奶牛肝臟功能及其免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展

牛 慧 童津津 熊本海 蔣林樹*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

肝臟是奶牛重要的營養(yǎng)代謝、解毒以及免疫器官。肝臟在奶牛乳腺組織合成乳過程中提供了主要的糖異生作用產(chǎn)物，同時(shí)在脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝中也發(fā)揮著核心作用[1]。在奶牛代謝過程中，來自于消化道中的營養(yǎng)物質(zhì)以及微生物抗原物質(zhì)等經(jīng)門靜脈到達(dá)肝臟，還有一部分抗原物質(zhì)隨富含氧的血液經(jīng)肝動(dòng)脈到達(dá)肝臟，激活肝臟的免疫防御機(jī)制。目前已發(fā)現(xiàn)多種疾病與奶牛的肝臟免疫相關(guān)。Byrne等[2]研究發(fā)現(xiàn)，肝吸蟲感染奶牛肝臟后，對奶牛免疫應(yīng)答以及奶牛分枝桿菌結(jié)核病的診斷存在一定的干擾作用。常廣軍等[3]研究表明，飼喂高精料飼糧導(dǎo)致的奶牛亞急性瘤胃酸中毒(SARA)與肝臟免疫基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化率降低、肝臟免疫相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。Trevisi等[4]指出，可以通過監(jiān)測泌乳早期肝臟炎癥反應(yīng)的生物標(biāo)志物，如C反應(yīng)蛋白(CRP)、銅藍(lán)蛋白(CP)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、結(jié)合珠蛋白(Hp)來監(jiān)測奶牛的健康狀況，以維持奶牛較高的生產(chǎn)性能。

肝臟中的枯否氏細(xì)胞(Kupffer cell，KC)、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)、樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)等構(gòu)成了肝臟的非實(shí)質(zhì)部分。肝細(xì)胞是肝臟實(shí)質(zhì)部分的基本組成單位，其主要通過表達(dá)并分泌大量的天然免疫蛋白進(jìn)入血液來抵御微生物的入侵[5]。這些蛋白質(zhì)包括具有殺菌作用的補(bǔ)體蛋白(complement proteins，CP)，增強(qiáng)吞噬作用的免疫調(diào)理素(immune opsonin，IO)，調(diào)節(jié)脂多糖(LPS)信號(hào)的可溶性因子，以及激活天然免疫的凝血因子纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)G)。肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞連同肝細(xì)胞參與復(fù)雜的局部和全身免疫功能。來自肝動(dòng)脈和門靜脈的大量血液經(jīng)過肝臟濾過之后，廢棄物以及毒害物質(zhì)由膽汁排到腸道，隨糞便排出體外。此外，肝臟在肝-腦軸中占有關(guān)鍵位置，這一神經(jīng)軸主要通過維持奶牛各項(xiàng)生理功能正常運(yùn)行，特別是調(diào)控奶牛肝臟合成葡萄糖、維持血糖穩(wěn)態(tài)來發(fā)揮作用。

1 肝臟中的免疫相關(guān)細(xì)胞

1.1 枯否氏細(xì)胞

枯否氏細(xì)胞是一種巨噬細(xì)胞，存在于肝血竇內(nèi)，其占天然巨噬細(xì)胞總數(shù)的80%～90%[6]，是抵御來自門靜脈血液中免疫反應(yīng)性物質(zhì)的第1道防線?？莘袷霞?xì)胞通過模式識(shí)別受體如Toll樣受體(TLRs)、RIG-Ⅰ樣受體(RLRs)、NOD樣受體(NLRs)和C型凝集素受體(CLRs)，識(shí)別病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式[7]。當(dāng)枯否氏細(xì)胞被激活后釋放各種細(xì)胞因子、趨化因子以及可溶性生物介質(zhì)。Toll樣受體4(TRL4)在內(nèi)毒素的識(shí)別以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用。在LPS型奶牛乳腺炎中，LPS誘導(dǎo)TLR4激活后，通過髓系分化因子88(MyD88)依賴和非依賴途徑，誘導(dǎo)核因子-κB(NF-κB)與促炎基因的結(jié)合，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的產(chǎn)生[8]。在奶牛處于SARA狀態(tài)時(shí)，NOD樣受體1(NLR1)被肽聚糖的降解產(chǎn)物二氨基庚二酸(DAP)激活，使同型的半胱天冬酶(Caspase)活化與募集結(jié)構(gòu)域(CARD)反應(yīng)，通過招募下游的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體相互作用蛋白2(RIP2)，與NF-κB抑制蛋白(IκB)激酶(IKK)亞基結(jié)合，促進(jìn)IκB的磷酸化，最終致使炎性細(xì)胞因子過量表達(dá)[9]。RLRs能夠識(shí)別單鏈RNA、雙鏈RNA病毒。最近已經(jīng)有研究報(bào)道，口蹄疫病毒、肌病毒、牛痘病毒能夠引起奶牛乳腺炎[10-12]。被激活的RLRs及其CARD，通過與線粒體內(nèi)的抗病毒信號(hào)蛋白相互作用，激活干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和NF-κB，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[13]。

1.2 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞是肝臟中數(shù)量最多的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，在清除大分子物質(zhì)以及抗原呈遞方面起著重要的作用。清道夫受體是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的典型識(shí)別受體，由于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上面有很多窗孔，基底膜物質(zhì)少，大分子物質(zhì)不能通過，故將這些物質(zhì)輸送至肝細(xì)胞進(jìn)行代謝[14]。此外，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞還能吞噬抗原呈遞給T細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫耐受[14]。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞對大多數(shù)肝病的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用。從妊娠晚期過渡到哺乳早期這一段時(shí)間內(nèi)，很多高產(chǎn)奶牛由于被持續(xù)飼喂高精料型飼糧而造成過度肥胖，奶牛產(chǎn)后食欲不振，為了維持正常泌乳，便動(dòng)用機(jī)體脂肪和肌肉中的能量。其中脂肪在各種酶的作用下轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸，通過血液到達(dá)包括肝臟在內(nèi)的全身器官，并在肝細(xì)胞中以甘油三酯的形式積聚，形成脂肪肝。相似的是，在奶牛身上觀察到的脂肪肝與人類的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)有許多共同之處[15]。Mcmahan等[16]關(guān)于NAFLD的研究表明，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞主要通過調(diào)控血液中脂質(zhì)和脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，參與脂肪肝的病理調(diào)控過程。Kuhla等[17]利用雙向凝膠電泳(2-DE)和飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)技術(shù)比較了正常飼喂奶牛與限飼奶牛的肝臟組織，蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，催化膽固醇和磷脂在膜之間交換的甾醇載體蛋白2在限飼奶牛中含量更高，表明脂質(zhì)運(yùn)輸增加，這強(qiáng)調(diào)了肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在奶牛脂肪肝形成過程中的重要調(diào)控作用。

1.3 樹突狀細(xì)胞

樹突狀細(xì)胞主要位于肝臟門脈基質(zhì)、膽管及肝竇附近，是一種專業(yè)的抗原提呈細(xì)胞[18]。樹突狀細(xì)胞不僅能夠介導(dǎo)肝臟免疫系統(tǒng)的激活，其在炎癥反應(yīng)過程中也起著關(guān)鍵作用。Barfoot等[19]研究表明，從反芻動(dòng)物綿羊的肝臟中分離出來的樹突狀細(xì)胞表面有豐富的免疫球蛋白和Ⅱ類組織相容性抗原，后者由主要組織相容復(fù)合物(MHC)編碼，其在動(dòng)物體免疫機(jī)能中發(fā)揮著重要作用。葉素成[20]采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)探究了奶牛MHC與奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)(SCC)的關(guān)系，結(jié)果表明，MHC的DRB3基因位點(diǎn)存在多態(tài)性，其中Hae ⅢAA基因型與高SCC呈顯著的相關(guān)關(guān)系，這為檢測奶牛乳腺炎提供了一定的參考依據(jù)。

1.4 肝星狀細(xì)胞

肝星狀細(xì)胞占肝臟固有細(xì)胞總數(shù)的15%，主要負(fù)責(zé)代謝和貯存維生素A，并儲(chǔ)存脂肪，從而為肝細(xì)胞提供能量[21]。劉一諾[22]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛雜交后代的肝星狀細(xì)胞中存在調(diào)節(jié)脂肪代謝的刺鼠信號(hào)蛋白(ASIP)基因，同時(shí)指出ASIP基因調(diào)節(jié)牛乳腺上皮細(xì)胞中的脂肪酸代謝過程。在乳房鏈球菌(S.uberis)引起的奶牛乳腺炎中，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路與TLRs/NF-κB信號(hào)通路之間的相互作用促進(jìn)了炎癥反應(yīng)[23]，因此可以將阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路作為治療S.uberis型乳腺炎的方案之一?，F(xiàn)已有研究表明，褪黑素能夠顯著抑制人類肝星狀細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的激活[24]，這為治療S.uberis型奶牛乳腺炎提供了有力支持。

2 肝臟合成并分泌入血的免疫相關(guān)活性物質(zhì)

2.1 補(bǔ)體蛋白

補(bǔ)體蛋白是組成先天免疫系統(tǒng)的重要部分，主要在肝臟中合成。補(bǔ)體被激活之后最終形成膜攻擊復(fù)合物，后者通過嵌入感染細(xì)胞或者病原體的細(xì)胞膜，發(fā)揮殺菌作用[25]。所以，奶牛的補(bǔ)體水平在很大程度上反映了奶牛的免疫性能。Min等[26]使用相對和絕對定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較了熱應(yīng)激狀態(tài)下奶牛的血漿差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激使奶牛的血漿補(bǔ)體蛋白水平明顯下降，免疫功能受到損傷。而且，熱應(yīng)激還會(huì)影響肝臟糖異生基因的表達(dá)[27]。Ghaffari等[28]利用定量串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)方法比較了正常奶牛和過度調(diào)理奶牛從妊娠晚期到泌乳早期的血漿差異，蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，過度調(diào)理會(huì)使奶牛的補(bǔ)體蛋白水平下降，特別是補(bǔ)體3和補(bǔ)體3d水平較低。補(bǔ)體3的水平在血清中很高，在免疫系統(tǒng)中具有核心地位。Jacob等[29]也在亞臨床乳腺炎奶牛的牛乳中發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體3的激活，并肯定了其作為亞臨床型乳房炎診斷標(biāo)記物的潛力。因此，補(bǔ)體蛋白是反映奶牛肝臟健康及機(jī)體免疫水平的重要指標(biāo)。

2.2 免疫調(diào)理素

免疫調(diào)理素是一種具有調(diào)理作用的免疫活性分子，除補(bǔ)體外，還包括CRP、SAA、甘露糖結(jié)合凝集素等物質(zhì)[30]。免疫調(diào)理素可與細(xì)胞上的特異性受體相互作用，促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬病原體或病毒感染細(xì)胞。在機(jī)體發(fā)生急性炎癥或被感染時(shí)，肝細(xì)胞迅速產(chǎn)生急性期蛋白CRP和SAA，二者與免疫細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合介導(dǎo)胞吐作用，從而促進(jìn)體內(nèi)大分子物質(zhì)的清除[5]。Ilievska等[31]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛的蹄部疾病患病情況，如足跟角糜爛、足底潰瘍、足底皮炎等，與血清中的急性期蛋白有關(guān)，特別是HP和SAA，可作為奶牛蹄病早期檢測的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶2(MASP2)是補(bǔ)體系統(tǒng)的功能中心酶，其單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與奶牛的乳房炎和產(chǎn)奶量有關(guān)系。Zhang等[32]指出，在中國荷斯坦奶牛MASP2基因的SNPs中，基因型AC(g.14047A>C)和TT(g.14248T>C)以及單倍型組合H2H2和H2H4可作為奶?？谷榉垦子N的分子標(biāo)記。

2.3 脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)、可溶性CD14和可溶性MD-2

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，與TRL4-MD2復(fù)合物結(jié)合，激活炎癥信號(hào)通路。LPS向TLR4-MD2的轉(zhuǎn)移是由LBP和CD14共同催化的[33]。CD14是一種錨定蛋白，是LPS的細(xì)胞膜受體。LBP與LPS的類脂A高度親和，形成復(fù)合物后與CD14識(shí)別結(jié)合，形成LPS-LBP-CD14三聯(lián)復(fù)合體[33]。隨后LPS被LBP和CD14轉(zhuǎn)移到TLR4-MD2復(fù)合物中，誘導(dǎo)二聚化，這使得TLR4的胞質(zhì)Toll/白細(xì)胞介素-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域足夠接近，以招募下游銜接分子，如MyD88、含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白(TIRAP)、含有TIR結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)產(chǎn)生β-干擾素的接頭蛋白(TRIF)和TRIF相關(guān)的接頭分子(TRAM)[34]，最終誘導(dǎo)參與宿主免疫反應(yīng)基因的表達(dá)。LPS感染對奶牛機(jī)體的影響是多方面的，如LPS以時(shí)間依賴方式降低甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)的表達(dá)，誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的乳脂產(chǎn)量降低[35]；卵泡液中的LPS可能通過破壞類固醇合成和排卵機(jī)制誘發(fā)奶牛囊性卵巢疾病[36]；LPS能夠誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜炎，致使受孕率降低、從產(chǎn)犢到第1次分娩的間隔時(shí)間增加、因不孕而被淘汰的奶牛數(shù)量增加等[37]。

2.4 纖維蛋白原

纖維蛋白原是一種由肝細(xì)胞合成的具有凝血和止血作用的糖蛋白，由α、β、γ 3對多肽鏈構(gòu)成[38]。在凝血酶作用下，α鏈與β鏈分別在細(xì)胞中釋放出A肽與B肽，轉(zhuǎn)化為纖維蛋白單體，最終形成纖維蛋白聚合物[39]。有趣的是，凝血與天然免疫之間存在著重要聯(lián)系。越來越多的研究表明，凝血因子不僅起到物理屏障保護(hù)的作用，還能控制入侵的微生物保持在局部，阻止其進(jìn)入血液循環(huán)擴(kuò)散[40]。P?hlman等[40]指出，從纖維蛋白原β鏈釋放的肽段GHR28對與纖維蛋白原結(jié)合的細(xì)菌具有抗菌活性，但非結(jié)合菌株不受影響。這種抗菌作用是通過GHR28對細(xì)菌的結(jié)合能力實(shí)現(xiàn)的，主要針對A組和B組鏈球菌有效，而對金黃色葡萄球菌和卡他莫拉氏菌的作用不明顯。Papareddy等[41]的研究也表明，在纖維蛋白中檢測到的凝血酶衍生肽，可通過膜溶解方式有效地殺滅微生物，在動(dòng)物模型中對銅綠假單胞菌敗血癥和LPS誘導(dǎo)的休克具有防御作用。在奶牛養(yǎng)殖過程中，乳腺炎致病菌的主要類型有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌。纖維蛋白原多肽在奶牛乳腺炎治療上的應(yīng)用還未見報(bào)道，在治療大腸桿菌以及無乳鏈球菌型奶牛乳腺炎時(shí)是否可以將纖維蛋白原多肽作為替代抗生素的選擇值得進(jìn)一步探究。

3 肝-腦軸

肝-腦軸參與調(diào)控多種信號(hào)通路。在肝腦炎癥信號(hào)通路中，炎癥因子激活肝腦迷走神經(jīng)，迷走傳入神經(jīng)將信號(hào)投射到大腦。炎癥因子作用于大腦內(nèi)皮細(xì)胞受體，進(jìn)而激活各自的炎癥信號(hào)通路[42]。在肝腦葡萄糖信號(hào)通路中，肝-腦軸通過自主神經(jīng)系統(tǒng)對胰島素的中樞作用從而調(diào)節(jié)肝臟血糖水平。血糖不僅可以為機(jī)體提供能量，而且也是提高機(jī)體免疫力的重要部分。曲明姿等[43]研究表明，高產(chǎn)奶牛與低產(chǎn)奶牛相比血糖水平顯著降低，這可能與高產(chǎn)奶牛產(chǎn)奶量大、消耗的糖量大有關(guān)。而且，奶牛產(chǎn)后血糖水平也是預(yù)測奶牛酮病是否發(fā)生的重要指標(biāo)。而在免疫系統(tǒng)中，自然殺傷(NK)細(xì)胞是機(jī)體重要的淋巴細(xì)胞，能夠迅速釋放穿孔素、細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子(TNFs)等，非特異性地殺傷異常細(xì)胞[44]，并通過調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞調(diào)動(dòng)機(jī)體的天然免疫機(jī)能。有研究表明，在高血糖患者的外周血中存在白細(xì)胞介素-2(IL-2)受體[45]，其通過阻礙IL-2與NK細(xì)胞接觸，降低NK細(xì)胞的活性，進(jìn)而降低機(jī)體的免疫力。目前，肝-腦軸對血糖水平的調(diào)控在奶牛生產(chǎn)和健康中得到了更多的關(guān)注，而其對免疫功能的影響還需要深入探究，因此可以將肝-腦軸在免疫功能中的作用作為創(chuàng)新點(diǎn)，進(jìn)一步完善奶牛免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。

4 小 結(jié)

奶牛肝臟免疫是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程，涉及到肝臟中的各種免疫相關(guān)細(xì)胞以及肝細(xì)胞合成并分泌入血的免疫相關(guān)活性物質(zhì)，同時(shí)肝臟還通過肝-腦軸在奶牛機(jī)體免疫中發(fā)揮不可替代的作用。奶牛肝臟免疫與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，所以，了解奶牛肝臟免疫能夠更好地理解奶牛疾病的誘因、發(fā)病機(jī)制及治療方法，意義匪淺。