新型復(fù)合水凝膠AM/HAK 的制備及其對煙草生長發(fā)育的影響

杜甫，云菲，姬小明*，魏躍偉，劉國順，于兆錦，劉俊希，李紅霞

1 河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院/國家煙草栽培生理生化研究基地，鄭州 450002；2 吉安市煙草公司峽江分公司，吉安 331409

水凝膠是由親水性聚合物通過物理或化學交聯(lián)相互連接而形成的高分子三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[1]，它們能夠在水中迅速吸水溶脹并吸收成百倍于自身體積的水分而不被溶解[2-4]。由于水凝膠具有極高吸水性能，人們對水凝膠在不同領(lǐng)域的應(yīng)用進行了大量的研究，如組織工程材料、再生藥物和藥物釋放系統(tǒng)[5]。水凝膠具有較強的流變性，已在石油回收、涂料、藥物輸送、化妝品和個人護理上應(yīng)用[6-11]。一些水凝膠具有良好的抗菌活性以及極強的保水性和持水性，被作為保水劑廣泛應(yīng)用于食品保鮮[12]和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[13-17]。煙草作為一種特殊的經(jīng)濟作物，對水的需求量很高，煙草等作物的商用保水劑大多利用丙烯酸鹽等接枝形成的聚丙烯酸鹽高吸水樹脂[18-20]，這種聚合物由于空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)簡單，吸水保水力弱。目前，復(fù)合水凝膠因其具有相對復(fù)雜的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，相比簡單的商用保水劑具有更強的吸水性和保水性，可以反復(fù)吸水和緩釋水，循環(huán)利用率更高而成為研究熱點。羧甲基纖維素（CMC）是一種多糖基水溶性纖維素醚，因其無毒無害并具有良好的生物相容性、可降解性以及黏性而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學、食品工業(yè)、日化產(chǎn)業(yè)和農(nóng)業(yè)[21]。腐植酸鉀作為一種肥料廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，其在煙草上也有一定的應(yīng)用，匡崗等[22]研究表明，在一定用量的腐植酸鉀作用下，烤煙的常規(guī)化學成分得到改善，烤煙中性致香物質(zhì)含量也有效增加。朱經(jīng)偉等[23]研究表明，腐植酸鉀可以改善烤煙品質(zhì)。同時，腐植酸鉀本身具有一定的保濕性和保潤性，但是腐植酸鉀和丙烯酰胺復(fù)合水凝膠未見報道。為開發(fā)新型保水劑，本研究利用丙烯酰胺（AM）、羧甲基纖維素（CMC）和腐植酸鉀（HAK）合成AM/CMC和AM/HAK 兩種復(fù)合水凝膠，進行結(jié)構(gòu)表征，并探究兩種水凝膠對植煙土壤含水率及煙草生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

丙烯酰胺（AM），AR，鄭州派尼化學試劑廠；羧甲基纖維素鈉（CMC），聚合度800 ～1200，AR，國藥集團化學試劑有限公司；N, N’-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA），AR，天津市福晨化學試劑廠；過硫酸銨（APS），AR，鄭州派尼化學試劑廠；腐植酸鉀（過孔徑60 目篩）（HAK），河南惠農(nóng)土質(zhì)保育有限公司；市售“可信的”牌保水劑（聚丙烯酰胺），宜興市可信的化工有限公司；制備凝膠所用水均是去離子水。

1.2 復(fù)合水凝膠制備

1.2.1 復(fù)合水凝膠AM/CMC 的制備

精確稱取1.000 g CMC 置于100 mL 燒杯中，加入50 mL 去離子水，攪拌至CMC 完全溶解，再向燒杯中加入4.000 g AM、0.050 g APS 和0.025 g MBA，調(diào)節(jié)恒溫水浴磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為200 r·min-1，水浴溫度為60℃，反應(yīng)3 h，得復(fù)合水凝膠AM/CMC（圖1-(a)）。

1.2.2 復(fù)合水凝膠AM/HAK 的制備

精確稱取1.000 g HAK 置于100 mL 燒杯中，加入50 mL 去離子水并攪拌均勻，再向燒杯中加入4.000 g AM、0.050 g APS 和0.025 g MBA， 調(diào)節(jié)恒溫水浴磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為200 r·min-1，水浴溫度為60℃，反應(yīng)3 h，得復(fù)合水凝膠AM/HAK（圖1-(b)）。

將上述制備的水凝膠置于去離子水中吸水24 h達到溶脹狀態(tài)，然后置于60℃烘箱中烘干至恒重，用粉碎機粉碎后過60 目孔徑篩，用自封袋密封并置于真空干燥器中備用。

1.3 復(fù)合水凝膠的FT-IR 表征

將上述干燥后的復(fù)合水凝膠樣品與干燥后的溴化鉀混合后充分研磨制備KBr 壓片，然后采用美國Thermo 公司iS50 型傅里葉變換紅外光譜儀對樣品進行紅外光譜檢測，波長掃描范圍為4000～500 cm-1。

圖1 復(fù)合水凝膠AM/CMC 和復(fù)合水凝膠AM/HAKFig. 1 Composite hydrogel AM/CMC and composite hydrogel AM/HAK

1.4 復(fù)合水凝膠的SEM 表征

將冷凍干燥后的兩種水凝膠樣品的截斷面進行噴金處理，然后通過掃描電子顯微鏡（SIGMA-500，Zeiss，德國）測定其表面樣貌。

1.5 復(fù)合水凝膠吸水保水性能測試

1.5.1 吸水性能測試

利用平衡溶脹度來表征水凝膠的吸水性能。取適量的兩種干凝膠樣品稱重記為M0（g），放入加有100 mL 去離子水的燒杯中吸水48 h，待吸水飽和達到溶脹平衡后取出，用濾紙擦干水凝膠表面水分并稱重，記為Me（g），水凝膠的平衡溶脹度SR（g·g-1）用以下公式計算：

1.5.2 保水性能測試

取適量溶脹平衡后的水凝膠樣品，用濾紙擦干表面水分，置于玻璃表面皿上并放置于室溫下，每隔2 h稱重1 次，記錄水凝膠在12 h 內(nèi)的質(zhì)量變化，根據(jù)以下公式計算保水率：

式中，M0為干凝膠的質(zhì)量，g；Mt為t 時水凝膠失水后的質(zhì)量，g；Me為溶脹平衡后水凝膠的質(zhì)量，g。

1.6 煙草盆栽試驗

1.6.1 試驗設(shè)計

分別稱取3.000 g 干燥并過60 目篩的上述水凝膠樣品于直徑15 cm，高15 cm 的盆內(nèi)，按1000 : 1（土樣質(zhì)量：干凝膠質(zhì)量）的比例稱取3 kg 的土樣倒入盆內(nèi)并與水凝膠混合均勻?；旌暇鶆蚝竺颗杓?0 g生物炭，以改善土壤通透性，防止盆栽內(nèi)土壤板結(jié)。試驗用土為黃褐土，取自河南農(nóng)業(yè)大學許昌校區(qū)科教園區(qū)，基礎(chǔ)肥力為：pH 7.61， 有機質(zhì)19.09 g·kg-1，堿解氮74.70 mg·kg-1，速效磷8.70 mg·kg-1，速效鉀114.50 mg·kg-1，水溶性氯24.80 mg·kg-1。

供試材料為烤煙品種K326，共設(shè)置3 個處理：B1，添加3.000 g 復(fù)合水凝膠AM/CMC；B2，添加3.000 g 復(fù)合水凝膠AM/HAK；空白對照CK，不添加任何水凝膠。每處理選取5 株生長一致的煙苗，重復(fù)3 次。煙苗的移栽時間為9 月16 日，地點為河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院國家煙草栽培生理生化研究基地氣候室，所有盆栽均置于光照培養(yǎng)架上，光照強度200 μmol·m-2·s-1，每天光照12 h，平均室溫25℃，相對濕度50%，煙株每隔10 天澆1 次水，每處理澆水量保持一致。煙草用肥為甕福紫金化工股份有限公司生產(chǎn)液體水溶肥，m（N）: m（P2O5）: m（K2O）= 200 : 200 : 200，各處理氮用量為30 kg·hm-2。

1.6.2 測定指標

土壤含水率：采用烘干稱重法[24]測定土壤含水率。

農(nóng)藝性狀：采用煙草行業(yè)標準YC/T 142—1998方法[25]測定移栽后60 d 煙株農(nóng)藝性狀。

SPAD 值：采用日本柯尼卡美能達公司SPAD-502 型便攜式葉綠素儀測定中部葉位第9 片煙葉（由下往上數(shù)）的SPAD 值。

煙株干物質(zhì)積累：采用文獻[26]方法測定煙株的干物質(zhì)積累量。

煙葉氮代謝酶谷氨酰胺合成酶GS 和谷氨酸脫氫酶GDH 活性：采用方法[27]測定GS 活性，采用方法[28]測定GDH 活性。

殺青煙葉化學成分：取中部葉位（9～12 片）鮮煙葉置于烘箱中于105℃殺青15 min，然后60℃烘干至恒重，磨碎并過60 目篩，采用德國布朗盧比公司生產(chǎn)AA3 型連續(xù)流動分析儀測定煙葉總糖、還原糖、煙堿、鉀和氯?？偺呛瓦€原糖采用煙草行業(yè)標準YC/T 159—2002《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續(xù)流動法》測定；煙堿采用YC/T 489—2013《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動法》測定；氯采用YC/T 162—2011《煙草及煙草制品 氯的測定 連續(xù)流動法》測定，鉀采用YC/T 217—2007《煙草及煙草制品 鉀的測定 連續(xù)流動法》測定。

根系活力：采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[29]測定煙株的根系活力。

上述測定指標的樣品取樣時間均為煙株移栽后60 d。

圖2 AM（a）、CMC（b）、HAK（c）、AM/CMC（d）和AM/HAK（e）的FT-IR 圖譜Fig. 2 FT-IR of AM(a), CMC(b), HAK(c), AM/CMC(d) and AM/HAK(e)

1.7 數(shù)據(jù)分析

運用Microsoft Excel 2010 和origin 8.5 軟件進行繪圖，DPS 7.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，多重比較采用Duncan 新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 FT-IR 分析

如圖2 所示，在圖譜d 中，1667 cm-1的峰對應(yīng)于丙烯酰胺C=O 鍵伸縮振動，1608 cm-1的峰對應(yīng)于酰胺基N-H 變形振動，2925 cm-1的峰對應(yīng)于-CH的反對稱伸縮振動，3443 cm-1的峰對應(yīng)于纖維素環(huán)上-OH 伸縮振動，1120 cm-1處表示C-O 的伸縮振動[30]。圖譜e 中1665 cm-1的峰對應(yīng)于丙烯酰胺C=O鍵伸縮振動，1608 cm-1的峰對應(yīng)于酰胺基N-H 的變形振動，2928 cm-1的峰對應(yīng)于-CH 的振動峰，3401 cm-1附近有一強寬吸收峰可歸屬為HAK 分子間締合及分子內(nèi)螯合羥基[31]，1120 cm-1的峰對應(yīng)于C-O 的伸縮振動[32-33]，從上述結(jié)果證實了復(fù)合水凝膠AM/CMC 和AM/HAK 的合成。

2.2 SEM 分析

從圖3-(a)和3-(b)可以看出，復(fù)合水凝膠AM/CMC 和AM/HAK 內(nèi)部均擁有致密的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)果證明了水凝膠的形成。這些網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中包含豐富的孔洞，這些孔洞結(jié)構(gòu)有利于水分子的嵌入。AM/HAK 的結(jié)構(gòu)比AM/CMC 更復(fù)雜，孔洞密度更大，表明AM/HAK 的潛在吸水性要優(yōu)于AM/CMC。

2.3 復(fù)合水凝膠吸水性能測試

從表1 可以看出，等質(zhì)量的兩種干凝膠吸水達到平衡溶脹后，復(fù)合水凝膠AM/CMC 和復(fù)合水凝膠AM/HAK 的平衡溶脹度分別為26.52 g·g-1和31.43 g·g-1，分別比市售保水劑“可信的”高出7.17 g·g-1和12.08 g·g-1，且復(fù)合水凝膠AM/HAK 比復(fù)合水凝膠AM/CMC的平衡溶脹度高出4.91 g·g-1。超高的吸水性能使得這兩種復(fù)合水凝膠在植物抗旱方面具有潛在的應(yīng)用價值。

圖3 AM/CMC(a)和 AM/HAK(b)的SEM 圖Fig. 3 SEM of AM/CMC(a) and AM/HAK(b)

表1 不同水凝膠的平衡溶脹度Tab. 1 Equilibrium swelling degree of different hydrogels

2.4 復(fù)合水凝膠保水性能測試

圖4 不同水凝膠在室溫下的保水率Fig. 4 Water retention rate of different hydrogels at room temperature

保水率可以用來評價一種水凝膠的保水能力。如圖4 所示，在室溫下放置12 h 后水凝膠AM/HAK 的保水率約為80%，高出水凝膠AM/CMC 10%左右，可見復(fù)合水凝膠AM/HAK 具有較強的保水能力。從兩種水凝膠的保水率隨時間變化的曲線走勢可以看出，兩種水凝膠在室溫下逐漸失水，在0～10 h 這段時間內(nèi)，兩種水凝膠的保水率基本成線性變化，且保水率與時間呈負相關(guān)。從直線的斜率可以看出，水凝膠AM/HAK 失水速率要小于水凝膠AM/CMC，因此可認為，水凝膠AM/HAK 比水凝膠AM/CMC 更難失水。在10 h 后，兩種水凝膠的失水速率相對于10 h前變慢，這種變化可能是因為水凝膠表層凝膠在失水變干之后對內(nèi)部水分具有一定的“鎖水”效果，增加了水凝膠的保水性。

2.5 不同水凝膠對植煙土壤含水率的影響

從表2 可以看出，在煙株移栽后60 d，添加水凝膠的處理B1 和B2 盆栽土壤含水率均顯著高于對照CK（P＜0.05），B1 和B2 處理的含水率分別比CK高出2.40 和3.65 百分點，B2 處理土壤含水率較高?？梢?，復(fù)合水凝膠不僅有保水效果，而且還可以提高植煙土壤的含水率。

表2 不同處理植煙土壤的含水率Tab. 2 Moisture content of tobacco growing soil under different treatments

2.6 不同水凝膠對煙草農(nóng)藝性狀的影響

圖5 為移栽后60 d 不同處理煙株的照片，從圖中可以看出三個處理之間差異較明顯。從表3 可以看出，處理B1 和B2 煙草的株高、莖圍、節(jié)距、有效葉片數(shù)、最大葉長和最大葉寬均顯著高于CK（P＜0.05），B1 和B2 處理間差異不顯著（P＞0.05）。表明兩種水凝膠的加入可明顯改善煙草的農(nóng)藝性狀，促進煙草生長發(fā)育。

表3 不同處理煙草的農(nóng)藝性狀Tab. 3 Agronomic characters of tobacco under different treatments

圖5 不同處理煙草的生長發(fā)育Fig. 5 Growth and development of tobacco under different treatments

2.7 不同水凝膠對煙草SPAD 值的影響

表4 顯 示，處 理B1 和B2 煙 草 的SPAD 值 均高于CK，三個處理均具有顯著差異。B2 處理煙草SPAD 最 高， 高 出CK 3.67 mg·g-1， 占CK 的10.22%，說明復(fù)合水凝膠AM/HAK 可以顯著提高煙草的SPAD 值。

表4 不同處理煙草的SPAD 值Tab. 4 SPAD values of tobacco under different treatments

2.8 不同水凝膠對煙草生物量的影響

表5 顯示，移栽后60 d，CK、B1 和B2 處理之間煙草地上部鮮質(zhì)量差異顯著（P＜0.05），處理B1和B2 煙草地上部株鮮質(zhì)量分別比CK 提高8.21 g/株和19.03 g/株，地上部干質(zhì)量分別提高1.30 g/株和2.93 g/株，占CK 的23.30%和52.51%。B1 和B2 根、莖、葉干質(zhì)量相比CK 均有所提高，結(jié)果表明，添加復(fù)合水凝膠AM/CMC 和AM/HAK 可以明顯提高煙草的生物量。

表5 不同處理煙草的生物量Tab. 5 Tobacco biomass under different treatments

2.9 不同水凝膠對煙草氮代謝酶GS 和GDH 活性的影響

圖6 不同處理煙草GS 酶和GDH 酶活性Fig. 6 Activities of GS enzyme and GDH enzyme of tobacco under different treatments

從圖6-(a)和6-(b)可以看出，與CK 相比，處理B1 和B2 煙草谷氨酰胺合成酶GS 活性均顯著增加（P＜0.05），分別增加1.81 μmol·(g·h)-1和2.12 μmol·(g·h)-1，分別比CK 提高了38.68%和45.30%。B1、B2 和CK 三處理間煙草谷氨酸脫氫酶GDH 活性具有顯著差異（P＜0.05），其中活性最高的是B2 為89.48 U·g-1，其次是B1 為65.81 U·g-1，活性最低的是CK為49.03 U·g-1。B1 和B2 比CK 分別提高了16.78 U·g-1和40.45 U·g-1，占CK 的34.22%和82.50%。復(fù)合水凝膠的添加使煙草谷氨酰胺合成酶GS 和谷氨酸脫氫酶GDH 的活性明顯增加，說明復(fù)合水凝膠可以促進煙草氮代謝，有利于增加煙草氮代謝效率[34]。

2.10 不同水凝膠對殺青煙葉化學成分的影響

表6 不同處理殺青煙葉化學成分Tab. 6 Chemical constituents of flue-cured tobacco leaves treated with different treatments

2.11 不同水凝膠對煙草根系活力的影響

如圖7 所示，三處理煙草根系生長發(fā)育具有明顯的差異，施加復(fù)合水凝膠處理根系發(fā)育旺盛，更有利于肥料和水分的吸收和利用。從圖8 可以看出，煙草根系活力最大的是B2，最小的是CK。三處理之間煙草根系活力差異較為顯著（P＜0.05），B1 和B2 分別比CK 提高 31.76%和63.98%，說明添加復(fù)合水凝膠可使煙草根系活力明顯提高，提高效果最好的是B2處理，即添加復(fù)合水凝膠AM/HAK 處理。

3 討論

目前，水凝膠作為保水劑是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一大研究熱點，新型的水凝膠具有很好的應(yīng)用前景。本試驗合成了兩種復(fù)合水凝膠，并通過傅里葉變換紅外光譜法證明了水凝膠的合成，SEM 掃描電鏡表明水凝膠具有豐富網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過吸水和保水測試確定了復(fù)合水凝膠具有良好的保水性能，通過盆栽試驗探究了水凝膠對土壤含水率和煙草生長發(fā)育的影響。煙草對水分的需求量很高，水分供應(yīng)不僅影響煙株生長發(fā)育，而且還影響煙株對肥料的吸收、氮代謝向碳代謝的轉(zhuǎn)化、煙葉的糖堿協(xié)調(diào)關(guān)系以及葉片厚度與組織結(jié)構(gòu)等[34]。因此，土壤含水率直接影響煙草正常生長發(fā)育。本試驗中添加復(fù)合水凝膠AM/CMC 和AM/HAK 使土壤含水率明顯提高，有利于煙草生長，這與王玉萍等人[35]的研究結(jié)果一致。

圖7 不同處理煙草根系差異對比Fig. 7 Comparison of root system of tobacco under different treatments

圖8 不同處理煙草的根系活力Fig. 8 Root activity of tobacco under different treatments

本研究制備的復(fù)合水凝膠使煙草的株高、莖圍、節(jié)距、有效葉片數(shù)、最大葉長和最大葉寬均顯著增加，使煙草的農(nóng)藝性狀得到改善，這與陳芳泉等人[36]的研究結(jié)果相吻合。在煙草中，葉綠素參與的光合作用貢獻了96%的干物質(zhì)積累[37]，因此，葉綠素高低直接關(guān)系到煙葉品質(zhì)的高低，SPAD 值可用來表示葉綠素含量的高低[38]，煙葉葉綠素含量與SPAD 之間存在呈極顯著線性關(guān)系[39-40]。本試驗中，添加復(fù)合水凝膠AM/CMC 和復(fù)合水凝膠AM/HAK，煙草的SPAD值明顯提高。B1 和B2 處理煙草的地上部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均高于對照CK，表明復(fù)合水凝膠可以增加煙草的生物量，這與鄒超煜等[41]的研究結(jié)果吻合，復(fù)合水凝膠AM/HAK 對煙草地上部和地下部的生長發(fā)育是最有利的。由文獻[42]可知，植物水分利用效率=總生物量/總耗水量，本試驗中，在澆水量一致的條件下，添加復(fù)合水凝膠的處理使煙草的生物量明顯提高，表明復(fù)合水凝膠可以提高煙草的水分利用效率，這與鄒超煜等[41]人得出保水劑可以提高不同作物水分利用效率的結(jié)果一致。GS 是高等植物氮代謝中十分重要的酶，它與谷氨酸合成酶（GOCAT）構(gòu)成的谷氨酸合成酶循環(huán)是銨同化為氨基酸（氨同化）的主要途徑[43]，GS 活性提高可增強氮代謝效率。GDH是碳氮代謝轉(zhuǎn)化過程中一個關(guān)鍵性酶，參與碳氮平衡調(diào)節(jié)，它為三羧酸循環(huán)提供充足的碳骨架[44]。B1 和B2 處理煙草的GS 和GDH 活性均明顯提高，說明煙草氮代謝比較旺盛，氮代謝向碳代謝過程轉(zhuǎn)化的效率也大大提高[44]，更有利于煙草生長發(fā)育。與對照相比，添加復(fù)合水凝膠，殺青煙葉的總糖和還原糖含量提高，煙葉鉀含量也提高，與杜社妮等人[45]的研究結(jié)果一致，B2 處理煙葉的鉀氯比最接近優(yōu)質(zhì)煙葉水平[29]，煙葉的化學成分更趨向于協(xié)調(diào)。根系活力主要反映根系生命活動的旺盛程度和吸收、合成等功能的強弱程度[46]，復(fù)合水凝膠AM/CMC 和AM/HAK 使煙草的根系活力分別提高31.76%和63.98%，煙草根系生命活動旺盛程度大大提高，煙草可以吸收更多的養(yǎng)分，促進自身發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究合成了兩種復(fù)合水凝膠AM/CMC 和AM/HAK，其中AM/HAK 為合成的新型復(fù)合水凝膠，兩種水凝膠均未見有報道應(yīng)用于煙草，通過盆栽試驗研究了水凝膠對煙草生長發(fā)育的影響，結(jié)果表明，兩種復(fù)合水凝膠均可以促進煙草生長發(fā)育，改善煙草的品質(zhì)。其中，效果最好的是復(fù)合水凝膠AM/HAK，該水凝膠原料成本較低，合成條件簡單，保水性強，可為煙草栽培特別是干旱地區(qū)煙葉種植提供參考，同時，作為一種新型保水劑在其他作物上也具有廣泛的應(yīng)用前景。