奶牛瘤胃微生物移植研究進(jìn)展

楊 卓 馬 勇 張力莉 徐曉鋒*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川750021；2.碩騰(上海)企業(yè)管理有限公司，上海200050)

奶牛瘤胃微生物種類(lèi)眾多，飼糧中的營(yíng)養(yǎng)成分可在瘤胃微生物的作用下降解成揮發(fā)性脂肪酸、氨基酸、氨等，同時(shí)合成微生物蛋白和甲烷等[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，奶牛瘤胃微生物發(fā)酵可直接為機(jī)體提供約70%的能量[3]。穩(wěn)定的瘤胃內(nèi)環(huán)境和健康的瘤胃功能是維持奶牛機(jī)體健康的重要保障[4]。在牧場(chǎng)實(shí)際生產(chǎn)中，受飼糧原料的變化、環(huán)境應(yīng)激和管理不當(dāng)?shù)纫蛩氐挠绊懀膛Ａ鑫肝h(huán)境容易發(fā)生改變，使奶牛繼發(fā)瘤胃酸中毒、真胃移位和酮病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[5]。這些疾病的發(fā)生不僅降低了奶牛的生產(chǎn)性能，更增加了奶牛產(chǎn)后死亡和淘汰風(fēng)險(xiǎn)，給牧場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。因此，通過(guò)人為手段調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系使之穩(wěn)定，對(duì)維持奶牛生產(chǎn)性能的正常發(fā)揮具有重要意義。近年來(lái)，瘤胃微生物移植(rumen microbiota transplantation,RMT)技術(shù)在重建奶牛瘤胃微生物區(qū)系方面的作用逐漸被研究人員關(guān)注，并被證明有一定的效果[8-10]。本文將就RMT重建瘤胃菌群的可能作用機(jī)理及其在奶牛生產(chǎn)上的應(yīng)用以及存在問(wèn)題等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步研究提供參考。

1 奶牛瘤胃微生物區(qū)系的主要調(diào)控措施

奶牛瘤胃微生物區(qū)系的穩(wěn)定受到奶牛品種、年齡和生理狀況，飼糧類(lèi)型，以及外源添加劑等多種因素的影響[4]。目前調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系的方法主要有：1)通過(guò)調(diào)整奶牛飼糧結(jié)構(gòu)來(lái)優(yōu)化瘤胃的功能[11]。奶牛粗飼料的類(lèi)型可以改變瘤胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的種類(lèi)[12]，精飼料可促進(jìn)瘤胃乳頭的發(fā)育與分化，給瘤胃微生物定植創(chuàng)造良好的瘤胃內(nèi)環(huán)境[13]。2)在飼糧中添加適宜的飼料添加劑[14]。例如益生菌、植物次級(jí)代謝物(皂苷、丹寧、植物精油)等，這些飼料添加劑可直接改變瘤胃中菌群的結(jié)構(gòu)和豐度，益生菌可促進(jìn)有益菌群的生長(zhǎng)，有助于逆轉(zhuǎn)瘤胃菌群紊亂，提高奶牛免疫力[14]。皂苷等植物次級(jí)代謝物可加強(qiáng)瘤胃發(fā)酵，促進(jìn)瘤胃微生物蛋白合成[15]。與上述傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控方案相比，RMT為調(diào)控奶牛瘤胃微生物區(qū)系開(kāi)辟了新途徑，并取得了較好的應(yīng)用效果[10,16]。然而，該技術(shù)目前尚未完全成熟，移植操作的專(zhuān)業(yè)性及繁瑣程度可能制約著它在奶牛生產(chǎn)中的大規(guī)模推廣和應(yīng)用，但在小范圍治療奶牛真胃移位等疾病方面具有較好的應(yīng)用前景[17]。

2 RMT在奶牛生產(chǎn)上的應(yīng)用研究

2.1 RMT在奶牛疾病治療上的應(yīng)用

RMT是將健康供體奶牛瘤胃內(nèi)微生物菌群移植給受體瘤胃內(nèi)的技術(shù)手段，在動(dòng)物生產(chǎn)中已經(jīng)被實(shí)踐了幾十年，最早可追溯至1776年，有文獻(xiàn)記載了將綿羊或山羊口中的食團(tuán)取出飼喂給非反芻動(dòng)物的做法[16]?，F(xiàn)有研究表明，RMT可調(diào)控奶牛瘤胃微生物區(qū)系的穩(wěn)態(tài)[18]，對(duì)多種腸道疾病有較好的輔助治療效果[19]。例如，Bu等[20]在荷斯坦新生奶公犢出生后的第3、7、21、42和50天分別給接種100、200、300、400和500 mL成年牛的瘤胃液，犢牛斷奶前發(fā)生腹瀉的次數(shù)和持續(xù)時(shí)間相較于對(duì)照組分別降低了45.5%和50.9%。Pounden等[21]將健康犢牛瘤胃中的微生物移植給嚴(yán)重腹瀉的犢牛，改善了犢牛腹瀉并提高了犢牛存活率。Steiner等[22]給消化不良的奶牛移植健康牛的瘤胃液，消化不良癥狀明顯改善。Rager等[17]給真胃左側(cè)移位術(shù)后奶牛移植10 L健康牛的瘤胃液，術(shù)后3 d奶牛的干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量均提高，促進(jìn)了奶牛術(shù)后的康復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn)，RMT還可改善奶牛因飼糧導(dǎo)致的低乳脂癥狀[23]。此外，Jones等[24]在夏威夷牛瘤胃內(nèi)分離培養(yǎng)出可降解含羞草素(一種在銀合歡屬植物中發(fā)現(xiàn)的有毒氨基酸[25])中的3-羥基-4-吡啶的瘤胃微生物，并移植給澳大利亞牛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受體牛尿中基本不含3-羥基-4-吡啶。

2.2 RMT對(duì)奶牛生產(chǎn)性能的影響

關(guān)于RMT可改善奶牛生產(chǎn)性能的研究結(jié)果不一。Steiner等[22]給消化不良奶牛移植健康瘤胃液后，受體奶牛干物質(zhì)采食量提高，瘤胃功能增強(qiáng)，體現(xiàn)在瘤胃原蟲(chóng)數(shù)量顯著增加，亞甲基藍(lán)還原時(shí)間以及瘤胃內(nèi)微粒物質(zhì)漂浮的時(shí)間延長(zhǎng)等方面。蔣濤[26]將處于泌乳高峰期的健康奶牛瘤胃液移植給圍產(chǎn)后期奶牛，受體奶牛干物質(zhì)采食量提高，瘤胃發(fā)酵模式改變，菌群豐度和多樣性提高，這與Ji等[8]的研究結(jié)果一致。關(guān)于RMT使奶牛干物質(zhì)采食量提高的原因，可能是由于受體牛的瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生了顯著變化，刺激了奶牛反芻，進(jìn)而食欲增強(qiáng)[26]。但也有一些研究證實(shí)，RMT在改善奶牛生產(chǎn)性能方面并沒(méi)有顯著效果。例如，Weimer等[27]將泌乳期荷斯坦奶牛的瘤胃內(nèi)容物相互置換，置換后的奶牛產(chǎn)奶量并無(wú)顯著變化，雖然有2頭奶牛的瘤胃液pH在移植當(dāng)天互換，但1 d以后均恢復(fù)到移植前的水平。Bu等[20]將荷斯坦成年牛瘤胃液移植給新生奶公犢，與對(duì)照組相比，奶公犢的采食量、飼料轉(zhuǎn)化效率以及體重、身高、心臟維度等生長(zhǎng)指標(biāo)無(wú)顯著差異，且受體牛的瘤胃液pH和總揮發(fā)性脂肪酸濃度無(wú)顯著變化。Cersosimo等[28]給荷斯坦公犢牛移植成年奶牛瘤胃液，犢牛采食量不受影響。

造成瘤胃液移植后受體動(dòng)物生產(chǎn)性能變化不顯著的原因可能源于如下幾個(gè)方面：第一，瘤胃液移植的次數(shù)不足、試驗(yàn)周期較短，移植以后對(duì)奶牛生產(chǎn)性能產(chǎn)生的有益影響還未顯現(xiàn)出來(lái)；第二，奶牛個(gè)體的遺傳差異；第三，瘤胃液中微生物移植的完整性。已有研究在給受體牛移植瘤胃液時(shí)，有將受體瘤胃內(nèi)容物完全清空后再移植和未做清空處理移植的不同做法，受體牛的瘤胃內(nèi)容物殘留量不同，而殘留在受體瘤胃內(nèi)的菌群仍然會(huì)發(fā)揮作用，這或許是研究結(jié)果存在差異的又一可能原因[9,29-30]。

3 奶牛RMT的可能作用機(jī)理

通過(guò)RMT，供體奶?？蓪⒘鑫竷?nèi)的微生物、營(yíng)養(yǎng)素及瘤胃液移植到受體奶牛的瘤胃中。Depeters等[16]認(rèn)為，被移植的瘤胃微生物具有生態(tài)占位和定植抗力，它們可迅速在受體的瘤胃中定植，使患病牛只瘤胃菌群重建，恢復(fù)其瘤胃微生物區(qū)系的穩(wěn)態(tài)，從而改善牛體健康。例如，奶牛瘤胃液中含有大量的原蟲(chóng)，原蟲(chóng)主要消耗淀粉，對(duì)穩(wěn)定瘤胃液pH有重要影響，并促進(jìn)瘤胃中其他微生物的生長(zhǎng)[10]。向受體奶牛移植大量的瘤胃液，對(duì)受體牛瘤胃液有一定稀釋效果，影響受體牛的瘤胃液pH。移植給受體牛瘤胃液內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)素對(duì)促進(jìn)受體牛瘤胃微生物生長(zhǎng)有積極作用[10]。一些消化不良的奶牛瘤胃通常表現(xiàn)出蠕動(dòng)遲緩，移植瘤胃微生物時(shí)，對(duì)受體奶牛瘤胃壁的機(jī)械刺激會(huì)引起瘤胃壁的適度張力，這種張力可刺激位于瘤胃和網(wǎng)胃上的機(jī)械受體，使胃壁肌肉收縮，從而促進(jìn)奶牛反芻和瘤胃蠕動(dòng)。關(guān)于RMT的具體作用機(jī)理仍然不詳，有待進(jìn)一步研究和探討。

4 RMT的常見(jiàn)問(wèn)題

4.1 RMT的安全性

雖然RMT在治療奶牛消化不良等疾病方面已有應(yīng)用，但仍存在安全風(fēng)險(xiǎn)。在移植過(guò)程中，一些細(xì)菌可能會(huì)經(jīng)奶?？谇缓湍c道交叉感染，如副傷寒分歧桿菌、沙門(mén)氏菌、隱孢子蟲(chóng)和大腸桿菌等[16]。此外，瘤胃液移植對(duì)操作人員的技術(shù)要求很高，操作稍有不慎，就可能損傷奶牛的口腔、腸道及瘤胃等部位，若不慎將瘤胃中的大顆粒物移植，可能會(huì)堵塞胃管，引起奶牛窒息。移植過(guò)程中，奶牛容易出現(xiàn)反抗行為，在操作人員的安全方面也同樣存在著一定的風(fēng)險(xiǎn)。有研究報(bào)道，目前在奶牛上進(jìn)行的RMT試驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)奶牛出現(xiàn)不適反應(yīng)[21,28]，但在人類(lèi)菌群移植試驗(yàn)中，有受體出現(xiàn)腹痛、腹瀉、食欲下降等不適反應(yīng)[31]，這些癥狀是否也會(huì)在奶牛上發(fā)生，其嚴(yán)重程度是否會(huì)給奶牛的生產(chǎn)性能造成威脅以及對(duì)奶牛的肉、奶產(chǎn)品是否存在安全隱患還需通過(guò)長(zhǎng)期真實(shí)案例數(shù)據(jù)進(jìn)一步探究。

4.2 瘤胃液獲取方法

目前獲取瘤胃液的方式主要有3種：一是通過(guò)瘤胃導(dǎo)管采集健康奶牛的瘤胃液，這種方式獲取量較少，對(duì)奶牛造成的應(yīng)激相對(duì)較大；二是從被植入瘺管的奶牛瘤胃中直接獲取，這種方式獲取量較大，牛只應(yīng)激相對(duì)較小，是目前比較常用的獲取方式[26,32]；三是采集屠宰后奶牛的瘤胃液，這種方式成本較高，且由于牛只被屠宰后停止進(jìn)食和飲水，可能會(huì)對(duì)瘤胃液產(chǎn)生一定影響[33]。所有瘤胃液供體牛都需被嚴(yán)格篩選，最好選擇同一牧場(chǎng)、同一飼糧飼養(yǎng)條件的牛進(jìn)行移植，這樣不僅利于供體牛瘤胃微生物在受體牛瘤胃內(nèi)繼續(xù)增殖并發(fā)揮作用，也可以減少病原感染的風(fēng)險(xiǎn)[16,21]。目前，用于RMT的奶牛瘤胃液獲取量有限加之成本較高，研究瘤胃微生物的體外開(kāi)發(fā)利用以期獲取足量、穩(wěn)定的瘤胃菌群或許是RMT技術(shù)走向生產(chǎn)應(yīng)用的重要一環(huán)。

4.3 移植劑量

目前針對(duì)瘤胃液的移植劑量并沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，從給小牛移植1 L到給成年牛移植16 L不等。對(duì)成年牛來(lái)說(shuō)，一次移植的理想劑量為8～16 L[16]。在臨床上，一般給成年奶牛每次移植10.0～11.4 L瘤胃液[26]。也有研究給奶牛移植較小的劑量，并取得良好的效果，例如Steiner等[22]將45頭消化不良的奶牛平均分為3組，依次移植1、5 L健康瘤胃液和5 L溫水，結(jié)果顯示移植1和5 L瘤胃液對(duì)奶牛消化不良的改善效果并無(wú)顯著差異。因此，關(guān)于移植劑量還有待進(jìn)一步探究。

4.4 移植時(shí)間

瘤胃液從供體奶牛瘤胃中取出后，應(yīng)在30 min內(nèi)完成移植操作[18]。因?yàn)榱鑫敢弘m然可在室溫下保存數(shù)日，但若將其儲(chǔ)存在密封容器中，減少與空氣的接觸，容器的壓力可能會(huì)增加瘤胃液中CO2濃度并降低pH[34]。冷凍奶牛瘤胃液如果不能?chē)?yán)格保證在厭氧條件下操作使用，會(huì)導(dǎo)致瘤胃液中原蟲(chóng)數(shù)目減少，淀粉分解酶和纖維素降解酶活性降低[34]。此外，盡可能短的操作時(shí)間可以減少奶牛的不適和對(duì)瘤胃壁的損傷風(fēng)險(xiǎn)[9]。有研究稱(chēng)，奶牛及其他反芻動(dòng)物瘤胃中產(chǎn)甲烷菌、兼性厭氧菌、纖維菌、真菌和原蟲(chóng)等在瘤胃內(nèi)的定植時(shí)間不同[35]。因此，給奶牛移植不同生理階段的供體牛瘤胃液對(duì)移植效率的影響也不容忽視。

4.5 瘤胃液質(zhì)量的鑒定

亞甲基藍(lán)試劑法是檢測(cè)瘤胃液質(zhì)量的常用方法，瘤胃中的微生物會(huì)還原亞甲基藍(lán)，使其褪色。亞甲基藍(lán)應(yīng)在2～6 min內(nèi)褪色，如果褪色時(shí)間大于10 min，這種瘤胃液最好丟棄[16]。此外，瘤胃液pH應(yīng)大于等于5.5，最好為6.0或更高，低pH會(huì)降低原蟲(chóng)數(shù)量[36]。通常情況下，用高淀粉飼糧飼喂泌乳牛2～4 h，瘤胃液pH會(huì)降低。因此，當(dāng)供體奶牛接受高濃縮飼糧后，避免在飼喂4 h內(nèi)收集瘤胃液。對(duì)于飼喂高粗料飼糧的非泌乳階段奶牛，可在飼喂前或飼喂后的2～3 h收集瘤胃液，這個(gè)階段瘤胃液pH不會(huì)受到顯著影響[27]。

5 小 結(jié)

RMT可調(diào)控奶牛瘤胃微生物區(qū)系，具有輔助治療奶牛消化道疾病、改善真胃移位術(shù)后瘤胃功能以及提高奶牛生產(chǎn)性能的作用和潛力。然而，在RMT過(guò)程中，關(guān)于瘤胃液的移植量、移植時(shí)間和操作流程還需更多數(shù)據(jù)支持，且需要從生物安全角度對(duì)該技術(shù)做更深入和系統(tǒng)的評(píng)價(jià)。此外，供體奶牛瘤胃菌群與受體奶牛間獨(dú)特的互作機(jī)制仍未能完全闡明，未來(lái)可能需要從代謝、免疫和生理方面進(jìn)一步闡明受體奶牛與瘤胃微生物區(qū)系重建之間的互作關(guān)系。