副豬嗜血桿菌毒力基因及其致病機(jī)制研究進(jìn)展

葉俊賢，劉郁夫，馮夏寧，陳瑞愛*

(1.華農(nóng)(肇慶)生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，肇慶 526238；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室肇慶分中心，肇慶 526238)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是一種呈短桿狀的革蘭氏陰性菌，屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬成員，是引起豬革拉澤氏病(Glasser's disease)的病原。HPS寄生于健康豬的上呼吸道，正常情況下不發(fā)病，但在應(yīng)激環(huán)境或與其他病毒性病原混合感染情況下，HPS可突破黏膜屏障，通過血液循環(huán)定植到其他內(nèi)臟器官，引起以呼吸道癥狀、胸腔和腹腔大量纖維素性物質(zhì)滲出、心包積液和關(guān)節(jié)炎為特征的呼吸道疾病[1]。HPS發(fā)病率高，病情嚴(yán)重時(shí)病死率可達(dá)50%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要細(xì)菌性病原之一。特別是在養(yǎng)殖業(yè)“減抗、禁抗”政策的大環(huán)境下，HPS引起的發(fā)病有上升趨勢(shì)[2]。

HPS的毒力因子眾多，致病機(jī)制復(fù)雜，針對(duì)毒力基因的作用和致病機(jī)制研究是熱點(diǎn)之一。已成功鑒定多個(gè)HPS毒力相關(guān)基因，并闡明其作用機(jī)制，如OMP P2蛋白、OMP P5蛋白、IgA蛋白酶、三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[3-4]。近幾年，又陸續(xù)在HPS毒力相關(guān)的膜蛋白分子、毒力相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子以及致病機(jī)制研究方面取得新進(jìn)展。本文擬對(duì)HPS毒力基因、病原與宿主之間相互作用等進(jìn)行綜述，為HPS基礎(chǔ)研究、新型防控技術(shù)和新藥研發(fā)提供參考。

1 HPS毒力相關(guān)的膜蛋白分子

1.1 脂寡糖(lipooligosaccharide，LOS)

脂寡糖是HPS細(xì)菌外膜上的糖脂，與大腸埃希氏菌LPS的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能相似，但缺失了O抗原亞基，因此稱為脂寡糖。HPS脂寡糖除了可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，還在細(xì)菌吸附、侵入宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用[5]，LOS是HPS的重要毒力因子之一。

已經(jīng)證實(shí)，opsX、rfaF、waaQ和rfaE等4個(gè)庚酰轉(zhuǎn)移酶基因參與LOS的合成過程[6]。2016年Zhou Q等研究表明，HPS糖基轉(zhuǎn)移酶基因lgtB和lex-1的失活，均可引起HPS合成LOS的能力缺陷，并導(dǎo)致HPS的血清耐受能力和吸附豬上皮細(xì)胞的能力顯著低于親本株[7]。HPS ΔlgtF基因突變株導(dǎo)致形成截短型LOS，截短型LOS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的mRNA水平顯著低于野生型LOS，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這種差異是兩種LOS對(duì)細(xì)胞NF-κB和MAPK信號(hào)通路的激活水平不同造成的[8]，也從側(cè)面驗(yàn)證了HPS LOS可被宿主免疫細(xì)胞識(shí)別，在介導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Feng S等還從HPS基因組鑒定出一種磷酸葡萄糖變位酶(HAPS-0849)，該蛋白具有磷酸葡萄糖變位酶活性，該基因失活可能阻斷細(xì)菌合成1-磷酸葡萄糖，進(jìn)而影響GalU的功能，導(dǎo)致LOS合成受阻[9]。

除了LOS合成相關(guān)的上游基因，翻譯后修飾過程也對(duì)LOS發(fā)揮完整的生物學(xué)功能至關(guān)重要。其中HPS α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因(lsgB)介導(dǎo)HPS LOS的唾液酸化過程，該基因突變可導(dǎo)致HPS吸附細(xì)胞的能力下降，對(duì)小鼠的致病力減弱。

1.2 莢膜

莢膜多糖是HPS一種重要的毒力因子，在吸附宿主細(xì)胞、逃逸宿主免疫反應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用。將參與合成莢膜多糖的基因capD缺失，可使HPS致病菌株SH0165對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷作用更加敏感，且導(dǎo)致細(xì)菌毒力下降[10]。Eberle K C等將參與合成莢膜多糖的基因簇缺失，構(gòu)建HPS莢膜突變株，通過體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)，莢膜突變導(dǎo)致HPS抵抗豬肺泡巨噬細(xì)胞吞噬能力的顯著致弱，在豬鼻腔的定殖能力較親本株弱[11]。HS069Δcap僅能激起微弱的體液免疫反應(yīng)，且不能保護(hù)強(qiáng)毒攻毒。

莢膜還是HPS重要的免疫原性組分，有人比較豬肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)不同HPS菌株的識(shí)別能力，選擇血清5型HPS菌株制備莢膜粗提取物(crude capsular extract，cCE)。cCE除了具有與特異性抗體結(jié)合的能力，還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高的特異性抗體和促炎性細(xì)胞因子水平，具有成為新型亞單位疫苗的潛力[12]。

1.3 其他膜蛋白

OMP P2是HPS外膜表面成分最豐富的膜蛋白，在維持細(xì)胞膜完整性和通透性發(fā)揮重要作用，還可參與病原與宿主之間的相互作用，但OMP P2蛋白哪些表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)是參與宿主識(shí)別過程的重要功能域仍然未知。Zhou Y等通過合成肽刺激巨噬細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)合HPS缺失株構(gòu)建，明確了OMP P2 L7和L8是主要刺激機(jī)體產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并證明該作用是通過激活NF-κB信號(hào)通路引起的[4]。

VacJ是一種細(xì)菌外膜上的脂蛋白，參與多種病原菌的致病過程。HPSvacJ基因突變使細(xì)菌的細(xì)胞完整性受到破壞，并伴隨著HPS細(xì)菌形態(tài)的改變以及HPS對(duì)SDS、滲透壓和氧化應(yīng)激的敏感性增加，ΔvacJ對(duì)Balb/c小鼠的半數(shù)致死劑量較親本株上升15倍[13]。VacJ重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，能誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生較高的抗體水平和提高產(chǎn)γ干擾素細(xì)胞的數(shù)量，但同樣也不能保護(hù)強(qiáng)毒攻毒[14]。

三聚體子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員(virulence associated trimeric autotransporters，VtaA)在HPS細(xì)胞膜表面組成了細(xì)菌五型分泌系統(tǒng)，參與病原與宿主之間的互作，所有VtaA蛋白都具有與黏附素、血凝素和侵襲素結(jié)合的特殊結(jié)構(gòu)域。Costa H M等利用大腸埃希氏菌體外表達(dá)，并鑒定VtaA2的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)VtaA2有助于細(xì)菌對(duì)塑料、黏蛋白、BSA、纖維連接蛋白和膠原的吸附作用[15]，且中央膠原結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮功能的主要結(jié)構(gòu)域。

Jiang R等[16]系統(tǒng)分析了HPS生物被膜的成分以及形成的動(dòng)態(tài)過程，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析篩選出最可能與細(xì)菌定植和吸附相關(guān)的基因(artM、artQ、ssrS、pflA和HutX)，這些基因主要參與生物合成的二級(jí)代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、淀粉和蔗糖代謝等細(xì)菌生物學(xué)過程，為深入研究HPS調(diào)控生物被膜形成的機(jī)制提供基礎(chǔ)。

新型亞單位疫苗的研制是HPS疫苗研究的熱點(diǎn)，而針對(duì)HPS膜蛋白的研究將有助于充分認(rèn)識(shí)這些膜蛋白的生物學(xué)功能將為疫苗研究提供參考。盡管大多數(shù)HPS膜蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，但攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果往往不理想，其中佐劑成分可能是影響HPS重組蛋白疫苗的效力關(guān)鍵組分[17]。

2 毒力相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子

二元調(diào)控系統(tǒng)CpxRA和CheY/QseC參與調(diào)節(jié)多種致病菌的環(huán)境適應(yīng)性和細(xì)菌毒力。Cao Q等研究顯示，cpxR基因突變導(dǎo)致HPS對(duì)氧化應(yīng)激、滲透壓應(yīng)激、酸性環(huán)境和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的敏感性改變，通過RT-PCR鑒定出2個(gè)編碼藥物外排泵基因的表達(dá)下調(diào)[18]。QseC是二元調(diào)控系統(tǒng)CheY/QseC的組氨酸蛋白激酶，在系統(tǒng)中負(fù)責(zé)將外界刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，He L等構(gòu)建HPSΔqseC突變株同樣表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)激環(huán)境耐受能力、鐵離子攝取能力和生物被膜合成能力下降的表型[19]，但CpxR和QseC作用的機(jī)制和靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步研究。

OxyR屬于LysR樣蛋白家族成員，N段具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是介導(dǎo)細(xì)菌抵抗氧化應(yīng)激作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可直接激活銅綠假單胞菌過氧化物降解酶的表達(dá)[20]。HPSΔoxyR突變株的生長(zhǎng)速度和生物被膜形成能力被顯著抑制。原核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序顯示，ΔoxyR突變株466個(gè)差異表達(dá)基因主要參與氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA復(fù)制與修復(fù)等生物學(xué)功能[21]，但對(duì)OxyR的直接作用機(jī)制尚未解析。

密度感應(yīng)系統(tǒng)LuxS/AI-2是一種細(xì)菌間重要的信號(hào)交流方式，已證明在多種致病菌中參與影響毒力。HPSΔluxS突變株產(chǎn)生顯著低于親本株的AI-2信號(hào)分子水平，顯著影響HPS對(duì)氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激環(huán)境的耐受能力，并導(dǎo)致HPS對(duì)小鼠的致病力下降10倍[22]。

cAMP受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP)是一種重要的全局性調(diào)控子，在感染過程中調(diào)節(jié)細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。Jiang C等研究顯示，crp基因參與調(diào)節(jié)HPS對(duì)高滲透壓環(huán)境的適應(yīng)能力、對(duì)血清抗性、鐵離子攝取能力和生物被膜合成能力，但crp基因與HPS細(xì)菌毒力之間的關(guān)系仍然未知[23]。

隨著基因組學(xué)數(shù)據(jù)不斷完善，通過同源基因的比對(duì)可不斷挖掘HPS毒力相關(guān)基因，針對(duì)HPS轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究也逐漸增多。Zhou Y Y等通過比較HPS強(qiáng)弱毒株之間的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因，篩選出10個(gè)影響細(xì)菌磷酸化系統(tǒng)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因可能參與HPS的致病過程[24]。

3 HPS與宿主的相互作用

3.1 HPS與天然免疫信號(hào)通路

HPS感染引起全身性炎癥反應(yīng)，以胸腹腔滲出大量纖維素性物質(zhì)為主要特征。HPS感染可上調(diào)趨化因子RANTES的表達(dá)，并且這種上調(diào)作用依賴于NF-κB信號(hào)通路和JNK信號(hào)通路的激活[25]。通過流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)感染HPS豬表達(dá)TLR2、Siglecs和CD163細(xì)胞表面受體的外周血單核細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明機(jī)體在募集白細(xì)胞參與抗細(xì)菌感染過程中發(fā)揮積極作用[26]。研究表明，HPS多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PotD可通過激活TLR4信號(hào)通路，進(jìn)而激活NF-κB和JNK信號(hào)通路以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，并可通過相應(yīng)的阻斷劑抑制促炎性細(xì)胞因子的上調(diào)作用[27]。這些研究說明，HPS感染對(duì)NF-κB和JNK信號(hào)通路有激活作用，并引起下游炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

HPS除了可激活細(xì)胞表面的病原相關(guān)模式識(shí)別受體，胞內(nèi)的模式受體(NOD1/2)也參與識(shí)別HPS。Ma B等研究發(fā)現(xiàn)，HPS感染可上調(diào)PK-15細(xì)胞NOD2的表達(dá)和RIP2的磷酸化水平，且HPS破碎上清、LPS和肽聚糖參與了該過程，繼而激活下游NF-κB信號(hào)通路的活化以及細(xì)胞因子CCL4、CCL5和IL-8的表達(dá)[28]。

3.2 HPS與細(xì)胞程序性死亡

在HPS感染豬氣管細(xì)胞的試驗(yàn)中，觀察到豬氣管細(xì)胞以caspase-3依賴的方式引起細(xì)胞凋亡；在PK-15細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，HPS細(xì)胞致死膨脹毒素CtdB引起細(xì)胞周期阻滯和p53依賴的細(xì)胞凋亡。但HPS其他成分是否可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡仍然未知。

細(xì)胞自噬是指在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下,利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)的過程。Shen Y等用不同毒力的HPS侵染豬肺泡巨噬細(xì)胞系3D4/21，發(fā)現(xiàn)HPS誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平與侵入細(xì)胞的活細(xì)菌數(shù)密切相關(guān)[29]。Yue C等也獲得類似的結(jié)果，通過激光共聚焦、Western blot和透射電鏡證明HPS感染可增強(qiáng)PK-15細(xì)胞自噬信號(hào)流表達(dá)，并利用自噬小體清除體內(nèi)侵入的細(xì)菌，抑制炎癥反應(yīng)避免對(duì)機(jī)體的損傷[30]，提示細(xì)胞自噬是一種抑制細(xì)菌感染的機(jī)體防御機(jī)制。

3.3 HPS與Wnt/β-catenin信號(hào)通路

HPS感染宿主引起內(nèi)臟器官急性炎癥反應(yīng)和廣泛性的纖維素性滲出物，但其分子致病機(jī)制尚未完全清楚。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)節(jié)動(dòng)物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其他生理過程中具有至關(guān)重要的作用[31]。Hua K等通過體內(nèi)外研究表明，HPS感染可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，上調(diào)β-catenin的表達(dá)[32]，進(jìn)而導(dǎo)致上皮細(xì)胞間隙間E-鈣黏蛋白降解，引起上皮細(xì)胞通透性的改變，造成纖維素性物質(zhì)從血管淋巴管中滲出。繼續(xù)對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的上、下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究，證實(shí)P38-MAPK通路通過阻礙DKK-1(Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑)的表達(dá)，促進(jìn)Wnt/β-catenin的活化[33]，而β-catenin則通過其靶基因(豬環(huán)氧合酶-2，COX-2)間接導(dǎo)致NF-κB活性的下降[34]。

4 展望

HPS毒力因子多且復(fù)雜，在篩選毒力相關(guān)蛋白的作用靶點(diǎn)時(shí)，只能依靠有限的文獻(xiàn)資料，并且常常得到陰性結(jié)果，因此針對(duì)HPS毒力基因的作用機(jī)制研究往往比較淺顯，大多只進(jìn)行表型試驗(yàn)，缺乏深入探討。近些年基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等組學(xué)技術(shù)得到快速發(fā)展，應(yīng)用這些新技術(shù)將極大推動(dòng)HPS毒力因子研究的發(fā)展。并且隨著人們不斷拓寬在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)，也將有助于進(jìn)一步剖析HPS的分子致病機(jī)制，為將來(lái)HPS新型防控技術(shù)和新藥研發(fā)提供參考。

疫苗和藥物治療仍然是現(xiàn)階段防控HPS的主要手段。但使用的傳統(tǒng)滅活疫苗對(duì)不同血清型，甚至同一血清型不同菌株的野毒株保護(hù)效果不佳；新研制的由單個(gè)重組蛋白制備而成的HPS亞單位疫苗往往不足以提供足夠的免疫保護(hù)力。因此，篩選多個(gè)免疫原性強(qiáng)的抗原蛋白、優(yōu)化抗原蛋白生產(chǎn)的工藝和技術(shù)、篩選表現(xiàn)優(yōu)異的免疫佐劑將是未來(lái)HPS疫苗研究的重要方向。