光動力療法抗皮膚感染性疾病的研究進展

楊春燚 ， 張躍平 ， 王麗仰 ， 張 迪 ， 林德貴

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

1 光動力療法的概念及原理

光動力療法(Photodynamic therapy，PDT)是指利用光敏劑和特定波長的光源，產(chǎn)生具有細胞毒性的物質(zhì)，進行細胞殺傷作用的療法；是一種非侵入性、副作用較小的治療方式。該療法利用具有光敏作用的光敏劑，在吸收特定波長的光能后躍遷到第一激發(fā)狀態(tài)(First excited singlet-state，S1)，成為單線態(tài)光敏劑。單線態(tài)光敏劑分子不穩(wěn)定，可以通過2種不同的弛豫過程回到基態(tài)：(1)單線態(tài)光敏劑放出所吸收的能量，直接從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，同時發(fā)出熒光；(2)激發(fā)態(tài)光敏劑通過系間竄越失去部分能量，躍遷至激發(fā)三線態(tài)(Excited triplet state，T1)。三線態(tài)光敏劑可與底物或周圍的基態(tài)氧分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生具有細胞毒性的超氧化物或單線態(tài)氧，從而對局部的病原菌或腫瘤細胞等進行殺傷作用[1]，三線態(tài)光敏劑回到基態(tài)同時釋放出磷光(封三彩版圖1)。雖然光動力療法的細胞毒性作用是非特異性的，但有研究表明，在體外試驗中，使用亞甲藍作為光敏劑對角質(zhì)細胞的殺傷速率比對常見的皮膚微生物的殺傷速率慢18～200倍，說明對于病原微生物具有殺傷作用的治療劑量不會對皮膚角質(zhì)細胞產(chǎn)生明顯的毒性作用[3]。

2 光敏劑

光敏劑是光動力療法中重要的元素，一個合格的光敏劑需要具備低細胞毒性、無致畸性、選擇性強等特點。目前最常用的光敏劑主要分為三類：吩噻嗪類、卟啉類和酞菁類。具有代表性的吩噻嗪類光敏劑包括亞甲藍(Methylene blue，MB)、甲苯胺藍(Toluidine blue，TBO)等。該光敏劑多以陽離子形式存在，可吸附在帶負電荷的細胞膜上，在光照條件下直接損傷細胞膜誘導(dǎo)細胞死亡。卟啉類光敏劑分兩代，血卟啉衍生物、二血卟啉醚均為一代，但因為其在體內(nèi)滯留時間長，治療后需要長時間的避光且治療深度有限等缺點而逐漸被第2代卟啉類光敏劑所取代。第2代卟啉類光敏劑包括二氫卟酚、苯卟啉衍生物等。5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)本身不具備光活性，但可在體內(nèi)轉(zhuǎn)換為原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，PpⅨ在特定波長的光照下能產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧而產(chǎn)生抗菌作用。

新型光敏劑多在上述幾類光敏劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進行改構(gòu)提高其功效。近期也有不少使用植物提取物作為光敏劑的研究，如姜黃素、葉綠素。由于一些光敏劑的水溶性低、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、生物利用度低等問題，也有使用脂質(zhì)體或納米顆粒包裹光敏劑以提高其利用度和選擇性。

3 光源

光源的選擇對于光動力療法來說也是需要考慮的一個重要因素，包括光源的光譜范圍、組織穿透性、能量密度等。激光由于其單色性好、相干性好、能量密度高等特點在光動力療法中發(fā)展成為一種標(biāo)準(zhǔn)的治療光源。隨著半導(dǎo)體工業(yè)的發(fā)展，發(fā)光二極管(Light-emitting diode，LED)憑借其價格優(yōu)勢，在光動力療法領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用，并且有許多研究表明，在實際光動力療法中LED光源與激光具有近似的療效[4]。最近幾年，也有學(xué)者注意到室內(nèi)日常燈光引起的光敏現(xiàn)象，有研究顯示，與LED光源相比，家用光源在較高的光能劑量時也能產(chǎn)生顯著的抑菌效果。這也表明使用家用光源可能是一種經(jīng)濟且治療更方便的抗菌治療方法[5]。

4 光動力療法抗微生物治療

4.1 光動力療法在抗皮膚細菌感染中的應(yīng)用 細菌性皮膚病是由細菌感染及細菌毒素侵襲導(dǎo)致的皮膚病變，引起的皮膚化膿性感染。在人醫(yī)臨床上最常見的皮膚致病菌為金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、A族鏈球菌。在小動物臨床，細菌性皮膚病在犬貓中也較為常見。細菌性皮膚病對動物的損傷可涉及到表皮，甚至真皮或皮下深層組織結(jié)構(gòu)，因此，可劃分為表面、淺層和深層的細菌性皮膚病。在犬細菌性皮膚病病例中，常分離出的病原菌為偽中間葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、化膿性棒狀桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和奇異變形桿菌等。由于臨床抗生素的濫用，導(dǎo)致細菌耐藥問題越來越嚴重。目前已有不少研究者在探索光動力療法對于皮膚致病細菌的抑制作用。近幾年光動力療法治療細菌感染性皮膚病的相關(guān)研究顯示，PDT對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有不同程度的抗菌作用，在動物試驗以及臨床治療中也表現(xiàn)出良好的療效。

Bae等[6]使用LED藍光，配合5-ALA，通過體外平板菌落計數(shù)、測定生長曲線以及熒光染色的方法，測定光動力療法對6株臨床分離的偽中間型葡萄球菌的抑菌效果。結(jié)果中比較有趣的一個發(fā)現(xiàn)，就是單純ALA治療無抑菌作用，而單純藍光治療組顯示隨著光照時間增長細菌的存活率逐漸降低，在照射90 min后存活率降低到4.3%，說明LED藍光對于偽中間型葡萄球菌就存在較強的殺傷作用；在配合光敏劑后，同等的照射時間細菌的存活率降低到2.14%。由于自制光源功率小，需要較長的治療時間，因此也有學(xué)者使用商品化的光源進行試驗。Schnedeker等[7]使用MR4 ACTIVet PRO的56.25、112.5 J/cm2和225 J/cm2三個劑量的光能，分別對甲氧西林敏感型偽中間型葡萄球菌(Meticillin-susceptibleStaphylococcuspseudintermedius，MSSP)、耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌(Meticillin-resistantStaphylococcuspseudintermedius，MRSP)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Meticillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)進行照射，觀察其抑菌作用。結(jié)果表明，藍光對于MRSA的抑菌效果良好，在112.5 J/cm2的光能劑量下，即可達到100%的抑菌；但對于MSSP和MRSP的抑菌率僅為11.7%和21.2%。這與之前Bae等[6]的結(jié)果并不完全一致，筆者認為可能是不同的菌株造成的試驗差異。

4.2 光動力療法在抗真菌感染中的應(yīng)用 皮膚癬菌是引起淺部真菌感染最常見的致病菌，在人醫(yī)臨床最常見的致病菌包括紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌等。而在小動物臨床，皮膚癬菌感染也是最常見的感染性皮膚病之一，犬小孢子菌、須癬毛癬菌和石膏樣小孢子菌是小動物臨床上最常分離出的3種病原菌。皮膚癬菌侵襲皮膚后，真菌侵襲毛發(fā)與皮膚角蛋白，主要臨床表現(xiàn)為脫毛、紅斑、患部出現(xiàn)大量皮屑，以及不同程度的瘙癢，有一些病例還會出現(xiàn)真菌性結(jié)節(jié)或肉芽腫。對皮膚癬菌常用的治療方法包括局部外用和/或全身系統(tǒng)用藥。系統(tǒng)性用藥通常包括唑類、多烯類、丙烯胺類等抗真菌藥物。但由于皮膚癬菌感染的病程長，長期口服抗真菌藥物存在肝損傷的風(fēng)險。因此，在傳統(tǒng)真菌療法存在上述問題的情況下，國內(nèi)外研究者也在不斷探索新的治療手段，利用光動力療法治療皮膚癬菌病就是其中之一。

Jochen等[8]使用姜黃素作為光敏劑，研究其對犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、指間毛癬菌、紅色毛癬菌、絮狀表皮癬菌、斷發(fā)毛癬菌共6種真菌的體外抑菌作用，測定其光照前后的OD620，并制作生長曲線。這6種真菌作為親人性、親動物性和親土壤性真菌的代表菌種，每個菌種各選取3個菌株作為平行對照。結(jié)果表明，單純姜黃素作用對于石膏樣小孢子菌在試驗的最高濃度(5.4 mg/L)有輕微的抑制作用，而對于其他5種真菌均沒有明顯的抑制作用；而當(dāng)姜黃素濃度為5.4 mg/L時，配合藍光治療對6種菌株均能產(chǎn)生明顯的抑制作用。黃望強等[9]利用δ-氨基酮戊酸(ALA)測定光動力療法對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌和白色念珠菌3株標(biāo)準(zhǔn)菌株的殺傷作用，結(jié)果表明，當(dāng)ALA濃度為100 mmol/L時，抑菌率分別為(72.0±4.5)%、(76.4±2.0)%和(67.6±8.7)%；單純光敏劑和單純光照組對3株真菌生長無明顯抑制作用。通過透射電鏡觀察ALA-PDT作用后的3株真菌，發(fā)現(xiàn)其細胞壁、細胞膜及細胞器均受到不同程度的破壞。

雖然有不少關(guān)于光動力療法抗真菌的體外試驗，但在動物體內(nèi)以及臨床直接進行試驗的相關(guān)文獻還比較少。Baltazar等[10]利用紅色毛癬菌感染的小鼠模型，通過皮膚組織病理切片、活性氧測定等方法，檢測甲苯胺藍-紅光的治療效果，證明了使用LED紅光和甲苯胺藍的光動力療法減少了小鼠皮膚內(nèi)的真菌負載，并且ROS含量明顯高于未治療組，ROS在降低真菌生存能力和防止真菌損傷宿主組織方面具有重要作用。在人醫(yī)臨床將ALA-光動力療法應(yīng)用于趾甲甲癬患者，治愈率約為73.3%(n=22)[11]， 但在隨訪中也存在復(fù)發(fā)的問題。說明光動力療法治療皮膚癬菌雖然具有療效好、起效快的優(yōu)點，但是也存在易復(fù)發(fā)的問題，可能需要調(diào)整孵育時間、治療周期加強治療效果。

5 光動力療法在小動物臨床上的應(yīng)用和展望

雖然光動力療法在人醫(yī)中已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多疾病，但在小動物臨床的研究還比較少。犬小孢子菌雖為犬貓臨床皮膚癬菌感染中最常見的病原真菌，但對于其光動力研究也比較少，筆者目前僅看到Jochen等[8]使用姜黃素-PDT探究了其對犬小孢子菌的體外抑菌效果，但仍缺少體內(nèi)試驗證明其確切療效。光動力療法對于不同病原菌的療效也不同，現(xiàn)有的體外試驗雖顯示有明顯的抑菌殺菌作用，但由于體內(nèi)外試驗存在差異，因此仍需探索光動力療法的具體流程。同時，為了增加光敏劑的滲透性以及皮膚粘附性來提高其殺菌效果，可能還需要使用凝膠、膏劑、透皮劑等藥物，來減少治療的次數(shù)。研究表明，Tris-EDTA能增加革蘭陰性菌的細胞膜通透性，增加細菌對藥物的吸收，從而達到更好的殺菌作用。因此其也可以作為一種抗菌輔助劑應(yīng)用于光動力療法中。

對于人獸共患的病原菌，使用新型的治療方法，減少抗生素的使用，能有效防止耐藥菌的產(chǎn)生以及二重感染等問題，具有積極的公共衛(wèi)生意義。光動力療法作為一種新興的抗菌療法，具有非特異性殺傷作用且與現(xiàn)有的抗菌藥物作用機理不盡相同。雖然現(xiàn)在還有很多治療條件需要摸索，但相信隨著研究的深入，光動力療法在臨床的應(yīng)用將逐漸被認可以推廣，光動力療法在抗感染治療上必將發(fā)揮越來越大的作用。