環(huán)形泰勒蟲轉(zhuǎn)化細(xì)胞中關(guān)鍵分子的研究現(xiàn)狀

蔣 晨，李 霞，史康妍，趙保才，周子成，趙洪喜

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

環(huán)形泰勒蟲病(Annular theileriasis)，又稱為地中岸熱或者熱帶泰勒蟲病，是以蜱為媒介的頂復(fù)門、梨形蟲綱、泰勒蟲科、泰勒蟲屬的環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)寄生于動(dòng)物的單核巨噬系統(tǒng)細(xì)胞及紅細(xì)胞而引起的血液原蟲病[1]。本病的主要臨床癥狀和病理變化是高熱稽留、貧血、體表(全身性)淋巴結(jié)腫大、全身性出血、消瘦、發(fā)熱、血小板減少、白細(xì)胞減少、肺水腫和胸腔積液，腎臟外膜易剝離。第三胃內(nèi)容物干燥，第四胃黏膜腫脹，其邊緣隆起，中間凹，呈現(xiàn)灰色，潰瘍面積約占80%[2-3]。該病通常是由寄生蟲的子孢子在進(jìn)食過(guò)程中從蜱的唾液腺中釋放出來(lái)，侵入并在牛淋巴細(xì)胞中建立感染[4]。在感染期間，白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA的表達(dá)上調(diào)，一氧化氮(NO)的產(chǎn)生增加，從而導(dǎo)致牛單核細(xì)胞的分子和功能表型改變[5]。本病在世界范圍內(nèi)分布，全球每年大約有2.5億頭牛受到本病的威脅，造成的損失大約8億美元，被世界動(dòng)物性組織(OIE)列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。目前對(duì)本病的治療沒(méi)有特效藥物，主要以預(yù)防為主，診斷方法包括顯微鏡觀察法、血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷法，但是沒(méi)有一種方法可以準(zhǔn)確地診斷和防治[6]。

目前正在研究的免疫抗原主要有子孢子表面抗原、裂殖子表面抗原、裂殖體表面抗原和熱休克蛋白等，這些表面抗原具有良好的免疫原性和生理功能，具有藥物和疫苗的開發(fā)潛力，可以作為藥物和疫苗的候選位點(diǎn)，為本病的防治提供新的方法和途徑。

1 子孢子表面抗原蛋白

子孢子表面抗原蛋白是環(huán)形泰勒蟲在子孢子階段分泌的一種膜蛋白，高度保守又具有良好的免疫原性，可以作為藥物和疫苗的候選抗原。對(duì)于子孢子表面蛋白SPAG-1和p67都具有很好的抗原性，SPAG-1的抗原性可能是發(fā)生在C端的16個(gè)殘基，這16個(gè)殘基可能需要一些表位來(lái)激活才具有抗原性，而p67的抗原部分可能包括SPAG-1 C端部分，所以單獨(dú)使用也可以產(chǎn)生保護(hù)力。Darghouth M等[7]用重組全長(zhǎng)SPAG-1 His標(biāo)簽蛋白和減毒的裂殖體去誘導(dǎo)同源和異源的子孢子攻擊，結(jié)果表明，兩者都可以提供部分保護(hù)，而且兩者組合使用可提供最佳保護(hù)作用，這可能是C端16個(gè)殘基不能被子孢子所識(shí)別，無(wú)法感染子孢子，所以SPAG-1和減毒細(xì)胞系都是潛在的亞單位疫苗。

Kaba S等[8]用p67的結(jié)構(gòu)域與綠色熒光蛋白(GFP)的羧基末端融合表達(dá)，融合表達(dá)的p67蛋白其穩(wěn)定性和表達(dá)能力都獲得了增強(qiáng)，單克隆抗體的表位也變得比較保守，使其更接近天然的p67蛋白構(gòu)象，對(duì)p67蛋白進(jìn)行純化免疫可以產(chǎn)生部分保護(hù)力，推測(cè)這種保護(hù)力可能是p67部分區(qū)域發(fā)揮的作用，這和Tebaldi G等[9]研究結(jié)果相同，其在分別表達(dá)全長(zhǎng)p67抗原和截短的p67抗原，發(fā)現(xiàn)這兩種形式的重組p67與抗p67分子發(fā)生單克隆反應(yīng)，該抗體可以與天然的子孢子反應(yīng)，在山羊和牛中具有免疫原性。Lacasta A等[10]發(fā)現(xiàn)p67(p67C)的C端部分與ISA206VG佐劑3種劑量在群體水平上的保護(hù)作用(46%)與單獨(dú)使用p67蛋白的保護(hù)作用相似，而且p67C體積小，蛋白質(zhì)穩(wěn)定，表達(dá)產(chǎn)量高，抗體效價(jià)高，可以刺激CD4+T細(xì)胞增殖，推測(cè)p67C是潛在的亞單位疫苗。Nyagwange J等[11]對(duì)篩選出來(lái)的4種潛在的疫苗候選者進(jìn)行體外中和子孢子感染，發(fā)現(xiàn)p13的中和能力比gp34蛋白和p104蛋白都強(qiáng)，可以產(chǎn)生最強(qiáng)子孢子中和活性抗體，在宿主-寄生蟲中發(fā)揮作用，對(duì)這些抗原抗體進(jìn)行測(cè)試，確認(rèn)了其作為候選抗原疫苗的作用。子孢子表面抗原蛋白SPAG-1的C端和p67的結(jié)構(gòu)域都有較好的免疫原性，而且這兩種蛋白又具有同源性，氨基酸相似序列高達(dá)54%，與宿主細(xì)胞的識(shí)別和侵襲有關(guān)，推測(cè)其可能有相同的部分起到相同的保護(hù)作用，如Tebaldi G表達(dá)的p67蛋白可以刺激淋巴細(xì)胞增殖，間接提高機(jī)體的抵抗力，從而達(dá)到防護(hù)作用，為以后藥物和疫苗的研究提供基礎(chǔ)。

2 裂殖體表面蛋白

裂殖體表面蛋白是環(huán)形泰勒蟲在生長(zhǎng)發(fā)育階段分泌的一種膜內(nèi)蛋白，具有良好的免疫原性，基因序列非常保守，適合用來(lái)診斷環(huán)形泰勒蟲病。這些抗原性的蛋白在被合成后應(yīng)該在胞內(nèi)被其它物質(zhì)相互連接在一起激活具有蛋白活性后才能有更多抗原位點(diǎn)以至于有很好的抗原性。Silatsa B等[12]首次在沒(méi)有蜱媒介的喀麥隆使用p104 PCR從牛血液樣本中篩選出陽(yáng)性，對(duì)p104進(jìn)行基因分析，存在的Tp1 CD8表位與Muguga Cocktail ITM疫苗的Tp1 CD8表位相同，這可能是人為介導(dǎo)ITM活疫苗的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的。Salih D等[13]證實(shí)了這一推測(cè)，在蘇丹的牛群中確定了CD8+T細(xì)胞識(shí)別的抗原Tp1和Tp2之間的序列多樣性，分別產(chǎn)生4和14個(gè)抗原變體，而這些抗原變體的多數(shù)等位基因與活疫苗混合物中Muguga成分相似，由此可見這確實(shí)是人為導(dǎo)致的結(jié)果。Svitek N等[14]研究CD8+T細(xì)胞識(shí)別的Tp1抗原的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)Tp1可以刺激CD8+T細(xì)胞增殖和CTL產(chǎn)生特異性應(yīng)答，抵御部分保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能是p104發(fā)揮的作用。Huber S等[15]用共免疫沉淀技術(shù)研究微管蛋白CLASP1與裂殖體膜蛋白p104的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者是通過(guò)EB1間接鏈接的，CLASP1與EB1是通過(guò)崁入MT結(jié)合域中的兩個(gè)SxIP基序介導(dǎo)的，p104是與崁入富含脯氨酸的C末端結(jié)構(gòu)域中的SxIP模體與宿主細(xì)胞的EB1相互作用的，二者間接連接，共同定位到裂殖體邊表面，與蛋白質(zhì)的編碼和維持轉(zhuǎn)化表型有關(guān)。Huber S等[16]以CLASP1為誘餌，使用BioID、熒光顯微鏡和免疫共沉淀技術(shù)，鑒定了微管和SH3結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白TaMISHIP，該蛋白定位于裂殖體表面，包含2個(gè)EB1結(jié)合SxIP基序，3個(gè)推定的SH3結(jié)合Px(P/A)xPR基序，2個(gè)核定位和核輸出信號(hào)組成的區(qū)域，Px(P/A)xPA基序負(fù)責(zé)將CD2AP募集到裂殖體表面，使TaMISHIP蛋白和CD2AP發(fā)生特異性作用。CD2AP與CIN85序列和結(jié)構(gòu)相似，其結(jié)合配偶體參與胞質(zhì)分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、小泡運(yùn)輸?shù)取IN85可以將受體信號(hào)連接NF-κB途徑，使IκB和JNK1磷酸化水平降低，IKK復(fù)合物的體外激酶活性受損，從而導(dǎo)致NF-κB抑制劑的降解和NF-κB途徑的激活。CD2AP可以與抑癌蛋白p53結(jié)合，將信號(hào)分子募集到裂殖體表面來(lái)促進(jìn)泰勒蟲誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。

Alhosary A等[17]以Tams-1 PCR為對(duì)照來(lái)評(píng)估TASP蛋白商業(yè)ELISA試劑盒的可靠性，與PCR數(shù)據(jù)相比，試劑盒靈敏度為91.25%，特異性為78.4%，兩者的結(jié)果有良好的相關(guān)性，是檢測(cè)慢性和攜帶動(dòng)物寄生蟲抗體的較好工具。Ulrike Ssitzer等研究發(fā)現(xiàn)，裂殖體表面蛋白TASP被3個(gè)膜結(jié)構(gòu)域分成大段、小段、N端和C端，大段中包含蛋白質(zhì)的多態(tài)性區(qū)域可以刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生TASP抗體，推測(cè)TASP有意義的抗原部分可能是在被切開的大段部分，就如Sadr N等[18]研究發(fā)現(xiàn)這部分多態(tài)性在種間和種內(nèi)都可以檢測(cè)到，Tasp基因序列有90%～94%的同一性和68%～94%的氨基酸同源性，而且不同特征的TASP蛋白有些區(qū)域相同，說(shuō)明TASP多態(tài)性區(qū)域非常保守，在宿主細(xì)胞中可以產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答，這部分免疫應(yīng)答可能是由多態(tài)性區(qū)域或者某些相同區(qū)域翻譯的蛋白質(zhì)所刺激，我們可以通過(guò)重組這些區(qū)域蛋白刺激宿主產(chǎn)生抗體，有助于重組蛋白疫苗和診斷產(chǎn)品的開發(fā)。Bilgic H等[19]通過(guò)生物信息學(xué)鑒定了編碼預(yù)測(cè)抗原基因，挖掘出免疫顯性抗原基因，并且用TASP蛋白建立一種ELISA方法，結(jié)果表明TASP蛋白的表現(xiàn)最好。Aquil M等[20]以重組的TASP為抗原，用DOT-ELISA方法檢測(cè)樣品血清中的特異性抗體，結(jié)果表明TASP蛋白的敏感性和特異性為95.8%和80%，說(shuō)明抗體滴度和免疫效價(jià)都非常高，免疫原性非常好，可成為檢測(cè)環(huán)形泰勒蟲病的一種方法。

糖基磷脂酰肌醇(GPI)抗體可以在寄生蟲入侵方面有保護(hù)作用，糖基磷脂酰肌醇(GPI)誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6可以促成疾病的發(fā)病機(jī)理，通過(guò)中和GPI的刺激活性來(lái)提供針對(duì)機(jī)體的保護(hù)。Mbengue B等[21]在攜帶高寄生蟲血癥的個(gè)體中測(cè)出高水平的GPI抗體，并且糖基磷脂酰肌醇的炎性細(xì)胞因子和體液反應(yīng)與寄生蟲病免疫力和發(fā)病機(jī)理相關(guān)。Abbasnia A等[22]通過(guò)高效液相色譜從純化的裂殖體中分離出GPI，并通過(guò)ELISA測(cè)定抗GPI抗體，結(jié)果表明，自然感染和接種動(dòng)物血清中存在高含量抗GPI抗體。GPI蛋白在寄生蟲-宿主細(xì)胞相互作用中起重要作用，有很好的免疫原性，可以誘導(dǎo)促炎性因子TNF-α的釋放和抗體反應(yīng)，與宿主免疫應(yīng)答的產(chǎn)生有關(guān)，可以用作開發(fā)疫苗和GPI療法。不過(guò)在用裂殖體制作減毒疫苗時(shí)，隨著長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致基因型的喪失，降低寄生蟲的多樣性，從而達(dá)不到保護(hù)作用，所以需要增強(qiáng)多樣性來(lái)對(duì)當(dāng)前疫苗進(jìn)行修飾，加強(qiáng)保護(hù)作用[23-24]。

3 裂殖子表面蛋白

裂殖子表面蛋白是環(huán)形泰勒蟲在進(jìn)入紅細(xì)胞時(shí)分泌的一種膜蛋白，具有很好的免疫原性，基因序列非常保守，Lempereur L等[25]對(duì)環(huán)形泰勒蟲具有傳輸阻斷反應(yīng)的編碼抗原寄生蟲基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)Tams1等位基因顯示有最高的dN / dS比，具有6個(gè)顯著的陽(yáng)性選擇位點(diǎn)，表面抗原的不同表位具有高度依賴性并且蛋白質(zhì)穩(wěn)定，適合做疫苗的候選抗原。Abakeri A等[26]使用3種方法對(duì)蘇丹尼亞拉地區(qū)162頭奶牛進(jìn)行環(huán)形泰勒蟲的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Tams1聚合酶鏈反應(yīng)陽(yáng)性率最高，準(zhǔn)確率高，與Tams1蛋白多陽(yáng)性位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。Roy S等[27]通過(guò)微衛(wèi)星標(biāo)記基因分型，GBS分析和Tams1基因多態(tài)性分析，確定了泰勒蟲多種基因型的存在，揭示了寄生蟲和疫苗之間的遺傳和等位基因的多樣性，有助于確定新的疫苗目標(biāo)和控制該疾病的政策。Katzer F等[28]研究表明，對(duì)DNA水平上44個(gè)多樣性等位基因Tams1進(jìn)行克隆、測(cè)序和鑒別，對(duì)比出保守性、變異性和高變異區(qū)域，結(jié)果表明，序列的多樣性反映在抗原性中，在多肽性區(qū)域內(nèi)可變的糖基化位點(diǎn)和氨基酸表位的變化是蟲體適應(yīng)外界環(huán)境所作出的改變，與蟲體入侵宿主細(xì)胞和免疫逃避有關(guān)，因此該基因疫苗應(yīng)該注重多肽設(shè)計(jì)。

4 熱休克蛋白

從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物，熱休克蛋白廣泛存在于其體內(nèi)，發(fā)揮重要生理功能，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激能力。熱休克蛋白是伴侶蛋白，按照蛋白的分子大小分為5類，包括Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp60和小分子熱休克蛋白。其中，最為重要的是Hsp70家族蛋白，Hsp70家族蛋白各分子量相近，序列具有高度保守性，在應(yīng)激細(xì)胞中被高度誘導(dǎo)表達(dá)，具有保護(hù)機(jī)體和細(xì)胞的功能[32]。

環(huán)形泰勒蟲在入侵宿主時(shí)，蟲體因外界環(huán)境的改變發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，熱休克因子1(HSF1)和缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)協(xié)同誘導(dǎo)Hsp的高度表達(dá)，有助于蟲體在宿主內(nèi)更好的適應(yīng)環(huán)境，使蟲體免疫逃逸宿主的檢測(cè)，Hsp和膜表面Hsp可以被抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)的CD91+所識(shí)別，發(fā)揮免疫刺激作用，產(chǎn)生抗蟲體蛋白抗體，抵御環(huán)形泰勒蟲入侵[30]。Hsp70在每個(gè)生活階段都有表達(dá)，在裂殖體階段表達(dá)程度更高，蛋白合成后經(jīng)過(guò)加工具有活性。

另外，Hsp90蛋白在蟲體感染過(guò)程中發(fā)揮重大的作用。Sun H等[31]研究表明，Hsp90蛋白可以調(diào)節(jié)人紅細(xì)胞中的寄生蟲生長(zhǎng)，維持寄生蟲的活力和增殖，在宿主細(xì)胞入侵以及生長(zhǎng)和毒力中起重要的作用。Hsp90蛋白定位于表面，在寄生蟲中充當(dāng)熱傳感器，可以增強(qiáng)寄生蟲的毒力，它的底物是激酶IKK，它可以降解轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制劑，使轉(zhuǎn)錄因子NF-κB易位至細(xì)胞核，從而導(dǎo)致炎癥和細(xì)胞凋亡基因的激活[32]。Hsp90蛋白有4種亞型，每種亞型長(zhǎng)度相差不大。Kinnarid J等[33]建立了系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)感染環(huán)形泰勒蟲的轉(zhuǎn)化白細(xì)胞分析Hsp90亞型特征，確定了每種亞型的定位和格爾德霉素和衍生物17-AAG的作用，對(duì)17-AAG的抑制非常敏感。Guswanto A等[34]研究表明，格爾德霉素可以通過(guò)結(jié)合Hsp90降低寄生蟲的成活率，抑制泰勒蟲的正常繁殖，可以作為泰勒蟲的潛在藥物靶標(biāo)。熱休克蛋白具有很好的抗原性，可以刺激宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答，所以可作為治療和診斷本病的候選蛋白。

5 展望

目前，對(duì)于環(huán)形泰勒蟲免疫蛋白的研究已經(jīng)取得了良好進(jìn)展，但是這些免疫蛋白用于檢測(cè)、診斷、治療和預(yù)防還處于起步階段。核酸和蛋白方面研究程度的加深，以及在結(jié)構(gòu)和功能上更加全面的了解，將為預(yù)防和治療環(huán)形泰勒蟲病提供新的途徑和方法。