尺寸達到納米范圍(1～100 nm)的纖維素[5]. 主要分為2種，一種是纖維素納米晶（CNC），為短棒狀結(jié)構(gòu)；另一種是纖維素納米纖絲（CNF），為纖維狀結(jié)構(gòu)，直徑達到納米級別，長度可達到微米級，長徑比更高.

制備納米纖維素的方法主要有化學(xué)法、物理法、生物法，以及兩兩結(jié)合的方法[6]，陳姍姍等[7]通過硫酸水解制備了蘋果渣納米纖維素，實現(xiàn)了對蘋果渣的高值化利用，趙艷嬌等[8]通過TEMPO氧化法制備出了水稻秸稈納米纖維素. 但是以煙草秸稈為原料制備納米纖維素的研究較少，因此對煙草秸稈納米纖維素進行制備與結(jié)構(gòu)表征具有重要意義.納米纖維素具有眾多優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊. 目前已被廣泛應(yīng)用到功能性材料中，包括食品包裝材料、納米復(fù)合材料等，進而應(yīng)用到生物醫(yī)藥、電子工業(yè)等領(lǐng)域中，還可作為添加劑或涂料，應(yīng)用到造紙領(lǐng)域中[9]，改善紙張結(jié)構(gòu)、挺度、緊度和透光性等. 張凱麗等[10]將制備的納米纖維素與納米銀線混合成膜，得到電學(xué)性能好，機械性能強的高透明納米紙，可作為導(dǎo)電材料應(yīng)用，制備紙基電容器；Kolakovic等[11]將藥物包裹在納米纖維素膜中，研究發(fā)現(xiàn)納米纖維素膜具有很好的包裹作用，且對藥物可以起到緩釋效果；Mahmoud等[12]將CNC/Au作為固定化酶進行催化反應(yīng), 研究發(fā)現(xiàn)CNC/Au表現(xiàn)出優(yōu)異的生物催化活性和穩(wěn)定性, 沒有出現(xiàn)明顯的活性損失.

本文以煙草秸稈為原料，采用超聲波輔助過硫酸銨氧化法制備煙草秸稈纖維素納米晶，并通過掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜分析儀、X射線衍射分析儀、同步熱分析儀和旋轉(zhuǎn)流變儀對其進行結(jié)構(gòu)表征和分析，納米纖維素由于具有獨特的流變學(xué)特性，一定濃度的納米纖維素懸浮液可成為膠體物質(zhì)應(yīng)用到食品中，可以為食品提供優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性. 因此，本文除進行常規(guī)的結(jié)構(gòu)表征以外，增添了對CNC懸浮液進行流變特性表征，對煙草秸稈納米纖維素進行了全面的表征，并將其添加到煙草薄片中進行感官評吸，研究其對煙草薄片感官品質(zhì)的影響，得到最優(yōu)添加量.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器煙草秸稈（河南中煙工業(yè)有限公司提供）. 無水乙醇（≥99.7%，天津市富宇精細化工有限公司），過硫酸銨（≥98.0%，鄭州派尼化學(xué)試劑廠），氫氧化鈉（≥96.0%，天津市大茂化學(xué)試劑廠），冰乙酸（≥99.5%，天津市富宇精細化工有限公司），亞氯酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）均為分析純.

高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；布氏漏斗；DGX-9143電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）；TGL-16M離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；超聲波細胞破碎儀（上海皓莊儀器有限公司）；PL203電子分析天平(感量0.000 1 g）；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）；MS-H280-Pro磁力攪拌器(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)；SCIENTZ-10N冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MD7044-5m普通透析袋(上海源葉生物科技有限公司)；JSM-7001FJSM-7001F場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本電子公司）；JEM2100透射電子顯微鏡；D8 Advance型X射線衍射儀（德國布魯克公司）；Vertex 70型傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）(德國布魯克公司)；STA449F3同步熱分析儀（德國耐馳儀器制造有限公司）；Discovery HR-1旋轉(zhuǎn)流變儀（美國TA儀器公司）.

1.2 方法

1.2.1 煙草秸稈纖維素制備 將曬干的煙草秸稈（TS）切成小塊，使用萬能粉碎機粉碎，過0.42 mm（60目）篩. 稱取一定量干燥的TS，加入去離子水在500 r/min，70 ℃條件下反應(yīng)2 h，除去其中的水溶性雜質(zhì)，將原料置于60 ℃烘箱中烘干，然后用無水乙醇抽提6 h，去除脂溶性物質(zhì)，將抽提后的TS烘干，配置質(zhì)量分數(shù)為10%的NaOH溶液，與TS混合（料液比為1∶30，g∶mL）在80 ℃，500 r/min條件下充分反應(yīng)2 h，主要去除其中的半纖維素，反應(yīng)后用去離子水洗滌去除堿液，得到樣品TS-a[7,13].加入質(zhì)量分數(shù)為3%的亞氯酸鈉溶液，使用冰乙酸調(diào)節(jié)pH為3～4左右，在75 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)，每隔1 h反應(yīng)1次，直至樣品變?yōu)榘咨テ渲械哪举|(zhì)素和殘余半纖維素，使用去離子水洗滌樣品至中性，得到純化的纖維素（TS-b）.

1.2.2 纖維素納米晶的制備[14-17]配置濃度為1.5 mol/L的過硫酸銨溶液待用，稱取一定量烘干的TS-b與過硫酸銨溶液以1∶100（g∶mL）的比例混合反應(yīng)，放置于磁力攪拌器上，調(diào)溫度為70 ℃，轉(zhuǎn)速為300 r/min，反應(yīng)16 h后加入蒸餾水終止反應(yīng). 放置一段時間待懸浮液分層，棄去上清液，用去離子水洗滌沉淀物質(zhì)，以11 000 r/min離心數(shù)次，再棄去上清液，將CNC懸浮液置于透析袋中，透析72 h，直到CNC懸浮液pH為中性. 對CNC懸浮液進行超聲處理，超聲條件為功率600 W，超聲3 s間隙3 s，超聲15 min，冷凍干燥得煙草秸稈纖維素納米晶（TS-CNC）.

1.3 性能表征

1.3.1 CNC懸浮液初始固含量測定 CNC懸浮液的流變學(xué)特性表征與CNC懸浮液的固含量(w，%)有關(guān). 稱取一定量的CNC懸浮液放入稱量過的干燥器中，在烘箱中烘干至恒重，取出后在室溫下冷卻，用分析天平稱量，通過公式（1）計算得出.

式中：m0為干燥器的質(zhì)量；m1為懸浮液與干燥器的質(zhì)量；m2為烘干后樣品與干燥器的質(zhì)量.

1.3.2 煙草秸稈CNC得率的計算 測量所得的CNC懸浮液的總體積，用量筒準確量取20 mL CNC懸浮液于已稱量過的干燥培養(yǎng)皿中，于烘箱中105 ℃烘干至恒重，取出后放入室溫冷卻30 min，然后在電子天平上稱重.

式中：m1為烘干后樣品與培養(yǎng)皿的質(zhì)量；m2為培養(yǎng)皿的質(zhì)量；m3為原料的質(zhì)量；V1為CNC懸濁液的總體積；V2為移液管吸取CNC懸濁液的體積.

1.3.3 微觀結(jié)構(gòu)表征 使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）觀察了TS-CNC的表面形貌特征，掃描前對樣品表面進行噴金處理，加速電壓為10 kV.

使用超聲波破碎儀將TS-CNC分散到去離子水中，得到質(zhì)量分數(shù)為0.005%的CNC懸浮液，滴到表面鍍碳涂層的銅網(wǎng)上，室溫下干燥后使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察其形貌結(jié)構(gòu)，估算CNC的直徑和長度.

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 用傅里葉變換紅外光譜儀記錄纖維的紅外光譜，將TS粉末、TS-CNC粉末和KBr進行真空干燥，樣品分別與KBr以1∶150的比例放入研缽中磨成粉，加壓制成透明薄片. 以吸光度為縱坐標，譜區(qū)范圍：4 000～400 cm-1為橫坐標記錄譜圖.

1.3.5 X射線衍射分析(XRD) 在室溫下使用X射線衍射儀測定TS、TS-b和TS-CNC的晶型及結(jié)晶度. 樣品研磨后過0.425 mm（40目）篩，放至掃描儀中，在階躍模式下以掃描范圍2θ為10°～60°，掃描速度為5°·min-1得到衍射圖譜.

利用公式(3)計算相對結(jié)晶度（CrI）：

式中：Iam為非晶區(qū)2θ=18°處衍射峰的強度，I(200)為2θ=22.5°處的衍射峰的強度[18]

1.3.6 熱重分析（TG-DTG） 利用熱重分析測定熱穩(wěn)定性（TG），并且對其進行微商熱重分析（DTG）. 稱取5 mg干燥的TS、TS-CNC固體粉末，放入同步熱分析儀中，持續(xù)通入30 min 流量為20 mL/min的氮氣，將樣品從28 ℃加熱至700 ℃，加熱速率為10 ℃ /min.

1.3.7 流變行為表征

（1）穩(wěn)態(tài)流變測試 采用旋轉(zhuǎn)流變儀(Discovery HR-1)對固體質(zhì)量分數(shù)為0.52%、0.62%、0.72%、1.76%和2.26%的CNC懸浮液進行穩(wěn)態(tài)流變測試，取1.5 mL的懸浮液，選用40 mm的夾具，剪切速率為10-1～103s-1，在25 ℃條件下進行測試.

（2）動態(tài)流變測試 動態(tài)測試分為動態(tài)應(yīng)變掃描和動態(tài)頻率掃描，動態(tài)應(yīng)變掃描條件為在頻率1 Hz下，動態(tài)應(yīng)變范圍為0.1%～100%；動態(tài)頻率掃描條件：掃描頻率范圍為0.1～100.0 rad·s-1，應(yīng)變?yōu)?.0%，測試溫度為25 ℃.

1.4 CNC添加量對煙草薄片感官品質(zhì)的影響將CNC按照不同的添加量添加到煙草薄片片基中，以39%的涂布率進行涂布，切絲后卷制成煙. 于溫度22 ℃、相對濕度65%條件下，平衡48 h后進行感官評吸.

2 結(jié)果與討論

超聲波法輔助過硫酸銨氧化法得到的煙草秸稈CNC懸浮液為均一的淡藍色溶液，當(dāng)CNC固含量較高時呈凝膠狀，冷凍干燥后得到的氣凝膠為白色的絮狀物，得到煙草秸稈CNC懸浮液的初始固體質(zhì)量分數(shù)為0.62%，產(chǎn)率為25.2%.

2.1 微觀結(jié)構(gòu)觀察通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察TS-CNC的形貌，得到圖1.圖1（a）、圖1（b）是將冷凍干燥得到的CNC氣凝膠粉碎制樣后，不同放大倍數(shù)下的固態(tài)樣品微觀結(jié)構(gòu)，從圖1中可以看出CNC直徑達到納米級別，但纖維之間粘連嚴重，可能是由于冷凍干燥前CNC懸浮液濃度較大，使CNC發(fā)生團聚現(xiàn)象. 透射電子顯微鏡可以觀察到液體狀態(tài)下的CNC形貌，由于在低濃度懸浮液中CNC更加分散，對纖維形貌觀察更為準確，可看出CNC為短棒狀結(jié)構(gòu)，直徑為10 nm左右，長度為50～60 nm.

圖1 CNC的微觀結(jié)構(gòu)表征圖Fig. 1 Microstructure characterization of CNC

2.2 傅里葉變換紅外光譜分析 (FTIR)將干燥后的KBr與實驗制備的原料TS、TS-b、TS-CNC干燥粉末混合均勻，研磨成粉后進行壓片處理，用傅里葉變換紅外光譜儀進行官能團結(jié)構(gòu)表征，得到圖2. 比較3條曲線可發(fā)現(xiàn)，在原料TS曲線中，1 733，1 512 cm-1和1 256 cm-1處有吸收峰，1 733 cm-1處的吸收峰是乙?；鶊F中C＝O的伸縮吸收振動峰，1 512 cm-1處的吸收峰歸屬于木質(zhì)素中苯環(huán)碳骨架伸縮振動吸收峰，1 256 cm-1處歸屬于半纖維素或木質(zhì)素中芳基芳醚類化合物中的C＝O伸縮振動[19]，在TS-b和TS-CNC的曲線中3個峰均未出現(xiàn)，說明木質(zhì)素和半纖維素被除去.

圖2 TS和TS-CNC的紅外光譜圖Fig. 2 Infrared spectra of TS and TS-CNC

在TS-b和TS-CNC曲線中3 410、2 902、1 630、1 430、1 163、1 110、1 060、898 cm-1處的共有吸收峰說明納米纖維素保留了纖維素的基本結(jié)構(gòu)[20-21]，分別歸屬于纖維素分子和分子內(nèi)、分子中羥基O―H的伸縮振動吸收峰，―CH2的C―H伸縮振動峰，纖維素中羥基吸附環(huán)境中水分產(chǎn)生的吸收峰，―CH2的彎曲振動峰，C―C骨架伸縮振動，纖維素分子環(huán)內(nèi)C―O伸縮振動，C―O伸縮振動和β-1，4糖苷鍵搖擺振動吸收峰. 其中在1 430、1 163、1 110、898 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是纖維素Iβ的特征吸收峰，說明過硫酸銨氧化并沒有改變纖維素的晶型，且制備得到的CNC為纖維素I型結(jié)構(gòu)[22]. 與TS-b曲線相比，TS-CNC曲線中在1 726 cm-1處出現(xiàn)新的弱吸收峰，該峰歸屬于羧酸基團的C＝O，表明在反應(yīng)過程中部分羥基被氧化為羧基，制備的納米纖維素為羧基型納米纖維素.

2.3 X射線衍射分析（XRD）通過XRD研究樣品的結(jié)晶度，得到樣品TS、TS-b、TS-CNC的XRD圖線，如圖3所示，計算得到TS、TS-b、TS-CNC的結(jié)晶度如表1中所示. 從圖3可以看出3種樣品都具有3個主要的衍射峰，18°和34.6°是2個低強度寬峰，22.5°是1個尖銳的高強度峰，3個峰分別對應(yīng)于纖維素Ⅰ中（110），（200）和（400）3個晶面的衍射峰[23-24]，說明化學(xué)反應(yīng)過程沒有改變纖維素的晶型，制得的煙草秸稈CNC仍然保持纖維素Ⅰ型結(jié)構(gòu).

圖3 TS、TS-b和TS-CNC的XRD分析圖Fig. 3 XRD analysis of TS, TS-b and TS-CNC

表1中的相對結(jié)晶度值可以定量評價纖維結(jié)構(gòu)中結(jié)晶纖維素和無定型區(qū)的數(shù)量[19]，相較于原料TS，TS-b、TS-CNC的相對結(jié)晶度分別提高了54.23%和41.53%，原料的結(jié)晶度最低，是由于纖維素結(jié)構(gòu)被無定形纖維素多糖物質(zhì)如半纖維素、木質(zhì)素、果膠等包圍，導(dǎo)致結(jié)晶區(qū)占比較低，經(jīng)過堿液處理及氧化漂白處理，去除其中的木質(zhì)素、半纖維素和果膠等雜質(zhì)后，纖維素的結(jié)晶區(qū)占比增加，相對結(jié)晶度提高. TS-CNC結(jié)晶度低于TS-b的原因是由于超聲處理時間過長，破壞了纖維素的結(jié)晶區(qū).

表1 不同處理階段的樣品相對結(jié)晶度Tab. 1 Crystallinity index (CrI) of TS at different stages of treatment

2.4 熱重分析通過同步熱分析儀對TS、TS-CNC進行熱重分析，得到熱重曲線（圖4）和微商熱重曲線（圖5）及主熱解特征參數(shù)（表2）. 從圖4和表2可以看出原料TS的初始降解溫度為204.94 ℃，經(jīng)過亞硫酸銨氧化處理及超聲波破碎后TS-CNC的初始降解溫度為201.47 ℃，相比原料，降低了1.7%，原因可能是纖維素納米晶的粒徑較小，比表面積大，聚合度低，裸露的活性基團較多，且不含熱穩(wěn)定性高的木質(zhì)素，使熱穩(wěn)定性下降[25].

圖4 TS和TS-CNC的TG曲線Fig. 4 TG curves of TS and TS-CNC

圖5 TS和TS-CNC的DTG曲線Fig. 5 DTG curves of TS and TS-CNC

從圖5的DTG曲線中可以看出，相較于TS，TS-CNC的主熱解峰向低溫區(qū)移動，熱穩(wěn)定性能弱于TS，在主熱解溫度范圍內(nèi)（200～400 ℃），主要是纖維素的β-1，4糖苷鍵和C＝O、C―C的斷裂，最終裂解為CO、CO2、H2O等氣體.

2.5 流變行為研究由于制備的CNC懸浮液濃度較低，因此通過使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，除去CNC懸浮液中的部分水分，得到較高固體質(zhì)量分數(shù)的CNC懸濁液，計算固體質(zhì)量分數(shù)含量分別為1.76%，2.26%.

表2 樣品的主熱解特征參數(shù)Tab. 2 main pyrolysis characteristic parameters of samples

2.5.1 穩(wěn)態(tài)剪切行為 CNC懸浮液剪切速率與黏度η的關(guān)系曲線如圖6所示，CNC懸浮液的表觀黏度隨剪切速率增大而逐漸減小，且固含量越高，η越高. 在測試范圍內(nèi)，CNC懸浮液固體質(zhì)量分數(shù)在達到1.76%時，懸浮液表現(xiàn)出明顯的剪切變稀行為，在固體質(zhì)量分數(shù)低于1.76%時，在高剪切速率下懸浮液表現(xiàn)出剪切變稀行為，這主要是由于剪切應(yīng)力使CNC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，導(dǎo)致黏度下降，出現(xiàn)剪切變稀行為.

圖6 不同固體質(zhì)量分數(shù)煙草秸稈CNC懸浮液的表觀黏度與剪切速率關(guān)系圖Fig. 6 The relationship between apparent viscosity and shear rate of tobacco straw CNC suspension with different solid content

2.5.2 動態(tài)流變行為 流變體系的線性黏彈區(qū)域通過動態(tài)應(yīng)變(γ)掃描確定，CNC懸浮液的儲能模量G′和損耗模量G″與動態(tài)應(yīng)變ε的關(guān)系曲線如圖7(a)和圖7(b)所示. 從圖7中可以看出，應(yīng)變增加到一定值，G′、G″開始下降，彈性下降明顯，這是由于在一定應(yīng)力作用下CNC結(jié)構(gòu)被破壞，CNC懸浮液的濃度越高，G′、G″開始下降所對應(yīng)的應(yīng)變越小.為保證體系處于線性黏彈區(qū)域，選擇應(yīng)變?yōu)?.0%.

不同固體質(zhì)量分數(shù)的CNC懸浮液的G′、G″與角頻率ω的關(guān)系曲線如圖8(a)和圖8(b)所示. 隨ω增加，G′和G″呈上升趨勢，在低角頻率時，曲線斜率隨CNC固體質(zhì)量分數(shù)的增加逐漸降低，當(dāng)固體質(zhì)量分數(shù)大于1.76%時，曲線斜率不再發(fā)生變化，表明體系在該固體質(zhì)量分數(shù)下已具有明顯的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出凝膠形態(tài)，達到凝膠形態(tài)的CNC膠體物質(zhì)可應(yīng)用到食品中，對食品起到保溫隔熱的效果.

圖7 不同固體質(zhì)量分數(shù)煙草秸稈CNC懸浮液的儲能模量G′與損耗模量G″與動態(tài)應(yīng)變的關(guān)系Fig. 7 Dependence of dynamic storage modulus G′ and loss modulus G″ on strain amplitude for different concentrations of tobacco straw CNC suspensions

2.6 CNC添加量對煙草薄片感官抽吸品質(zhì)的影響設(shè)置不同的CNC添加量0%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，0.8%（以煙草薄片固含量計）添加到煙草薄片片基中，以39%涂布率進行涂布，對得到的煙草薄片進行切絲處理，分別卷制成卷煙進行感官評吸[26-28]，結(jié)果見表3. 由表3可知，CNC添加量為0.6%的煙草薄片，感官評分最高為94.42分，可以在一定程度上改善卷煙的香氣，減輕卷煙的雜氣和刺激性，豐富卷煙煙氣.

表3 卷煙感官質(zhì)量評吸結(jié)果Tab. 3 Smoking results of sensory quality assessment of cigarette

3 結(jié)論

以煙草秸稈為原料，通過過硫酸銨氧化法及超聲處理成功制備了煙草秸稈纖維素納米晶，冷凍干燥后得到纖維素納米晶氣凝膠. 通過透射電鏡觀察其直徑達到10 nm左右，長度為50～60 nm；傅里葉紅外光譜分析表明，大部分半纖維素和木質(zhì)素已被除去；X射線衍射分析表明，純化纖維素及煙草秸稈纖維素納米晶仍保留纖維素Ⅰ型結(jié)構(gòu)，纖維素納米晶的結(jié)晶度略低于純化纖維素，可能是由于超聲處理時間過長導(dǎo)致；熱重分析表明纖維素納米晶的熱穩(wěn)定性相較于原料有所降低；流變行為表明纖維素納米晶固體質(zhì)量分數(shù)在達到1.76%時，表現(xiàn)出凝膠結(jié)構(gòu)和明顯的剪切變稀行為；將CNC按照不同添加量加入到煙草薄片片基中，添加量為0.6%（煙草薄片固含量計）時，感官評分最高，可以減輕卷煙的雜氣和刺激性，豐富卷煙的香味.