慢性應(yīng)激模型中脾臟的相關(guān)研究概況

師銘咸，李 琳，范宏剛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

隨著社會(huì)的發(fā)展和工作節(jié)奏的不斷加快，越來越多的人處于長期壓力之下，由此導(dǎo)致的慢性應(yīng)激相關(guān)疾病正逐漸引起科學(xué)家的廣泛關(guān)注[1]。此外，在動(dòng)物的轉(zhuǎn)運(yùn)和飼養(yǎng)中，也存在大量慢性應(yīng)激現(xiàn)象，其中，運(yùn)輸應(yīng)激和熱應(yīng)激比較常見。長途運(yùn)輸應(yīng)激使得畜禽長時(shí)間處于應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致應(yīng)激畜禽生長發(fā)育遲緩，免疫功能及生產(chǎn)性能下降，嚴(yán)重的可導(dǎo)致組織器官損傷，甚至個(gè)體死亡[2]；而長期高溫環(huán)境下飼養(yǎng)，會(huì)使畜禽體溫異常，引起熱應(yīng)激，表現(xiàn)為精神萎靡、食欲不振等[3]，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

本文簡述了慢性應(yīng)激和脾臟及其相互作用，慢性應(yīng)激狀態(tài)下動(dòng)物脾臟的免疫機(jī)制研究，并討論了目前研究面臨的問題和不足，以及對未來研究方向進(jìn)行了合理分析和展望，以期能對慢性應(yīng)激模型中脾臟的相關(guān)研究提供理論支持。

1 慢性應(yīng)激和脾臟及其相互作用

研究表明，應(yīng)激能夠顯著影響機(jī)體免疫能力，影響人和動(dòng)物的生活質(zhì)量，以及諸多疾病的發(fā)展進(jìn)程；脾臟是重要的免疫器官，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體對應(yīng)激的抵抗能力。目前，兩者的相互作用研究已逐漸成為比較醫(yī)學(xué)和動(dòng)物生產(chǎn)的熱點(diǎn)研究問題。因此，本部分從慢性應(yīng)激及相關(guān)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、脾臟的組成和功能、慢性應(yīng)激和脾臟的相互作用三部分，進(jìn)行簡要概述。

1.1 慢性應(yīng)激及相關(guān)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h3>

應(yīng)激(stress)指機(jī)體在各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會(huì)心理因素刺激下，產(chǎn)生的非特異性全身性反應(yīng)，主要分為急性應(yīng)激和慢性應(yīng)激。其中，刺激持續(xù)時(shí)間較長，且引起機(jī)體反應(yīng)持續(xù)時(shí)間也較長的應(yīng)激類型稱為慢性應(yīng)激(Chronic stress)。慢性應(yīng)激通過持續(xù)釋放神經(jīng)內(nèi)分泌激素，引起機(jī)體病理性改變，涉及心血管疾病[1]、肥胖[4]、癌癥[5]、免疫紊亂[6]，以及精神類疾病，如重度抑郁癥、雙相情感障礙和焦慮癥等[7]。目前，慢性應(yīng)激模型主要分為4類，即習(xí)得性無助慢性應(yīng)激模型、行為絕望慢性應(yīng)激模型、社交失敗慢性應(yīng)激模型以及慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型[8]。

習(xí)得性無助慢性應(yīng)激模型，是將動(dòng)物暴露在不可避免但又不可控的應(yīng)激環(huán)境下，動(dòng)物表現(xiàn)出無助、消極、類似抑郁的狀態(tài)。近年來，科研人員通過將動(dòng)物長時(shí)間置于單一應(yīng)激源下,如足部電擊[9]、寒冷環(huán)境[10]、束縛固定[11-12]、噪聲[13]等，使動(dòng)物出現(xiàn)無助的狀態(tài)。應(yīng)激動(dòng)物常表現(xiàn)為體重減輕，性行為減少，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素和皮質(zhì)酮水平升高[14]。

行為絕望慢性應(yīng)激動(dòng)物模型，包括強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)[15]和懸尾試驗(yàn)[16]。強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)，是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于一個(gè)局限的環(huán)境中，動(dòng)物在該環(huán)境中拼命掙扎試圖逃跑又無法逃脫，從而提供了一個(gè)無可回避的壓迫環(huán)境，一段時(shí)間后，動(dòng)物表現(xiàn)出典型的絕望狀態(tài)。懸尾試驗(yàn)，利用小鼠懸尾后企圖逃脫但又無法逃脫，從而放棄掙扎，進(jìn)入特有的不動(dòng)狀態(tài)，試驗(yàn)過程中記錄動(dòng)物不動(dòng)時(shí)間來反映無助、絕望狀態(tài)。

社交失敗慢性應(yīng)激模型，這種“居住者-闖入者”模式是嚙齒動(dòng)物特有的，它利用同一物種成員之間的社會(huì)沖突來產(chǎn)生心理情感壓力，能夠非常有效地模擬人類在社會(huì)活動(dòng)中所表現(xiàn)的社交困難。將1只老鼠(稱為闖入者)引入1只常駐雄性老鼠(稱為居住者)的家庭籠子中，持續(xù)數(shù)天,記錄居住者與闖入老鼠對抗的相關(guān)行為[17]，但是這種模型具有性別局限性，只發(fā)生在雄性大鼠中，因?yàn)榇菩源笫蟛粫?huì)發(fā)生此類爭斗。這種應(yīng)激模型中的大鼠常表現(xiàn)為社會(huì)交往減少和快感缺乏[18]。

慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型，每天隨機(jī)將嚙齒動(dòng)物置于不同的應(yīng)激源下，包括足部電擊、束縛、晝夜節(jié)律變化、噪聲等，制造慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型[19]，這種造模方式能夠更好地模擬人類長期處于復(fù)雜的生活環(huán)境中所表現(xiàn)出的壓力現(xiàn)象，與人們實(shí)際生活中的壓力狀況更接近[20]。應(yīng)激動(dòng)物血漿皮質(zhì)醇水平升高、糖水偏好降低[21]，運(yùn)動(dòng)能力及社會(huì)交往能力下降、探索行為能力下降、侵犯攻擊能力缺陷、性行為能力下降[22]。

4類模型僅限于造模方式不同，造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)是一致的，應(yīng)激動(dòng)物通常表現(xiàn)為快感缺乏、對獎(jiǎng)賞反應(yīng)能力下降、體重減輕、攝食攝水減少、自主活動(dòng)減少、興趣減退等狀態(tài)。行為學(xué)上，一般通過曠場試驗(yàn)和糖水偏好試驗(yàn)來判定造模是否成功[23]。同時(shí)，慢性應(yīng)激造模成功的動(dòng)物，HPA軸異常激活，生理指標(biāo)上可見多巴胺、五羥色胺水平下降，皮質(zhì)醇水平升高。其中，曠場試驗(yàn)，是評價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新奇環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法，以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新奇環(huán)境之中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時(shí)間等，反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在陌生環(huán)境中的自主行為與探究行為，以尿便次數(shù)反應(yīng)其緊張度，慢性應(yīng)激動(dòng)物在曠場實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)能力減弱、探索行為減少、緊張度增加。糖水偏好試驗(yàn)，是通過測量一定時(shí)間內(nèi)飲水瓶中水量的消耗，計(jì)算每只大鼠的糖水偏好百分比，用來評價(jià)動(dòng)物快感缺失的程度，快感缺失是慢性應(yīng)激動(dòng)物模型造模成功的標(biāo)志，慢性應(yīng)激動(dòng)物在糖水偏好試驗(yàn)中，常表現(xiàn)為糖水偏好百分比降低[24]。

1.2 脾臟的組成及功能

脾臟含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，其免疫細(xì)胞總數(shù)約占全身總量的25%，是機(jī)體行使細(xì)胞免疫和體液免疫的最大免疫器官。脾臟實(shí)質(zhì)由邊緣區(qū)、紅髓和白髓組成。當(dāng)血液中出現(xiàn)病菌和原蟲等異物時(shí)，邊緣區(qū)首先接觸抗原并引起免疫應(yīng)答，紅髓中的吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞將異體抗原吞噬，白髓發(fā)揮特異性免疫應(yīng)答功能[25]。脾臟還可以通過產(chǎn)生免疫球蛋白和補(bǔ)體等物質(zhì)，增強(qiáng)免疫作用效果。

此外，脾臟還發(fā)揮機(jī)體重要的儲(chǔ)血和輸血功能，當(dāng)機(jī)體安靜時(shí)，血液回流脾臟，脾臟行使儲(chǔ)血功能；當(dāng)機(jī)體處于運(yùn)動(dòng)、失血、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，血液流出脾臟，血容量增加，脾臟行使輸血功能。同時(shí)，脾臟也可過濾血液中的異物、病菌及衰老死亡的細(xì)胞。

1.3 慢性應(yīng)激與脾臟

研究表明，動(dòng)物發(fā)生慢性應(yīng)激后，免疫功能被抑制，機(jī)體抵抗力減弱，從而引發(fā)涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和臟器指數(shù)等病理性異常和動(dòng)物行為學(xué)變化。

在慢性冷應(yīng)激中，Balb/c小鼠脾臟內(nèi)巨噬細(xì)胞表型發(fā)生變化，吞噬能力減弱，并刺激脾臟細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)細(xì)胞因子誘發(fā)免疫抑制，證實(shí)慢性冷應(yīng)激通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能，使小鼠處于免疫抑制狀態(tài)[10]。慢性應(yīng)激除影響脾臟內(nèi)巨噬細(xì)胞形態(tài)功能外，對其他免疫器官及其內(nèi)免疫細(xì)胞同樣具有顯著作用。據(jù)報(bào)道，慢性應(yīng)激大鼠胸腺、腋窩淋巴結(jié)重量減輕，胸腺、腋窩淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和脾臟白髓島數(shù)減少，脾臟細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和淋巴細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，且應(yīng)激對淋巴器官的影響程度隨暴露時(shí)間的延長而加重[26]。

在不同的慢性應(yīng)激模型中，表現(xiàn)出相似的機(jī)體免疫抑制現(xiàn)象。長期噪音環(huán)境可引起人生理、心理和行為上的變化。為此，Zheng K C等[13]通過將Balb/c小鼠持續(xù)4周暴露于90分貝(dB)環(huán)境中，模擬慢性噪聲應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，脾臟CD4+T細(xì)胞和血清IgG減少，說明慢性噪聲應(yīng)激可抑制機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫。

在慢性冷應(yīng)激中，鵪鶉脾臟內(nèi)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、前列腺素E合成酶(prostaglandin E synthase,PTGES)、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的基因表達(dá)量增加，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和一氧化氮(nitric oxide,NO)含量顯著降低，丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量顯著增加，表明慢性冷應(yīng)激可引起鵪鶉脾臟組織炎癥損傷和氧化應(yīng)激[27]。

Van der Staay等[11]通過對比長期拴系和散養(yǎng)母豬體內(nèi)相關(guān)激素水平和動(dòng)物行為學(xué)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同組間母豬脾臟重量無明顯變化，拴系組血漿皮質(zhì)醇水平升高，并表現(xiàn)出抑郁樣癥狀，表明長期束縛應(yīng)激可紊亂體內(nèi)激素水平，并導(dǎo)致精神行為異常。

2 慢性應(yīng)激模型中脾臟的免疫機(jī)制研究

當(dāng)前，研究者主要通過在蛋白水平上篩選核心信號通路及靶點(diǎn)，以及在細(xì)胞水平上探究淋巴細(xì)胞及其亞群的生物學(xué)特性等角度，闡述慢性應(yīng)激對動(dòng)物脾臟的免疫學(xué)作用機(jī)制，這將為日后的精準(zhǔn)作用、持續(xù)監(jiān)測和治療方案的制定，提供一定的理論和實(shí)踐依據(jù)。

Hu D等[28]通過檢測慢性束縛應(yīng)激小鼠脾臟內(nèi)白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)含量，以及血清內(nèi)IL-10水平，發(fā)現(xiàn)IL-10/STAT3信號通路被顯著激活；阻斷IL-10/STAT3通路后，可顯著改善淋巴細(xì)胞凋亡，恢復(fù)T細(xì)胞輔助因子1和T細(xì)胞輔助因子2(Th1和Th2)的失衡水平，并促進(jìn)白細(xì)胞介素-12(IL-12)的生成。說明IL-10/STAT3信號通路為慢性應(yīng)激誘導(dǎo)免疫抑制的重要靶點(diǎn)。其中，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)和p38絲裂原活化蛋白酶(p38 mitogen activated protease,p38 MAPK)被證實(shí)在此通路的激活中起關(guān)鍵作用。除IL-10/STAT3信號通路外，Zhang H J等[29]發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激小鼠脾臟內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子β1/白細(xì)胞抑制因子2/3/叉頭框蛋白p3(Foxp3)(TGF-β1/Smad2/3/Foxp3)軸被顯著激活。通過抑制TGF-β1/Smad2/3/Foxp3軸或p38蛋白后，可降低淋巴細(xì)胞凋亡，下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和減輕T調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化紊亂。說明TGF-β1/Smad2/3/Foxp3通路涉及慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫抑制過程。同時(shí)，Toll樣受體9(TLR9)和p38 MAPK為激活此通路的核心功能蛋白。此外，Li H等[30]對比研究了慢性束縛應(yīng)激對TLR9基因敲除型和野生型小鼠的作用，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，TLR9缺失型血漿皮質(zhì)酮水平顯著降低，未表現(xiàn)Th1和Th2的水平失衡結(jié)果。說明TLR9的缺失抑制了慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫抑制過程。以上研究表明，IL-10/STAT3通路和TGF-β1/Smad2/3/Foxp3軸可能在慢性應(yīng)激狀態(tài)下脾臟的免疫應(yīng)答中扮演重要角色，其中細(xì)胞表面受體TLR4和TLR9以及p38 MAPK蛋白在相應(yīng)信號通路的激活中起到核心作用。

研究表明，在慢性應(yīng)激刺激下，B細(xì)胞上的2型受體(CRHR2)可與過量釋放的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)結(jié)合，從而激活諸多信號傳導(dǎo)途徑(如p38 MAPK等)，并調(diào)節(jié)B細(xì)胞活力，發(fā)揮相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)功能[31]。脾臟除含有大量B淋巴細(xì)胞外，還含有眾多的T淋巴細(xì)胞，不僅B淋巴細(xì)胞在慢性應(yīng)激的動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，T淋巴細(xì)胞及其亞群也同樣扮演著重要角色。據(jù)報(bào)道，研究人員利用流式細(xì)胞術(shù)，研究慢性束縛應(yīng)激小鼠脾臟內(nèi)CD4+CD25+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)、CD4+CD25-的效應(yīng)性T細(xì)胞(Teffs)和CD4-抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs)的生物特性，發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激可顯著增加Tregs比例，增強(qiáng)Tregs抑制活性，減弱Teffs增殖活性，降低APCs飼養(yǎng)活性，推測Tregs比例和活性的增加，協(xié)同Teffs和APCs的活性降低，可能是造成慢性束縛應(yīng)激動(dòng)物免疫功能障礙的主要原因[32]。在相關(guān)研究中，專家通過建立小鼠慢性應(yīng)激模型，監(jiān)測小鼠行為學(xué)和脾臟內(nèi)T淋巴細(xì)胞及其亞群的變化，發(fā)現(xiàn)Tregs的比例與蔗糖偏好程度呈負(fù)相關(guān)，Th17細(xì)胞的增殖與蔗糖偏好程度呈正相關(guān)，血清TGF-β水平出現(xiàn)升高，據(jù)此，研究人員推測慢性不可預(yù)知應(yīng)激小鼠的行為改變，可能與Tregs和Th17細(xì)胞的失衡密切相關(guān)，其中TGF-β可能是其中關(guān)鍵細(xì)胞調(diào)節(jié)因子[33]。

3 展望

除前面已概述的慢性應(yīng)激與脾臟的相關(guān)作用機(jī)制外，在人和動(dòng)物體中，慢性應(yīng)激很多時(shí)候會(huì)作為其他疾病的誘發(fā)因素、聯(lián)合因素、甚至進(jìn)展因素，于是，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谐霈F(xiàn)了很多復(fù)合疾病模型，如肺挫傷/失血性休克(LCHS)合并慢性應(yīng)激模型[34]，慢性不可預(yù)知環(huán)境壓力與糖尿病模型[35]等，這使得研究模型更貼近臨床實(shí)際。

脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，慢性應(yīng)激可引起機(jī)體免疫抑制，但慢性應(yīng)激與脾臟相關(guān)研究較少，致病機(jī)理尚未明確，因此，機(jī)制的研究仍是目前研究的主要方向。與此同時(shí)，可以從其他實(shí)質(zhì)性臟器慢性應(yīng)激模型研究中汲取思路以及優(yōu)化疾病模型等角度同時(shí)開展試驗(yàn)，擴(kuò)展對慢性應(yīng)激與脾臟研究的廣度和深度，為疾病治療提供更多的理論依據(jù)。