間質(zhì)干細(xì)胞在寵物臨床應(yīng)用的研究進展

楊嘉麗 ， 關(guān)鈺澄 ， 張詩薇 ， 劉亞駒 ， 李少川 ， 石達(dá)友

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 廣東 廣州 510642)

據(jù)2016年底統(tǒng)計，美國有大約57%的家庭養(yǎng)寵物，犬貓是最受歡迎的飼養(yǎng)選擇。寵物疾病的相關(guān)癥狀、自然病史、病理學(xué)、環(huán)境危險因素以及對藥物的反應(yīng)在一定程度上類似于人類的疾病，基因相關(guān)性比嚙齒類動物更敏感[1-2]。當(dāng)前寵物間質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)療法主要臨床應(yīng)用研究包括關(guān)節(jié)疾病、神經(jīng)肌肉疾病、皮膚疾病、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)、干燥性角膜結(jié)膜炎(Keratoconjunctivitis sicca，KCS)、肛周瘺、心肌病、慢性腎病(Chronic kidney disease，CKD)、腦膜炎等，試驗動物主要為犬。

干細(xì)胞是一類具有不同程度自我更新和分化潛能的細(xì)胞。根據(jù)發(fā)育階段，可分為胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)和成體干細(xì)胞(Adult stem cells，ASCs)。ESCs的臨床應(yīng)用受到倫理道德的限制，目前普遍使用的MSCs是ASCs的一種。MSCs具有低免疫原性，成瘤性爭議低。MSCs來源豐富，骨髓來源間質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs)含量最多，脂肪來源間質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs)取材方便，因而兩者被研究得最多。MSCs在不同組織中含量、增殖能力、免疫調(diào)節(jié)能力不同，動物年齡和獲取位置也與性能相關(guān)。國際細(xì)胞療法協(xié)會(International Society for Cellular Therapy，ISCT) 在2006年提出了MSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)：在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下具有貼壁性；表達(dá)特異性表面抗原，高表達(dá)(≥95%)CD105、CD73、CD90，低表達(dá)(≤2%)CD45、CD34、CD14或者CD11b、CD79α或者CD19、HLA-DR；在體外具有多分化潛能，可分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)的MSCs作用機制包括多向分化潛能、生物活性物質(zhì)、免疫調(diào)節(jié)作用、細(xì)胞間物質(zhì)傳輸和表觀遺傳學(xué)調(diào)控[4]。

1 間質(zhì)干細(xì)胞在寵物的臨床應(yīng)用

1.1 關(guān)節(jié)疾病

1.1.1 關(guān)節(jié)炎 退行性關(guān)節(jié)疾病(Degenerative joint disease，DJD)也稱骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)，是一種由于關(guān)節(jié)軟骨損傷、關(guān)節(jié)周圍出現(xiàn)退行性和增生改變的慢性進程性關(guān)節(jié)疾病。滕鑫[5]發(fā)現(xiàn)，直接移植犬原代 AD-MSCs 到關(guān)節(jié)腔進行修復(fù)軟骨組織缺損具有可行性。Vilar等[6-7]關(guān)節(jié)內(nèi)注射AD-MSCs治療犬嚴(yán)重髖關(guān)節(jié)疾病，臨床癥狀改善且認(rèn)為最大效果的維持時間少于3個月。張貝瑩等[8]認(rèn)為，臍帶血間質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical cord blood mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)能明顯抑制關(guān)節(jié)損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。Cuervo等[9]表示，單獨使用AD-MSCs治療犬髖關(guān)節(jié)炎，在6個月的時候比單獨使用富含生長因子的血小板(Platelet rich in growth factor，PRGF)的作用更好。

1.1.2 股骨壞死 無菌性股骨壞死又稱累卡佩氏病，通常是因髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良造成的股骨缺血性壞死，多發(fā)于小型犬。林飛太等[10]認(rèn)為，多孔陶瓷支架是良好的組織工程支架材料，結(jié)構(gòu)與自然骨接近，聯(lián)合自體BM-MSCs移植更能有助骨修復(fù)，具有更好的抗壓強度。

1.2 神經(jīng)肌肉疾病

1.2.1 脊髓損傷 椎間盤疾病(Intervertebral disc disease，IVDD)是犬常見的退行性脊髓疾病，MRI是診斷IVDD的重要診斷工具，在發(fā)展為礦化病變前，可檢查早期的退行性病變，優(yōu)于CT和X線。Hiyama A等[11]探討自體AD-MSCs移植量對IVDD的療效影響，發(fā)現(xiàn)106MSCs移植量的狀態(tài)下，髓核細(xì)胞存活率高，細(xì)胞外基質(zhì)和微結(jié)構(gòu)環(huán)境是最好的。Bhat等[12]把44例犬脊髓損傷臨床病例分為傳統(tǒng)治療組和傳統(tǒng)藥物結(jié)合異體BM-MSCs治療組，結(jié)果顯示，結(jié)合BM-MSCs治療組的神經(jīng)學(xué)檢查綜合評分最高。但是多數(shù)試驗結(jié)果顯示，椎間盤MRI成像沒有明顯差異。

1.2.2 神經(jīng)損傷 神經(jīng)損傷的自我修復(fù)能力往往有限，因MSCs具有多分化潛能的優(yōu)點，為神經(jīng)修復(fù)帶來良好前景。劉玉梅等[13]通過MTT 法篩選褪黑激素(Melatonin，MT)促AD-MSCs增殖至最佳濃度，結(jié)果顯示，50 nmol/L MT聯(lián)合AD-MSCs治療組的犬脊髓神經(jīng)參數(shù)良好，表明MT預(yù)處理AD-MSCs顯著提高了犬坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)效果。

1.3 皮膚疾病 意外創(chuàng)傷、部分內(nèi)分泌疾病和免疫系統(tǒng)疾病造成的皮膚損傷難以愈合，而免疫抑制藥物存在不良反應(yīng)的風(fēng)險，干細(xì)胞或許是新的治療方法。犬臨床研究表明，MSCs具有促進皮創(chuàng)傷愈合的趨勢，可減少炎癥反應(yīng)，增強mRNA表達(dá)，促進細(xì)胞增殖和血管形成[14-16]。Nam等[17]通過靜脈和肝實質(zhì)注射AD-MSCs治療1例犬肝病導(dǎo)致的淺表性壞死性皮炎，治療初期整體狀態(tài)改善，皮膚病灶縮小甚至消失，但后來由于肝病進展性惡化，患犬死亡。Han等[18]對1例類固醇難治性落葉型天胞瘡使用AD-MSCs進行治療，發(fā)現(xiàn)皮膚改善，潑尼松龍使用劑量減少。

1.4 炎癥性腸病 炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)一般是通過排除法診斷，是犬貓常見疾病，易復(fù)發(fā)，需要長期的藥物治療和飲食調(diào)理。Pérez-Merino等[19-20]對靜脈給予同源異體AD-MSCs治療犬IBD進行研究，結(jié)果表明，組織學(xué)病變得到改善，臨床評分除了C-反應(yīng)蛋白沒有下降，其他評分均有所改善。Webb等[21]對慢性腸下垂超過3個月的貓進行同源異體AD-MSCs治療研究，試驗組臨床得分改善，71%貓臨床癥狀明顯改善甚至消失。不過，該研究缺乏白蛋白、維生素B12、葉酸試驗數(shù)據(jù)。盡管如此，MSCs對腸道絨毛的再生有著顯著作用，有助腸道修復(fù)。

1.5 干燥性角膜結(jié)膜炎 干燥性角膜結(jié)膜炎(Keratoconjunctivitis sicca, KCS)又稱干眼癥，是淚腺功能異常導(dǎo)致淚液分泌失衡的疾病。常用治療藥物為抗生素、人工淚液和免疫抑制藥物，但容易反復(fù)發(fā)作，且部分藥物昂貴，MSCs或許可以成為替代治療。Villatoro等[22]探究對KCS犬第三眼瞼淚腺附近和圍繞第三眼瞼腺體注射不同劑量同源異體AD-MSCs的療效，結(jié)果顯示，所有測定結(jié)果均改善，病程沒有惡化。Bittencourt等[23]在主淚腺和第三眼瞼腺體注射同源異體AD-MSCs治療犬KCS，研究結(jié)果顯示，MSCs比免疫抑制藥物的治療效果好，有效持續(xù)時間長。

1.6 肛周瘺 犬肛周瘺是肛周組織發(fā)生潰瘍和成瘺的疾病，高發(fā)于德國牧羊犬[24]，可能與其大汗腺數(shù)量多有關(guān)，偶爾和IBD并發(fā)。犬肛周瘺類似于人類克羅恩氏病，免疫抑制藥物和支持療法是主要治療手段，但是復(fù)發(fā)率高。Ferrer等[25]評估人胚胎干細(xì)胞源性間質(zhì)干細(xì)胞(Human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells，hESC-MSCs)治療犬肛周瘺的療效，結(jié)果顯示，犬IL-2和IL-6水平下降，3個月后所有犬的肛周瘺均完全閉合，但其中2只犬復(fù)發(fā)，表明hESC-MSCs具有治療潛能，安全性良好。

1.7 心肌疾病

1.7.1 犬?dāng)U張型心肌病 犬?dāng)U張型心肌病(Dilated cardiomyopathy，DCM)以心腔擴張和腔壁變薄為主要病變，導(dǎo)致心輸出量減少，容易誘發(fā)充血性心力衰竭，主要影響大型犬，杜賓犬是高發(fā)品種。Pogue等[26]采用酪氨酸突變重組腺相關(guān)病毒2-基質(zhì)細(xì)胞來源因子-1轉(zhuǎn)導(dǎo)AD-MSCs，行冠狀靜脈注射治療杜賓犬?dāng)U張型心肌病，除了1只犬在注射24 h后出現(xiàn)心室纖維性顫抖死亡外，其余犬只在隨后2年研究期間沒有出現(xiàn)并發(fā)癥，平均存活時間為620 d。

1.7.2 心肌梗死 心肌梗死是因冠狀動脈閉塞導(dǎo)致以缺血性心肌壞死為主的疾病。楊亞等[27]進行多功能心腔內(nèi)導(dǎo)管移植 BM-MSCs治療犬心肌梗死，可促進血管再生，減少非梗死區(qū)膠原沉積。近年研究[28-29]表明，超聲介導(dǎo)微泡破壞聯(lián)合BM-MSCs能促進歸巢，使心肌梗死面積縮小，改善心功能。

1.8 慢性腎病 慢性腎病(Chronic kidney disease, CKD)是貓常見疾病，多數(shù)貓CKD的進程不可逆轉(zhuǎn)，一旦發(fā)生很難根治。Quimby等[30-31]發(fā)現(xiàn)，冷藏保存脂肪組織分離的AD-MSCs安全性比冷藏保存的AD-MSC更高，且注射劑量應(yīng)謹(jǐn)慎。一項對貓CKD自體AD-MSCs靜脈注射治療的40例臨床案例回顧表明，MSCs療法風(fēng)險低，長達(dá)330 d的隨訪沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)[32]。

1.9 腦膜腦炎 腦膜腦炎是犬貓常見的顱部疾病，根據(jù)其病變區(qū)域而表現(xiàn)不同的神經(jīng)癥狀。Zeira 等[33]評估BM-MSCs治療類固醇難治性犬未明原因的腦膜腦脊髓炎 (Meningoencephalomyelitis of unknown origin，MUO)的安全性和療效，結(jié)果顯示，對MUO的犬靜脈、動脈、鞘內(nèi)注射自體BM-MSCs均安全，沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)，且鞘內(nèi)和動脈內(nèi)注射比鞘內(nèi)和靜脈內(nèi)注射反應(yīng)時間更快?；既窠?jīng)學(xué)檢查結(jié)果改善，部分犬的MRI圖像顯示，經(jīng)治療后沒有明顯差異。

2 展望

目前，寵物干細(xì)胞臨床研究興起，再生醫(yī)學(xué)療法對于寵物關(guān)節(jié)疾病、神經(jīng)肌肉疾病、皮膚疾病的療效得到越來越多肯定。干細(xì)胞越來越多的被用于傳統(tǒng)無法治療的疾病，或許可以提供一個治療的新方向。但各臨床研究的MSCs治療方案不一致，難以進行客觀分析。未來需要優(yōu)化方案，這涉及采集和培養(yǎng)的技術(shù)，增強MSCs歸巢和旁分泌能力，抑制細(xì)胞凋亡進程。干細(xì)胞的成瘤性、生產(chǎn)技術(shù)、長期安全性等問題還有待解決，需要多學(xué)科領(lǐng)域共同努力。