LC-MS/MS 法測(cè)定口含煙中的4 種亞硝基氨基酸

王冰，余晶晶，蔡君蘭，王昇，劉克建，趙曉東，劉紹鋒，秦亞瓊，謝復(fù)煒，王曉瑜

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)封區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

口含煙是一種重要的新型煙草制品，不產(chǎn)生煙氣，又能滿(mǎn)足尼古丁攝入的需求。隨著全球控?zé)熜蝿?shì)的日趨嚴(yán)峻，口含煙因其獨(dú)特的使用方式逐漸成為煙草消費(fèi)的重要補(bǔ)充形式以及國(guó)際煙草領(lǐng)域的重要發(fā)展趨勢(shì)[1-4]。目前市場(chǎng)上的口含煙主要有3 類(lèi)產(chǎn)品形式，分別為濕含煙（美式濕含煙Moist snuff /瑞典含煙Snus）、含化型制品、膠基型制品；其核心成分仍然是煙草（包括煙絲、煙草碎片、煙草顆粒及煙末等）或煙草關(guān)鍵成分（如煙堿、煙草香味物質(zhì)等）提取物[5-6]。

在煙草加工過(guò)程和卷煙燃燒過(guò)程中共有4 種類(lèi)型的亞硝胺生成，它們包括：揮發(fā)性亞硝胺（VANs）、煙草特有亞硝胺（TSNAs）、非揮發(fā)性亞硝胺和N-亞硝基氨基酸[7]。目前國(guó)內(nèi)外展開(kāi)了大量關(guān)于TSNAs測(cè)定及形成機(jī)理的研究[8-9]，揮發(fā)性亞硝胺方面也有文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，但在國(guó)內(nèi)尚未有煙草中亞硝基氨基酸方面的研究。

亞硝基氨基酸是由煙草中的氨基酸以及帶有仲氨基的蛋白質(zhì)發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成的。截止目前，口含煙中共有11 種N-亞硝基氨基酸被測(cè)定出來(lái)，而其中4 種N-亞硝基肌氨酸（N-Nitrososarcosine，NSAR）、3-（N- 甲基亞硝基氨基） 丙酸（3-(N-methylnitrosamino) propionic acid ，MNPA）、4-（N-甲基亞硝基氨基）丁酸（4-(N-methylnitrosamino) butyric acid，MNBA）、亞硝基氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸（Nitrosoazetidine-4-carboxylic acid ，NAzCA）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被確認(rèn)為致癌物，可誘發(fā)小鼠肝癌、肺癌、膀胱癌、食道癌，被IARC 列入無(wú)煙氣煙草制品28 種有害物質(zhì)名單之中[12-13]。國(guó)外對(duì)口含煙中N-亞硝基氨基酸的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在1985 年到1999 年[14-21]，主要采用重氮甲烷衍生-氣相色譜-TEA 方法對(duì)口含煙中N-亞硝基氨基酸含量及隨存貯條件的變化進(jìn)行了研究；重氮甲烷具有毒性、容易爆炸，且操作過(guò)程極為繁瑣。1989 年，James 等研制了液相色譜與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器的接口[22]；1999 年，Cheng 等嘗試使用離子對(duì)試劑高效液相色質(zhì)譜檢測(cè)NSAR、NPRO、NTCA 及NMTCA 四種亞硝基氨基酸[23]，從而為煙草中亞硝基氨基酸的分析提供了新的思路。

本文針對(duì)口含煙中重點(diǎn)關(guān)注的NSAR、MNPA、MNBA 及NAzCA，通過(guò)對(duì)前處理?xiàng)l件和儀器方法的優(yōu)化，建立了一種簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確的LC-MS-MS 分析方法。為了減少亞硝基氨基酸對(duì)口含煙吸食者健康可能造成的傷害，控制它們?cè)诳诤瑹熤械暮刻峁┝思夹g(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

14 種市售口含煙樣品。樣品信息如表1 所示。

表1 14 種市售口含煙樣品信息Tab.1 Informations of 14 kinds of commercially available oral tobacco samples

標(biāo)準(zhǔn)品：N-亞硝基肌氨酸（N-Nitrososarcosine，NSAR）、3-（N- 甲基亞硝基氨基） 丙酸（3-(N-methylnitrosamino) propionic acid，MNPA）、4-（N- 甲基亞硝基氨基） 丁酸（4-(N-methylnitrosamino) butyric acid，MNBA）、亞硝基氮雜環(huán)丁烷-2- 羧酸（Nitrosoazetidine-2-carboxylic acid，NAzCA）；N- 亞硝基肌氨酸-d3（N-Nitrososarcosine，NSAR- d3）、3-（N- 甲 基亞硝基氨基） 丙 酸-d3（3-(N-methylnitrosamino) propionic acid，MNPA-d3）、4-（N- 甲基亞硝基氨 基） 丁 酸-d3（4-(N-methylnitrosamino) butyric acid，MNBA-d3）、亞硝基氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸-d5（Nitrosoazetidine-4-carboxylic acid，NAzCA-d5）（純度≥98%，上海安譜公司）。

試劑：乙腈（色譜純，美國(guó)Dikma 公司）；乙酸（色譜純，美國(guó)Tedia 公司）；乙酸乙酯（色譜純，美國(guó)Dikma 公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)Tedia 公司）。

凈化柱：BIOTAGE isolute SLE（5mL）。

儀器：API55000 質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX 公司）；Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）； Milli-Q50 超純水儀（美國(guó)MILLIPORE 公司）；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP2245 電子天平（感量：0.0001 g，德國(guó)Sartorius 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI）。

1.2 樣品前處理

對(duì)于膠基型口含煙，先稱(chēng)取1 g 樣本，加入1 mL正己烷分散樣本；對(duì)于美式濕含煙、瑞典含煙含化型制品，直接稱(chēng)取1 g 或1 袋于50 mL 萃取離心管中。加入10 mL 含有內(nèi)標(biāo)的去離子水，于2500 rpm 下，渦旋30 min，取萃取液5 mL，加于ISOLUTE 硅藻土固相支撐液液萃取柱（BIOTAGE isolute SLE），用30 mL 乙酸乙酯（含2%乙酸）分三次洗脫，每次10 mL，收集洗脫液，45℃下濃縮至干，用0.5 mL 去離子水復(fù)溶、混勻?；靹蚝筮M(jìn)LC-MS/MS 分析。分析條件見(jiàn)表2。

色譜柱：Waters Atlantis? T3 分析柱（150 mm ×2.1 mm，3.0 μm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A：0.1%（v/v）甲酸水溶液，B：乙腈溶液，流速0.25 mL/min，梯度洗脫條件見(jiàn)表2；分析時(shí)間：5 min；進(jìn)樣體積：5 μL。離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓：-4500 V；氣簾氣壓力：30 psi；輔助氣1 壓力：60 psi；輔助氣2 壓力：60 psi；離子源溫度：500 ℃；各化合物的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、駐留時(shí)間、碰撞能量（CE）及去簇電壓（DP）參見(jiàn)表3。

表3 亞硝基氨基酸質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Tab. 3 Determination parameters of N-nitrosamino acids by mass spectrometry

2 結(jié)果

四種亞硝基氨基酸的結(jié)構(gòu)式如圖1 所示，可知亞硝基氨基酸中，氨基上的氮原子分別形成N-C、N-N共價(jià)鍵，常規(guī)分析氨基酸的氨基所發(fā)生的衍生反應(yīng)，亞硝基氨基酸很難發(fā)生，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇直接分析亞硝基氨基酸原型。

圖1 4 種亞硝基氨基酸結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formulas of four N-nitrosamino acids

2.1 色譜柱的選擇

4 種亞硝基氨基酸目標(biāo)物均為水溶性極性小分子，實(shí)驗(yàn)中首先考慮了親水作用色譜柱Agilent HILIC Plus（100 mm×2.1mm，3.5 μm）的分離效果，發(fā)現(xiàn)HILIC 柱子并不能很好的保留四種亞硝基氨基酸。四種亞硝基氨基酸的保留時(shí)間均在1.5min左右。

為達(dá)到好的分離效果，選取五種高比例水相耐受柱Agilent ZORBAX SB-AQ （100 mm × 2.1 mm，3.5 μm），Agilent ZORBAX BONUS-RP （100 mm × 2.1 mm, 1.8 μm），Agilent Proshell 120 EC-C8（100 mm × 3.0 mm，2.7 μm），Waters Atlantis ? T3（150 mm × 2.1 mm，3 μm），Thermo Accucore PFP（150 mm × 2.1 mm，2.6 μm）進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。4 種目標(biāo)物在5 種分析柱上的分離效果如圖2 所示。在PFP 和SB-AQ 柱上保留比較差，出峰均在2 min 前；BONUS-RP 柱子對(duì)NSAR、NAzCA 保留效果好，但NSAR 出雙峰，NAzCA 的靈敏度差，響應(yīng)較低，而對(duì)MNPA、MNBA 保留效果差；EC-C8 與T3 柱子對(duì)4 種目標(biāo)物的保留效果相似，出峰均在2 min以后，考慮到T3 柱子可以耐受100%水相，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相可以進(jìn)一步調(diào)高目標(biāo)物在色譜上的分離度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性會(huì)更好，因此選T3 柱子為最終實(shí)驗(yàn)用色譜柱。

2.2 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的確定

為了得到最好的峰型和響應(yīng)值，對(duì)流動(dòng)相和洗脫梯度條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用乙腈為流動(dòng)相B，分別采用0.1%甲酸水溶液，5 mmol/L 甲酸銨水溶液、1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A 進(jìn)行試驗(yàn)。

研究結(jié)果表明，流動(dòng)相A 中加入一定比例的甲酸銨有助于亞硝基氨基酸化合物的離子化，質(zhì)譜響應(yīng)高，但出峰時(shí)間快，4 種化合物保留時(shí)間短，影響口含煙樣品中4 種目標(biāo)化合物的測(cè)定。流動(dòng)相A 中加入一定比例的甲酸，亞硝基氨基酸的響應(yīng)較加入甲酸銨時(shí)低，但并不影響樣品中目標(biāo)物的定量，而且加入一定比例的甲酸能顯著提高目標(biāo)物在色譜柱上的保留，使樣品中4 種目標(biāo)化合物得到有效分離, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)甲酸比例由0.1 %增加至1 %時(shí)，保留時(shí)間沒(méi)有顯著延長(zhǎng)，質(zhì)譜響應(yīng)稍降低；因此選用0.1%的甲酸水溶液為流動(dòng)相A。

圖2 4 種亞硝基氨基酸在5 種色譜柱上的保留Fig.2 Retention of four N-nitrosamino acids on five chromatographic columns

圖3 流動(dòng)相中添加甲酸銨和甲酸對(duì)4 種亞硝基氨基酸保留的影響Fig.3 Effects of ammonium formate and formic acid on retention of four N-nitrosamino acids in mobile phase

2.2.2 流動(dòng)相梯度條件優(yōu)化結(jié)果

采用口含煙實(shí)際樣品對(duì)流動(dòng)相梯度條件進(jìn)行優(yōu)化，最終條件如表2 所示。在實(shí)驗(yàn)條件下，標(biāo)樣、及樣品中目標(biāo)化合物均得到基線(xiàn)分離，峰形良好，分離色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 標(biāo)樣(A)及樣品(B)中四種亞硝基氨基酸色譜質(zhì)譜圖Fig.4 Chromatogram mass spectrometry of four N-nitrosamino acids in standard sample(A) and tobacco sample(B)

2.3 質(zhì)譜條件的確定

在正離子模式、負(fù)離子模式下以流動(dòng)注射的方式對(duì)各分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg/mL）進(jìn)行全掃描，結(jié)果表明：目標(biāo)物在負(fù)離子模式下響應(yīng)遠(yuǎn)高于正離子模式下響應(yīng)。因此選擇負(fù)離子模式對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分析，確定了各分析物的母離子（[M-H]-），然后分別以[M-H]-選擇各分析物的子離子（碎片），每個(gè)分析物先選擇2 個(gè)碎片，再?gòu)闹羞x取信號(hào)較強(qiáng)、又無(wú)互相干擾的碎片定性和定量。優(yōu)化后的MRM 條件及碰撞能和去簇電壓見(jiàn)1.2 中表3 所示。

2.4 萃取溶劑、萃取方式及時(shí)間的優(yōu)化

參考已有文獻(xiàn)所用提取溶劑，對(duì)純水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯提取口含煙樣品中亞硝基氨基酸的效果進(jìn)行考察。水溶液與甲醇的萃取效率高，且萃取效率相當(dāng)；乙酸乙酯萃取效率最低。比較了渦旋、超聲及振蕩三種方式的萃取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，渦旋、超聲兩種萃取方式的萃取效率基本相當(dāng)，均比振蕩方式萃取效率高10%以上。對(duì)萃取時(shí)間從5 min 到60 min 進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，30 min 以后，4 種亞硝基氨基酸萃取量達(dá)到平臺(tái)而不再上升。每次實(shí)驗(yàn)平行做3 次，取其均值作圖，SD 如圖示意，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.5 凈化方式的選擇

口含煙樣品采用去離子水萃取后，萃取液呈深棕色液體，基質(zhì)復(fù)雜；根據(jù)亞硝基氨基酸酸為極性小分子的性質(zhì)，嘗試了3 種思路對(duì)樣品進(jìn)行凈化。①借鑒QuEChERS 方法，考察了Bond Elut C18、Bond Elut Carbon 兩種吸附劑的凈化效果，結(jié)果表明：Bond Elut Carbon 對(duì)樣本基質(zhì)有一定的凈化作用，但同時(shí)對(duì)目標(biāo)化合物有一定的吸附，4 種化合物與對(duì)照樣品相比，響應(yīng)大幅下降。②一般氨基酸的凈化多采用陽(yáng)離子交換，其原理是利用了氨基的電負(fù)性，但是亞硝基氨基酸結(jié)構(gòu)中亞硝基取代了氨基上的氫原子，降低了電負(fù)性，因此在凈化時(shí)，首先考慮了分子結(jié)構(gòu)中的羧基，選用了Bond Elut SAX 強(qiáng)陰離子交換柱和具有非極性及陰離子交換兩用作用的Bond Elut Plexa PAX兩種小柱進(jìn)行固相萃取，結(jié)果表明：4 種化合物在兩種小柱上均不保留，也達(dá)不到凈化效果。③固相支撐液液萃?。⊿LE）以比表面積高、化學(xué)惰性好的多孔硅藻土為液液分配載體，充分發(fā)揮硅藻土多孔性、大比表面、低表面活性等特點(diǎn)，快速地吸附樣品基質(zhì)中的水分，多孔的硅藻土表面能夠形成一層薄薄的液膜，當(dāng)采用有機(jī)溶劑洗脫時(shí)，在互不相溶的兩相實(shí)現(xiàn)快速微觀液液萃取。SLE 具有不易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象、基質(zhì)效應(yīng)降低和需要樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，并可實(shí)現(xiàn)高通量樣品操作，是分析實(shí)驗(yàn)室的一種高效樣品前處理工具。 SLE 使用相應(yīng)的萃取柱，僅需上樣和洗脫兩步，即可從水相中萃取目標(biāo)化合物。從亞硝基氨基酸的結(jié)構(gòu)來(lái)看，由于亞硝基取代了氨基上的氫原子，增加了亞硝基氨基酸的疏水性，其在有機(jī)溶劑乙酸乙酯中還是有相當(dāng)?shù)娜芙舛鹊摹］腿∪軇﹥?yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，假設(shè)水的萃取效率是100%，相同樣品量、相同溶劑體積下，乙酸乙酯對(duì)四種亞硝基氨基酸的萃取效率是大于50%的。因此，4 種亞硝基氨基酸在乙酸乙酯中均具有相當(dāng)?shù)娜芙舛?。選取BIOTAGE isolute SLE 硅藻土液液萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，用乙酸乙酯（含2%乙酸）洗脫，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：30 mL 乙酸乙酯可將目標(biāo)物完全洗脫，樣品濃縮復(fù)溶后，進(jìn)LC-MS-MS 分析，4 種亞硝基氨基酸峰形良好，可達(dá)基線(xiàn)分離，且靈敏度較高，完全滿(mǎn)足樣品測(cè)試需要，樣本中4 種目標(biāo)物MRM 譜圖如2.2.2 中圖4（B）所示。

圖5 萃取溶劑(A)及萃取方式(B)的選擇Fig.5 Selection of extraction solvent (A) and extraction method (B)

2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)、檢出限和定量限

N-亞硝基肌氨酸（NSAR）、3-（N-甲基亞硝基氨基）丙酸（MNPA）、4-（N-甲基亞硝基氨基）丁酸（MNBA）和亞硝基氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸（NAzCA）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度范圍分別為10～500 ng/mL；50～2500 ng /mL；10～500 ng /mL；10～500 ng /mL。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)NAzCA- d5、NSAR- d3、MNBA- d3 濃度均為50.0 ng/mL，MNPA-d3 濃度為250.0 ng/mL。分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析，并以亞硝基氨基酸化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比對(duì)濃度比進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。以不低于3 倍性噪比為檢出限，以不低于10 倍性噪比為定量限，結(jié)果如表4 所示。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)考察

分別采用口含型、含化型、膠基型制品提取溶液配制基質(zhì)匹配校正溶液，比較和溶劑校正曲線(xiàn)斜率的差異性，以評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表5），采用口含型、含化型、膠基型三種基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程的斜率與采用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程的斜率之比值（SR）均在94.4%～105.6%之間，表明該方法基質(zhì)效應(yīng)較小，可采用溶劑配標(biāo)方式。分析其原因主要是因?yàn)榍疤幚矸椒ㄖ胁捎昧薆IOTAGE isolute SLE 硅藻土液液萃取柱，通過(guò)液液萃取，及后續(xù)的濃縮復(fù)溶，凈化了樣本基質(zhì)，部分除去了影響離子化的干擾成分， 另外實(shí)驗(yàn)時(shí)，相應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)也起到了校正作用。

表4 4 種亞硝基氨基酸的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Tab.4 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection and quantitation of the four N-nitrosamino acids

表5 3 種口含煙的基質(zhì)效應(yīng)Tab. 5 Matrix effects of three kinds of oral smokeless tobacco products

2.8 方法精密度與準(zhǔn)確度

選取含有4 種亞硝基氨基酸的口含型樣品1 種，進(jìn)行方法日內(nèi)及日間精密度實(shí)驗(yàn)。一天內(nèi)進(jìn)行5 平行實(shí)驗(yàn)以考察方法日內(nèi)精密度，連續(xù)5 天，每天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以考察方法日間精密度，結(jié)果表明，4 種亞硝基氨基酸的日內(nèi)精密度小6.5%，日間精密度小于9.4%。

在進(jìn)行方法準(zhǔn)確度考察時(shí)，考慮到樣品基質(zhì)的差異性，選取口含型、含化型、膠基型口含煙各1種，在高、中、低3 個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，平行測(cè)定3 次，結(jié)果如表6 所示。NSAR、NAzCA、MNPA、MNBA 加標(biāo)回收率范圍分別在84.2%～102.3%、77.7%～102.3%、90.8%～111% 和89.5%～101.7 %之間。

2.9 部分口含煙樣品中4 種亞硝基氨基酸含量

國(guó)內(nèi)目前還沒(méi)有口含煙中亞硝基氨基酸含量的報(bào)道，國(guó)外對(duì)口含煙中N-亞硝基氨基酸的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在1985 年到1999 年，基本采用的是重氮甲烷衍生GC-TEA 檢測(cè)方法。八十年代，Ohshima H等確認(rèn)了煙草制品中MNPA 及MNBA 的存在，并對(duì)瑞典、美國(guó)的鼻煙及比利時(shí)嚼煙進(jìn)行了分析，含量范圍分別為0.1～7 μg/g、ND～2.24 μg/g。1988 年，1989年，Tricker AR 等分別對(duì)印度zarda、kiwam 口含煙進(jìn)行了分析NSAR、NAzCA、MNPA 及MNBA 含量范圍分別為ND～0.35 μg/g、ND～0.14 μg/g、0.08～7.8 μg/g、0.008～1.1 μg/g。九十年代，Djordjevic MV 等研究了存儲(chǔ)條件對(duì)煙草亞硝基氨基酸含量的影響，結(jié)果表明，隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)及存儲(chǔ)溫度的升高，亞硝基氨基酸含量呈增加趨勢(shì)。Hoffmann DH、Djordjevic MV 等對(duì)瑞典、美國(guó)的口鼻煙中的亞硝基氨基酸含量也進(jìn)行了研究，NSAR、MNPA、MNBA含 量 范 圍 分 別 為ND～0.68 μg/g、1.45～14.03 μg/g、0.01～6.9 μg/g。由此可見(jiàn)，隨著原料及加工工藝的不同，亞硝基氨基酸含量差異較大。

表6 4 種亞硝基氨基酸的加標(biāo)回收率Tab. 6 Spiked recoveries of the four N-nitrosamino acids

表7 14 個(gè)口含煙樣品中四種亞硝基氨基酸的含量 Tab. 7 Contents of the four N-nitrosamino acids in 14 oral smokeless tobacco product samples ng/g

采用本文所建方法測(cè)定了14 種不同類(lèi)型及口味含煙樣品中4 種亞硝基氨基酸含量，結(jié)果如表7 所示。測(cè)試結(jié)果表明： 膠基型和含化型制品中未檢出4種亞硝基氨基酸；在其它10 個(gè)口含型樣品中，部分檢出NSAR、NAzCA，均檢出了MNPA、MNBA。NSAR、NAzCA、MNPA 及MNBA 檢 出 量 分 別 為ND～128.3 ng/g 、ND～141.6 ng/g 、1687.1～2424.1 ng/g、65.0～199.5 ng/g。與以往文獻(xiàn)相比，袋裝、散裝口含煙四種亞硝基氨基酸含量均在以往所報(bào)道的范圍內(nèi)，且偏向于含量范圍的低端，這主要是因?yàn)?，許多煙草公司致力于產(chǎn)品加工工藝改進(jìn)，不斷降低有害成分的含量，以至于新產(chǎn)品中有害成分含量顯著低于傳統(tǒng)類(lèi)型的無(wú)煙氣煙草制品（如嚼煙、斗煙、含煙等）[24]。對(duì)于新出現(xiàn)的產(chǎn)品類(lèi)型，如：口含型片劑、膠基型口含煙，由于煙絲用量較少，及加工工藝的改進(jìn)，四種亞硝基氨基酸均未檢出。

3 結(jié)論

以水為溶劑，萃取口含煙中NSAR、NAzCA、MNPA、MNBA 四種亞硝基氨基酸，經(jīng)BIOTAGE isolute SLE 硅藻土液液萃取柱進(jìn)行凈化濃縮，建立了簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的檢測(cè)口含煙中4 種亞硝基氨基酸的LCMS/MS 分析方法。4 種亞硝基氨基酸工作曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限、定量限分別在1.4～5.0 ng/g之間、4.8～18.9 ng/g 之間，回收率均在77.7%～111%之間。用該方法分析國(guó)內(nèi)外14 種市售品牌口含煙，結(jié)果表明膠基型和含化型制品中未檢出4 種亞硝基氨基酸；口含型樣品中，部分檢出NSAR、NAzCA，均檢出MNPA 及MNBA ； MNPA 含量最高，范圍為1687.1～2424.1ng/g。該方法前處理簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，易于推廣應(yīng)用。