牛結(jié)核病的診斷與疫苗研發(fā)現(xiàn)狀

李瑞乾，宋阿北，魏碩彤，謝 婧，繆西鵬，馬佳睿，許立華

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分支桿菌(M.bovis)引起的一種嚴(yán)重的人獸共患傳染病。牛分支桿菌易感染牛，其次是人、禽類和野生動(dòng)物等[1]。該病主要通過呼吸道傳播，還可通過食用帶菌的生肉或乳產(chǎn)品通過消化道傳播。被感染動(dòng)物主要表現(xiàn)為逐漸消瘦、低熱并伴有咳嗽和呼吸困難等癥狀。由于我國各地牛的交易頻繁，這可能會(huì)導(dǎo)致牛結(jié)核病在我國的流行，且得不到有效的控制，影響我國畜牧業(yè)的發(fā)展并對(duì)人民的健康構(gòu)成威脅。目前，西方發(fā)達(dá)國家采取檢疫、撲殺等有效措施可有效緩解牛結(jié)核疫情[2]。近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人類對(duì)乳制品需求的增加和人民生活水平不斷提高的同時(shí)，加劇了牛結(jié)核病在全球化的快速發(fā)展。因此，全世界需要高度重視牛結(jié)核病，通過加強(qiáng)科學(xué)研究來有效抑制疫情的發(fā)生。隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，牛結(jié)核病診斷技術(shù)和疫苗種類等方面都有較大的突破。本文對(duì)牛結(jié)核病的診斷技術(shù)和疫苗的開發(fā)研制現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展具有重要的意義。

1 牛結(jié)核病常用診斷技術(shù)進(jìn)展

牛結(jié)核病的診斷是防止此病蔓延的關(guān)鍵一步，這在牛結(jié)核病的凈化上起著至關(guān)重要的作用。目前用于牛結(jié)核病診斷的方法主要有細(xì)菌學(xué)診斷方法、分子生物學(xué)檢測方法和免疫學(xué)診斷方法。

1.1 細(xì)菌學(xué)診斷方法

1.1.1 涂片染色法 涂片染色法是一種檢測快速、操作簡單的診斷方法。此方法要求實(shí)驗(yàn)人員在無菌、無污染的條件下采集可疑感染牛的病變組織進(jìn)行涂片并采用齊-尼二氏抗酸染色法染色，在顯微鏡下觀察，分支桿菌會(huì)被染成紅色，而其他細(xì)菌被染成藍(lán)色[3]。但是此方法的不足之處是實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)性不高，適合檢測數(shù)量多的組織樣品，另外，被檢樣中若有其他桿菌存在會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾[4]。所以，在結(jié)核病的診斷上先用此方法做初步檢測，再結(jié)合其他診斷技術(shù)做進(jìn)一步的復(fù)檢來提高診斷的準(zhǔn)確性。

1.1.2 細(xì)菌培養(yǎng)法 細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)含量較低的結(jié)核桿菌的組織樣都能準(zhǔn)確檢出，靈敏度較高。操作方法是采取病牛鼻腔中的分泌物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行涂片鏡檢，依據(jù)細(xì)菌的形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征可以區(qū)別牛分支桿菌與其他桿菌。不足之處在于結(jié)核桿菌的培養(yǎng)條件較高且成功率較低，容易受到外界環(huán)境的影響，導(dǎo)致結(jié)核桿菌的檢出率比較低[5]。此外，由于菌群在培養(yǎng)基上的生長速度較慢，隨后還要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和生化試驗(yàn)等一系列復(fù)雜的過程。由于這些缺點(diǎn)，此方法在臨床診斷中不被應(yīng)用，而在實(shí)驗(yàn)室診斷中常有應(yīng)用。

1.2 分子生物學(xué)診斷方法

1.2.1 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是將特定的DNA片段或cDNA片段在體外一定的條件下短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的片段的分子生物學(xué)技術(shù)，具有靈敏度高、檢測速度快、精確度高的優(yōu)點(diǎn)。目前科研人員已研發(fā)出了逆轉(zhuǎn)錄PCR、套式PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR等一系列敏感性高和特異性強(qiáng)的PCR方法。岳筠等[6]將來源于牛分支桿菌保守區(qū)域的基因合成了特異性引物，并構(gòu)建了PCR來檢測牛分支桿菌，將該方法用于鮮乳的分支桿菌檢測中，具有較強(qiáng)的特異性和敏感性。高新桃等[7]為了評(píng)價(jià)血清中細(xì)胞因子IL-17的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，以重組蛋白CFP-10-ESAT-6(CE)為刺激原初步建立了基于IL-17和IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)14頭結(jié)核陽性牛進(jìn)行檢測，其IL-17實(shí)時(shí)熒光定量PCR的陽性檢出率為85.7%，較高于IFN-γ(71.4%)的陽性檢出率。說明建立的IL-17的實(shí)時(shí)熒光定量PCR在牛結(jié)核病的診斷上具有一定潛力。白麗娟采用16S rRNA編碼基因和分支桿菌復(fù)合群菌種間具有差異的基因Rv0577、Rv3349c、RD1、RD4、RD7和RD12多位點(diǎn)結(jié)合PCR對(duì)100株分支桿菌進(jìn)行分支桿菌種及其亞種的生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，其中分支桿菌復(fù)合群(MTBC)的檢出率為8%(MTB的檢出率為7%，M.caprae的檢出率為1%，這與MPT64基因片段PCR的鑒定符合率為100%，非分支桿菌(NTM)的檢出率為92%(92/100)。程成[8]采用多位點(diǎn)PCR法對(duì)80株臨床分離株進(jìn)行菌種鑒定，其中有30株屬于MTBC，結(jié)核分支桿菌和牛分支桿菌分別占13.3%(4/30)和86.7%(26/30)，說明多位點(diǎn)PCR可重復(fù)性強(qiáng)，在分支桿菌的種和亞種的鑒定上值得推廣。張春燕等[9]為了確定牛分支桿菌適宜的PCR擴(kuò)增引物及參數(shù)，采用降落PCR來確定已報(bào)道的幾對(duì)PCR引物適宜的退火溫度(Tm)，并將不同的引物用于檢測牛分支桿菌C68001株來確定不同引物PCR的敏感性。目前，PCR技術(shù)以靈敏度高和檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)用于畜牧業(yè)中牛結(jié)核病的診斷之中，為了能夠獲得較高的準(zhǔn)確性通常與其他檢測方法結(jié)合使用。

1.2.2 DNA核酸探針檢測法 DNA核酸探針檢測法是將特異性DNA片段用特殊的示蹤劑進(jìn)行標(biāo)記作為探針，在特定的條件下與待檢樣本DNA分子上遺傳區(qū)段互補(bǔ)雜交來確定結(jié)核桿菌的種類。目前比較常用的探針有cDNA探針、全染色體核酸探針、寡聚核酸探針和克隆核酸探針等。目前，核酸探針法可以檢測和確認(rèn)出3種分支桿菌。DNA核酸探針檢測法具有操作簡單、所需樣本量少、結(jié)果易分析、敏感性和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但不足之處是需要多次雜交造成工作量較大且成本較高，在臨床上不易推廣應(yīng)用。

1.3 免疫學(xué)診斷方法

1.3.1 結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng) 結(jié)核菌素(PPD)變態(tài)反應(yīng)皮內(nèi)試驗(yàn)自被創(chuàng)立以來，一直在世界各地被廣泛應(yīng)用[10]?？乖璄SAT-6和CFP-10是結(jié)核菌素早期分泌的，為皮試反應(yīng)的首選抗原。為了提高皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測的準(zhǔn)確性，將Rv3615和Rv3020c用作ESAT-6和CFP-10的補(bǔ)充抗原[11]。該方法具有操作簡單、檢出率高的優(yōu)點(diǎn)[12]，不足之處在于感染了其他病原菌的牛會(huì)出現(xiàn)假陽性，因此特異性較差。另外，在檢測后30 d內(nèi)不能重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。目前世界較多的國家都開始選擇同時(shí)接種牛結(jié)核菌素和禽結(jié)核菌素的比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，并通過兩種結(jié)核菌素所產(chǎn)生的不同的反應(yīng)來區(qū)別牛分支桿菌的感染和其他分支桿菌的感染。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 隨著牛結(jié)核病診斷技術(shù)的發(fā)展，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在牛結(jié)核病的診斷中以操作便捷、快速和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)在牛結(jié)核病的診斷上被廣泛應(yīng)用。此方法是利用具有特異性的抗原作為ELISA的診斷抗原而建立的診斷方法。此方法不足之處在于牛分支桿菌的抗原性較弱，并與其他分支桿菌具有共同的抗原決定簇，會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)較多的假陽性而無法確定檢測結(jié)果。因此，可以選擇使用多種抗原及結(jié)合其他的診斷方法來提高診斷的敏感性和特異性。INGENASA公司建立了MPB83雙識(shí)別ELISA的方法對(duì)結(jié)核病牛進(jìn)行了診斷，其敏感性為79.4%。若與IFN-γ 檢測法聯(lián)合檢測后，其敏感度可以達(dá)到95.4%[13]。周曼麗等[14]將牛分支桿菌的重要抗原蛋白MPB70作為免疫原接種免疫Balb/c小鼠，經(jīng)過多次篩選獲得單克隆抗體。用間接ELISA對(duì)已獲得的單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定及效價(jià)分析并成功獲得了MPB70單克隆抗體，這為牛分支桿菌的檢測技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。王康等[15]將胞內(nèi)分支桿菌HBHA單克隆抗體進(jìn)行包被建立了雙抗夾心ELISA檢測胞內(nèi)分支桿菌，并檢測了菌體數(shù)量為200 CFU/mL的樣品，其準(zhǔn)確度高達(dá)93.3%(56/60)。目前，研究人員已通過抗原表位分析了分泌于牛分支桿菌細(xì)胞外的蛋白，研究發(fā)現(xiàn)位于細(xì)菌保守區(qū)域的基因Esat6和Cfp10存在比較廣泛的抗原表位，而且表達(dá)蛋白具有極強(qiáng)的抗原特異性，可能是免疫學(xué)診斷結(jié)核病的特異性抗原[16]。以上研究結(jié)果表明，開發(fā)適用于牛群的敏感而特異的ELISA診斷抗原具有廣闊的發(fā)展前景。

1.3.3 γ干擾素試驗(yàn) γ干擾素(IFN-γ)ELISA檢測技術(shù)是利用特定的牛結(jié)核刺激抗原,如提純結(jié)核菌素(PPD)與體外培養(yǎng)的致敏淋巴細(xì)胞結(jié)合時(shí)致敏淋巴細(xì)胞會(huì)分泌出大量的IFN-γ，然后進(jìn)行ELISA來檢測IFN-γ的表達(dá)水平，最后得出判定結(jié)果。目前在牛結(jié)核病的診斷時(shí)，先利用PPD變態(tài)反應(yīng)對(duì)牛只進(jìn)行初檢，對(duì)診斷為PPD陽性的牛再利用IFN-γ ELISA進(jìn)行復(fù)檢來排除假陽性牛只，這兩種診斷方法的結(jié)合可以降低奶牛的淘汰率[17]。李昕等[18]建立了牛結(jié)核IFN-γ夾心ELISA檢測方法，與PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和商品化BOVIGAMTM試劑盒同步檢測了961頭奶牛，其中IFN-γ夾心ELISA與PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的總符合率達(dá)到98.44%，與BOVIGAMTM試劑盒的總符合率達(dá)到99.58%。楊顯超[19]建立了牛結(jié)核IFN-γ ELISPOT檢測方法，經(jīng)過多次試驗(yàn)最后評(píng)價(jià)該檢測體系較為穩(wěn)定。為了比較IFN-γ檢測法的有效性，楊莉等[20]對(duì)某奶牛場的200頭奶牛分別采用IFN-γ國產(chǎn)試劑盒(KIT1)和進(jìn)口試劑盒(KIT2)進(jìn)行牛結(jié)核病診斷，結(jié)果表明二者具有較好的一致性且符合率達(dá)到95%。雖然該檢測方法較為準(zhǔn)確、有效地診斷出結(jié)核病牛，但也存在一些不足，就是對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高且檢測成本較高[21]。

1.3.4 膠體金診斷技術(shù) 當(dāng)前，免疫膠體金診斷技術(shù)作為一種新型的以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)在牛結(jié)核病的診斷上應(yīng)用比較廣泛。此診斷技術(shù)敏感性和特異性強(qiáng)，并能在短時(shí)間內(nèi)能夠得到檢測結(jié)果。王鳳江[22]采用MPB64免疫膠體金法和PCR擴(kuò)增測序法對(duì)3株標(biāo)準(zhǔn)分支桿菌和300株分支桿菌分離株進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，MPB64免疫膠體金與PCR法檢測符合率為97%，由此認(rèn)為MPB64免疫膠體金檢測技術(shù)有較高的特異性和敏感度。張銘錦[23]利用斑點(diǎn)免疫膠體晶滲濾法原理構(gòu)建了結(jié)核抗體斑點(diǎn)免疫膠體金檢測試紙條，對(duì)60只實(shí)驗(yàn)猴血清進(jìn)行了結(jié)核病診斷。結(jié)果表明該方法特異性強(qiáng)、靈敏度和準(zhǔn)確度較高，且陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均較高。由于該檢測技術(shù)起步較晚且開發(fā)的膠體金臨床檢測的試劑盒較少，目前該方法在結(jié)核病的快速診斷技術(shù)上仍然具有較大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

2 疫苗研究現(xiàn)狀

傳統(tǒng)卡介苗(BCG) 在結(jié)核病的防控上不是最佳選擇，尤其在大量牛結(jié)核病的病原菌耐藥株產(chǎn)生后，新型疫苗的研究與開發(fā)是目前牛結(jié)核病領(lǐng)域比較突出的任務(wù)。

2.1 重組卡介苗

由于卡介苗(BCG) 在傳代的過程中其毒力不斷削減的同時(shí)抗原蛋白的編碼基因也會(huì)發(fā)生突變或丟失，這使其抗原性降低。為了解決這一問題，研究人員選擇結(jié)核桿菌主要保護(hù)性抗原基因轉(zhuǎn)入質(zhì)粒等載體形成重組卡介苗(rBCG) ，使保護(hù)性抗原能夠表達(dá)并增強(qiáng)BCG的免疫效果。與BCG相比致病性分支桿菌缺少了RD-1區(qū)，RD-1區(qū)是由9個(gè)基因構(gòu)成，即Rv3871～Rv3879c。孟凡爽[24]構(gòu)建了6個(gè)RD-1區(qū)重組質(zhì)粒(pMV-261-Rv3872、pMV-261-Rv3873、pMV-261-Rv3874、pMV-261-Rv3875、pMV-261-Rv3876、pMV-261-Rv3877)，并利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得3個(gè)rBCG(rBCG:ESAT-6、rBCG:Espl、rBCG:Snm4)，將其接種于小鼠。結(jié)果顯示，免疫接種6周后試驗(yàn)組IgG水平明顯升高，細(xì)胞免疫維持較高水平且脾細(xì)胞上清液中IFN-γ的含量顯著上升，這為結(jié)核疫苗的改進(jìn)提供了新的思路。rBCG的抗原保護(hù)力超過了BCG，它具有生產(chǎn)成本低、安全、接種動(dòng)物發(fā)病率極低和穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。但不足在于rBCG與傳統(tǒng)的BCG一樣會(huì)對(duì)PPD試驗(yàn)造成干擾，且對(duì)存在免疫缺陷的個(gè)體危害性大，這限制了rBCG在牛群中的應(yīng)用，目前還未見在牛群應(yīng)用的報(bào)道。

2.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是一種通過分子生物學(xué)技術(shù)將分支桿菌菌株中毒力基因片段敲除使其毒力降低，并保留其具有免疫活性的基因片段而獲得的一種更安全的疫苗。將這種疫苗接種于動(dòng)物體內(nèi)，由于不能正常使病原菌侵襲宿主細(xì)胞所需的蛋白得到表達(dá)而降低了對(duì)機(jī)體的感染力，從而降低了對(duì)動(dòng)物的致病性而起到免疫保護(hù)作用。MTBVAC是一種敲除了基因phoP和fadD26的結(jié)核桿菌減毒活疫苗，在Ⅰ期臨床試驗(yàn)上表現(xiàn)出了令人滿意的效果，安全性和免疫原性較高。目前，MTBVAC的Ⅱ期劑量遞增試驗(yàn)將在南非進(jìn)行[25]。但是通過這種方法得到的疫苗目前面臨著較大的問題，一方面會(huì)對(duì)PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的結(jié)果造成干擾，無法區(qū)別疫苗接種和自然感染的牛，另一方面就是易毒力返強(qiáng)，對(duì)接種牛的免疫效果具有潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，在弱毒苗的研究上仍然面臨著較大的挑戰(zhàn)。

2.3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是利用致病菌有保護(hù)作用的蛋白經(jīng)分離純化配合免疫佐劑而制成的一種疫苗，可以選擇性地增強(qiáng)某些抗原的免疫應(yīng)答能力來提高接種動(dòng)物的免疫效率。近年來，有關(guān)結(jié)核病的亞單位疫苗的研究報(bào)道較多。俞琦等[26]首先將MTO和Mv聯(lián)合構(gòu)建了MTOM佐劑，然后將結(jié)核桿菌融合蛋白R(shí)v3407-Rv2626c-Ag85A-PhoY2-Ppfb(WH121)分別與Mv、MTO和MTOM混合制備出亞單位疫苗并接種于實(shí)驗(yàn)小鼠。結(jié)果表明，Mv和MTO混合的佐劑MTOM既能增強(qiáng)Th1型細(xì)胞反應(yīng)，還能夠誘導(dǎo)IL-2陽性多功能T細(xì)胞，該疫苗可以用于研發(fā)牛結(jié)核病的候選疫苗。為了篩選安全、有效的抗結(jié)核桿菌感染的亞單位疫苗，王磊等[27]選擇了Ag85a、Rv3802c、Rv0394c、Rv0199、Rv2660c、Rv0125、Mpt51、TB10.4和Omp A 9個(gè)結(jié)核桿菌的重要抗原，將每3個(gè)抗原進(jìn)行融合(共分7組)表達(dá)并與不完全佐劑和沙門氏菌混合后皮下免疫接種小鼠。結(jié)果表明，以上融合蛋白均能刺激小鼠產(chǎn)生較高水平的抗體，具有較強(qiáng)的免疫原性，這個(gè)試驗(yàn)為結(jié)核病亞單位疫苗的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，是當(dāng)今牛結(jié)核病疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

2.4 活載體疫苗

活載體疫苗是一種利用基因工程技術(shù)將常用病毒中與毒力有關(guān)的基因進(jìn)行敲除而得到能夠插入外源基因的病毒載體，在接種于動(dòng)物機(jī)體后具有免疫原性的蛋白能夠引起機(jī)體免疫效應(yīng)。具有低成本、較穩(wěn)定、免疫方式簡單和效率高的優(yōu)點(diǎn)。目前常用的病毒載體主要有腺病毒和痘病毒。劉鑫等[28]將牛分支桿菌的Ag85A抗原導(dǎo)入載體L.Lactis NZ3900，通過灌胃途徑接種小鼠，能產(chǎn)生局部的免疫應(yīng)答反應(yīng)和高水平的slgA抗體。Li W等[29]構(gòu)建了能夠表達(dá)分支桿菌融合蛋白(AG85A、AG85B、CFP10和ESAT6)的腺病毒活載體Ad5-CEAB，滴注于試驗(yàn)小鼠鼻內(nèi)，起到了良好的免疫保護(hù)作用。AERAS-485/MVA85A是一種能夠表達(dá)結(jié)核桿菌抗原Ag85A的重組痘病毒，針對(duì)MVA85A的兩個(gè)臨床Ⅱ型試驗(yàn)均表現(xiàn)出了良好的免疫原性和耐受性，但沒有表現(xiàn)出明顯的免疫應(yīng)答性，沒有起到顯著保護(hù)結(jié)核桿菌的感染的效果[30]。有些重組活載體疫苗無論是在安全性上還是在免疫保護(hù)性上都表現(xiàn)出優(yōu)于BCG的效果，但是并沒有表現(xiàn)出完全抵抗或清除體內(nèi)結(jié)核桿菌的能力。因此，研發(fā)更有效預(yù)防結(jié)核疫苗還需要科研人員的不懈努力。

2.5 DNA疫苗

DNA疫苗與其他疫苗相比是一種相對(duì)先進(jìn)的新型抗結(jié)核疫苗，也是目前牛結(jié)核病的第三代疫苗。該疫苗的原理是通過外源質(zhì)粒作為載體將牛分支桿菌中具有免疫原性的基因片段進(jìn)行重組，將這種重組基因通過各種技術(shù)導(dǎo)入動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)并分泌出抗原蛋白，從而刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生一系列免疫應(yīng)答，利用這種機(jī)制來達(dá)到預(yù)防牛結(jié)核病的目的。該疫苗具有安全性高、成本低、易操作且不干擾PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，在牛結(jié)核疫苗的研究上具有廣闊的前景。

目前，將能夠表達(dá)幾種蛋白的基因通過融合構(gòu)建表達(dá)載體獲得的DNA疫苗是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。粟海波等[31]基于質(zhì)粒A39構(gòu)建了V569(p-VAX1-Ag85B-Rv3425-PPE26-Rv2029c)DNA疫苗，對(duì)其免疫原性和保護(hù)性做初步研究，結(jié)果顯示，V569能夠提高小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng)(IFN-γ分泌水平較高)，外周血液CD4+/CD8+T細(xì)胞比例顯著升高，表明V569DNA疫苗可能是一種抗結(jié)核感染的DNA候選疫苗。Yan L等[32]構(gòu)建了Rv3407DNA疫苗，并在試驗(yàn)小鼠上做了比較試驗(yàn)。結(jié)果顯示，Rv3407DNA組中的IgG抗體水品顯著升高，且出現(xiàn)了較顯著的抗原特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫。JIANSONG T等[33]通過密碼子優(yōu)化構(gòu)建了BERoptDNA疫苗，通過體內(nèi)電穿孔免疫Balb/c小鼠，誘導(dǎo)了外周血中分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞，可以保護(hù)Balb/c小鼠免受高劑量致病性結(jié)核分支桿菌的攻擊。因此，這種新型DNA疫苗具有較好的免疫原性和保護(hù)性，這在預(yù)防結(jié)核分支桿菌和免疫療法上具有廣闊發(fā)展前景。DNA疫苗的不足之處在于單一抗原對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)性不如BCG，而多價(jià)融合的DNA疫苗具有理想的免疫效果。大多數(shù)DNA疫苗在小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上具有良好的免疫保護(hù)效果，而在牛上并不產(chǎn)生同樣理想的效果，這一問題是牛結(jié)核病DNA疫苗有待突破的關(guān)鍵。

3 展望

目前，世界各國都高度重視此病的預(yù)防和凈化，并出臺(tái)了一系列的應(yīng)對(duì)措施。雖然用于診斷牛結(jié)核病的方法并不唯一，但是目前并沒有哪一種方法可以獨(dú)立、快速、準(zhǔn)確有效地診斷牛結(jié)核病。因此，需要將各種診斷牛結(jié)核病的技術(shù)進(jìn)行結(jié)合使用，這樣來提高單一診斷方法的不足，從而可以提高診斷的準(zhǔn)確性和靈敏度。另外，開發(fā)操作簡單、快速、準(zhǔn)確和特異性強(qiáng)的牛結(jié)核檢測技術(shù)是今后牛結(jié)核病診斷方面的重要課題。近年來科研人員研制出的亞單位疫苗、滅活苗以及核酸疫苗雖然在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上起到了很好的免疫保護(hù)作用，但這些疫苗在牛群中免疫效果不盡相同，且在安全性和有效性方面還得不到可靠的保證。所以，還需要更加深入的研究，以期為牛結(jié)核病的預(yù)防提供合適、有效的疫苗,以期為根除牛結(jié)核病提供技術(shù)支撐。