蛋殼形成的鈣代謝機(jī)制及其影響因素

張亞男 王 爽 阮 棟 鄭春田

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省動(dòng)物育種與營養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640)

蛋殼是禽蛋重要的保護(hù)殼，保護(hù)內(nèi)容物免受外界應(yīng)力破損和病菌等微生物的侵染，在種蛋孵化過程中提供鈣源等營養(yǎng)成分，是禽蛋重要的表觀和經(jīng)濟(jì)性狀。蛋殼主要由碳酸鈣和有機(jī)基質(zhì)組成，其中碳酸鈣占蛋殼組分的96%以上，是構(gòu)成蛋殼結(jié)構(gòu)的重要部分，維持蛋殼的結(jié)構(gòu)和功能[1]。蛋殼的鈣化在子宮內(nèi)進(jìn)行，通過鈣化起始、線性沉積和鈣化末期3個(gè)階段，逐漸形成蛋殼的乳突層、柵欄層、垂直晶體層和膠護(hù)膜，構(gòu)成完整的蛋殼結(jié)構(gòu)[2]。蛋禽體內(nèi)鈣的總量為20～23 g，每產(chǎn)1枚蛋需消耗2.2～2.3 g鈣，即每天有10%的鈣需要更換[3]。因此，體內(nèi)鈣離子的代謝直接影響蛋殼的形成和品質(zhì)，明確蛋禽體內(nèi)的鈣代謝機(jī)制及影響因素，可為蛋殼品質(zhì)的調(diào)控研究提供思路。

1 蛋殼形成的鈣代謝機(jī)制

在蛋殼形成的動(dòng)態(tài)時(shí)序過程中，子宮上皮細(xì)胞不斷從血液中攝入鈣離子然后分泌到子宮腔內(nèi)，與碳酸氫根離子共同作用，沉積形成碳酸鈣，而血液中鈣離子一部分通過腸道吸收，另一部分來源于髓質(zhì)骨(動(dòng)態(tài)鈣源庫)的動(dòng)員。因此，蛋禽體內(nèi)鈣離子的代謝及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)蛋殼形成和品質(zhì)具有重要作用。

1.1 鈣離子在腸道的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)

蛋殼開始鈣化時(shí)，腸道內(nèi)鈣離子濃度大幅度增加，達(dá)到12 mmol/L[4]。腸道對(duì)鈣離子的吸收主要在十二指腸，對(duì)鈣的吸收率達(dá)90%，主要通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，少部分通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)行[5]。鈣離子在上皮細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)主要包括：1)鈣離子通過頂膜上的上皮鈣離子通道(TRPV)順梯度進(jìn)入細(xì)胞；2)通過基底膜上的鈣結(jié)合蛋白完成細(xì)胞內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)；3)通過基底膜上鈣泵[如轉(zhuǎn)運(yùn)載體鈣離子/鈉離子交換器(NCX)和基底外側(cè)質(zhì)膜鈣ATP酶被擠出基膜]主動(dòng)泵入腸腔內(nèi)[6]。在此過程中，離子載體發(fā)揮重要作用：1)TRPV，蛋雞十二指腸中轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子的通道主要是TRPV6[7]，還存在少量的TRPV2，促使鈣離子進(jìn)入上皮細(xì)胞[8]。2)鈣結(jié)合蛋白D28k(CALB1)，是鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白，在腸上皮細(xì)胞高水平表達(dá)，與腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移鈣的能力高度相關(guān)[9]。CALB1含量提高主要與卵蛋進(jìn)入子宮和蛋殼形成有關(guān)，鈣的吸收增加，腸道中CALB1的含量及其表達(dá)量增加；產(chǎn)軟蛋時(shí)，腸道內(nèi)CALB1含量降低1/2，當(dāng)?shù)皻ば纬苫謴?fù)后，CALB1及其mRNA表達(dá)水平顯著增加[10]，產(chǎn)蛋停止，腸道CALB1含量下降[9]。3)NCX，主要有NCX1和NCX3，可將鈣離子逆濃度轉(zhuǎn)運(yùn)[5-6]。4)鈣泵[鈣離子-ATP酶(PMCA)或ATP]，可利用ATP將鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外而降低細(xì)胞內(nèi)外電位差，主要有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子泵3 型(ATP2A3)、質(zhì)膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶1(ATP2B1)、質(zhì)膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶2(ATP2B2)和質(zhì)膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶4(ATP2B4)[6]。在上述載體的作用下，大部分的鈣離子被腸道吸收。

1.2 髓骨鈣的形成和動(dòng)員

蛋禽性成熟后，從飼糧攝入的鈣會(huì)優(yōu)先儲(chǔ)存在髓質(zhì)骨(包括脛骨、肱骨、股骨)中，作為產(chǎn)蛋期蛋殼形成的動(dòng)態(tài)鈣源，可提供蛋殼約40%的鈣，在低鈣飼糧中，甚至?xí)峁?0%的鈣[11]。髓質(zhì)骨由成骨細(xì)胞沉積，約占總骨鈣的11.7%，是一種非結(jié)構(gòu)性骨，缺乏機(jī)械抗性，從骨內(nèi)膜表面生長填滿骨髓腔[12]。髓質(zhì)骨的礦物鹽含量和結(jié)晶度較低，礦物顆粒較薄短[13]，與細(xì)胞外有機(jī)基質(zhì)(由非膠原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖組成)相互作用，作為鈣的動(dòng)態(tài)儲(chǔ)存庫，有機(jī)基質(zhì)是髓質(zhì)骨快速礦化和脫礦的重要條件。髓質(zhì)骨的表面積大，血管密集，代謝速率是皮質(zhì)骨的10～15倍[12]。髓質(zhì)骨的這些特性，成為蛋殼鈣化過程中的重要?jiǎng)討B(tài)來源，尤其在蛋殼鈣化末期，由于夜間飼糧鈣供應(yīng)不足，髓質(zhì)骨大量破骨產(chǎn)生鈣離子供蛋殼形成。隨著蛋禽年齡的增加，腸道對(duì)鈣的吸收量減少且機(jī)體利用骨鈣的能力下降[14]，蛋禽體內(nèi)每天有10%的鈣需要更換，當(dāng)吸收的鈣或利用的骨鈣不足以達(dá)到蛋殼形成所需，就會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)蛋減少，蛋殼變薄、變脆的現(xiàn)象，甚至產(chǎn)生軟殼蛋、無殼蛋等[15]。因此，髓骨鈣的形成和動(dòng)員，也是影響蛋殼品質(zhì)形成過程中鈣離子代謝的重要因素。

1.3 鈣離子在子宮的轉(zhuǎn)運(yùn)分泌

子宮內(nèi)鈣離子的分泌是影響蛋殼碳酸鈣沉積的直接因素。產(chǎn)卵后6～22 h，碳酸鈣以0.33 g/h的速度線性沉積在蛋殼腺(子宮)內(nèi)。子宮鈣離子的分泌不是持續(xù)的，與排卵過程同步，當(dāng)卵到達(dá)子宮時(shí)，受到刺激啟動(dòng)鈣離子的分泌[5]。蛋殼鈣化階段，血漿鈣離子濃度(1.2 mmol/L)與子宮腔中鈣離子濃度(6～10 mmol/L)之間存在較大的濃度差[16]。鈣離子在子宮部位的轉(zhuǎn)運(yùn)分泌，主要通過管狀腺細(xì)胞，逆濃度梯度向子宮腔內(nèi)轉(zhuǎn)移大量的鈣離子，同時(shí)保持細(xì)胞內(nèi)低濃度的鈣(<0.000 2 mmol/L)。上皮管狀腺細(xì)胞分泌的鈣離子主要涉及TRPV(細(xì)胞攝取/進(jìn)入)、CALB1(細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子泵2型(ATP2A2)和ATP2A3(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取)以及肌醇三磷酸受體1型、2型和3型(ITPR1、ITPR2和ITPR3，由網(wǎng)狀細(xì)胞輸出)，然后通過ATP2B1和ATP2B2以及NCX1和NCX3(SLC8A1和SLC8A3)將鈣離子從腺細(xì)胞中泵出。與十二指腸上皮細(xì)胞不同，子宮管狀腺細(xì)胞中可能不存在TRPV6，而TRPV2和TRPV3可能是鈣通道的重要離子載體[17]，但有待進(jìn)一步確定。與腸道相比，蛋殼腺管狀腺細(xì)胞鈣離子分泌的載體更多更復(fù)雜，還存在許多其他載體，如碳酸酐酶7，可促進(jìn)碳酸氫根離子生成；鈉離子/碳酸氫根離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要有溶質(zhì)載體家族4成員5(SLC4A5)、成員7(SLC4A7)、成員9(SLC4A9)；鈉離子通道，主要有氨酰敏感鈉通道亞基α(SCNN1A)、亞基β(SCNN1B)、亞基γ(SCNN1G)等。鈣和碳酸氫鹽從血液轉(zhuǎn)移到子宮，需要額外的離子運(yùn)動(dòng)來維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。大電流的鈉離子、鉀離子和氯離子有助于維持細(xì)胞內(nèi)的生理離子濃度。鈉離子通過NCX和頂膜上對(duì)氨基離子敏感的鈉離子通道從子宮液中吸收，通過鈉離子/鉀離子-ATP酶在電化學(xué)梯度作用下從基底外側(cè)膜細(xì)胞中泵出，鈉離子/鉀離子-ATP酶可轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子和鉀離子進(jìn)入細(xì)胞[16,18]。這些載體基因(ATP2A3、ITPR1、SCNN1A、SCNN1B和SCNN1G)多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián)證明，其與蛋殼力學(xué)特性(強(qiáng)度、厚度和蛋殼重量)有關(guān)，證明它們參與了蛋殼礦化前體的供應(yīng)[19]。腸道主要吸收鈣離子，子宮主要分泌鈣離子，都是通過轉(zhuǎn)運(yùn)載體而發(fā)揮作用，二者載體存在一些相似性，但子宮細(xì)胞的載體更加復(fù)雜，然而各離子之間的相互關(guān)系和作用，仍需深入研究。

2 蛋殼形成過程中鈣代謝的影響因素

2.1 維生素D及其代謝產(chǎn)物1,25-二羥維生素D3

維生素D及其代謝產(chǎn)物1,25-二羥維生素D3是調(diào)控鈣離子在腸道上皮細(xì)胞吸收的重要因子，可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞頂端鈣離子的滲透，及在細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和排出[9]。蛋禽腸道存在1,25-二羥維生素D3和維生素D受體(VDR)[20]。CALB1作為腸道鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白，是一種維生素D依賴型蛋白，飼糧缺乏維生素D，腸道中幾乎檢測不到鈣結(jié)合蛋白，但注射1,25-二羥維生素D3，鈣結(jié)合蛋白的基因表達(dá)增加了10倍[21]。蛋禽性成熟后產(chǎn)第一枚蛋前，血漿1,25-二羥維生素D3含量增加，腸道中鈣結(jié)合蛋白及其表達(dá)量增加，鈣吸收增加[10]。此外，研究表明，PMCA1的合成也受維生素D影響，其基因與維生素D受體反應(yīng)元件有關(guān)[22]。但其他鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體并未發(fā)現(xiàn)受1,25-二羥維生素D3的調(diào)控。腸道中雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多假定的離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，但關(guān)于這些候選分子在特定離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(通道、泵或交換器)之間的相互作用并不清楚。維生素D代謝物對(duì)蛋雞鈣結(jié)合蛋白和PMCA表達(dá)的影響已得到證實(shí)，但其他參與鈣吸收和腸細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)的蛋白的作用仍有待進(jìn)一步研究。

腸道鈣的吸收直接受維生素D的控制，子宮內(nèi)則不同。鈣結(jié)合蛋白也是子宮管狀腺細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)分泌的主要蛋白，在蛋殼形成過程中大量表達(dá)[16]，但子宮中的鈣結(jié)合蛋白表達(dá)是否受維生素D的影響，還存在爭議。外源性1,25-二羥維生素D3或低鈣飼糧不會(huì)影響子宮鈣結(jié)合蛋白的水平[9]，飼喂缺乏維生素D的飼糧，鵪鶉子宮內(nèi)仍有CALB1的合成[23]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)維生素D缺乏蛋禽子宮組織的培養(yǎng)基中添加1,25-二羥維生素D3或與雌激素共同作用，又可刺激鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)，這表明1,25-二羥維生素D3對(duì)鈣結(jié)合蛋白合成有促進(jìn)作用，并且子宮細(xì)胞存在VDR，并在蛋殼鈣化時(shí)表達(dá)增加[24]。蛋殼形成時(shí)，除了鈣離子和碳酸氫根離子的載體，許多參與蛋殼前體分泌或維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上調(diào)。且多數(shù)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因中都存在VDR，表明可能也受維生素D影響。但維生素D及其代謝產(chǎn)物1,25-二羥維生素D3對(duì)子宮細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)分泌載體的調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究。

髓骨和皮質(zhì)骨之間的平衡受飼糧鈣和維生素D的影響[12]。維生素D對(duì)骨礦化具有重要作用，提高鈣磷吸收，促進(jìn)某些骨基質(zhì)蛋白的合成，如骨鈣素和骨橋蛋白。骨鈣素是與骨礦化基質(zhì)相關(guān)的最豐富的非膠原蛋白，可與鈣結(jié)合，對(duì)羥基磷灰石有較強(qiáng)的吸附力[25]。骨橋蛋白是一種糖基化、高度磷酸化的蛋白，存在于骨和蛋殼中[26]。在骨中，骨橋蛋白可影響破骨細(xì)胞的分化和形成。1,25-二羥維生素D3通過與特定的維生素D反應(yīng)啟動(dòng)子元件結(jié)合，促進(jìn)骨鈣素和骨橋蛋白的合成，從而增加成骨細(xì)胞[6]。因此，髓骨鈣的合成和動(dòng)員受維生素D及其代謝產(chǎn)物1,25-二羥維生素D3的調(diào)控。

應(yīng)用研究中表明，維生素D3是維持蛋禽正常生長、繁殖和蛋殼品質(zhì)的重要因素[27]，可調(diào)控鈣磷吸收，調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素的分泌、骨礦化和動(dòng)員，減少骨疾病的發(fā)生[28]。蛋雞飼糧缺乏維生素D3，體內(nèi)鈣磷代謝降低，蛋雞的產(chǎn)蛋性能和蛋殼品質(zhì)降低，死亡率增加[29]。隨著產(chǎn)蛋日齡的增加，蛋禽體內(nèi)鈣吸收和維生素D3代謝能力降低[30]，導(dǎo)致體內(nèi)1,25-二羥維生素D3不足，影響鈣磷代謝，導(dǎo)致蛋殼質(zhì)量和骨強(qiáng)度降低[27]。在產(chǎn)蛋后期，飼糧添加維生素D3可提高蛋殼強(qiáng)度、厚度、蛋殼比例和脛骨強(qiáng)度，降低破蛋率[31]。飼糧添加維生素D3、維生素D2、1,25-二羥維生素D3可提高蛋雞體內(nèi)鈣和磷的總表觀消化率[32]。飼糧添加維生素D3(2 400 vs. 300 IU/kg)可提高蛋雞的蛋殼密度和厚度[33]，但也有研究表明飼糧添加維生素D3(2 200～102 020 IU/kg)對(duì)蛋雞的蛋殼品質(zhì)和骨性能無顯著影響[34]。

2.2 雌激素

雌激素是確保蛋殼形成的先決條件，刺激輸卵管和子宮的生長發(fā)育，并激活卵巢每日控制子宮分泌鈣的能力，隨著蛋殼形成不斷變化，并與蛋殼形成一致[3]。管狀腺細(xì)胞存在雌激素受體和鈣結(jié)合蛋白，子宮CALB1的含量受雌激素調(diào)控，影響子宮的鈣分泌。雌激素是影響髓骨形成的關(guān)鍵因素，成骨和破骨細(xì)胞中都存在雌激素受體，可誘導(dǎo)骨內(nèi)膜細(xì)胞分化形成成骨細(xì)胞，降低骨內(nèi)膜表面破骨細(xì)胞數(shù)量及活性[35]。蛋禽性成熟時(shí)，雌激素大量分泌，髓質(zhì)骨較皮質(zhì)骨比例增加[12]，雌激素還可誘導(dǎo)骨基質(zhì)形成，但需與維生素D3共同作用。維生素D是促進(jìn)皮質(zhì)骨和髓質(zhì)骨成骨細(xì)胞活動(dòng)的關(guān)鍵因素，但2種骨之間的平衡受雌激素的調(diào)節(jié)，通過調(diào)控血管系統(tǒng)和交換表面積[12]。此外，維生素D參與髓質(zhì)骨形成，在成骨細(xì)胞中，雌激素可增加維生素D受體表達(dá)刺激骨鈣素分泌，并與維生素D共同作用，促進(jìn)髓質(zhì)骨形成。產(chǎn)蛋后期，蛋殼品質(zhì)和骨性能降低，這可能與蛋殼腺上皮細(xì)胞的雌激素受體(α和β)之間的平衡改變有關(guān)，若連續(xù)低劑量的注射雌激素，可改善蛋雞的蛋殼強(qiáng)度[36]。因此，雌激素也是影響蛋殼鈣代謝和形成的重要因素。

2.3 骨鈣素、甲狀旁腺素、成纖維細(xì)胞生長因子23(FGF23)

飼糧鈣供應(yīng)不足時(shí)，髓質(zhì)骨是蛋殼形成的動(dòng)態(tài)鈣庫[35]。蛋殼形成過程中(產(chǎn)卵10～22 h)，破骨細(xì)胞活躍，髓質(zhì)骨被大量吸收，吸收面積增加了9倍，血漿和尿中磷含量大幅增加[6]。骨鈣素主要由成骨細(xì)胞合成，參與鈣循環(huán)，并可得到快速周轉(zhuǎn)。血漿中骨鈣素含量變化與1,25-二羥維生素D3有關(guān)，產(chǎn)無殼蛋蛋禽血漿中的骨鈣素和1,25-二羥維生素D3含量均較低[37-38]。低鈣飼糧中，蛋殼的形成會(huì)促進(jìn)骨鈣素的分泌。血漿骨鈣素可反映成骨細(xì)胞的日周期活動(dòng)，在成骨細(xì)胞中，雌激素通過增加VDR表達(dá)刺激骨鈣素的分泌。飼糧添加維生素K可通過骨鈣素改善骨組織代謝的失衡狀態(tài)，促進(jìn)骨形成和抑制骨細(xì)胞吸收的雙向調(diào)節(jié)[39]，但對(duì)蛋殼品質(zhì)的調(diào)控研究有待進(jìn)一步研究。骨的重吸收日常變化還受甲狀旁腺素(PTH)的控制[35]。在蛋殼形成期間，由于血漿中鈣離子的降低，PTH的分泌增加，可強(qiáng)烈刺激骨吸收[35]。FGF23是一種調(diào)節(jié)骨鈣和磷代謝的激素，調(diào)控骨橋蛋白等的表達(dá)[38]，F(xiàn)GF23主要在成骨和破骨細(xì)胞中表達(dá)，可抑制腎小管中磷酸鹽的再吸收，還可通過雙重作用降低1,25-二羥維生素D3的循環(huán)[38]。然而，F(xiàn)GF23在蛋禽體內(nèi)蛋殼形成過程中的具體作用并不清楚，但FGF23及其輔助因子可能參與蛋禽腎臟中磷酸鹽和1,25-二羥維生素D3的每日變化[40]。因此，調(diào)控影響骨礦化和破骨的激素水平，可調(diào)控骨鈣磷代謝，影響體內(nèi)鈣代謝。

髓骨鈣的儲(chǔ)存也是影響蛋殼鈣代謝的重要因素。關(guān)注育成期蛋禽的骨骼發(fā)育，保證產(chǎn)蛋后期髓骨鈣的供應(yīng)，是調(diào)控后期蛋殼品質(zhì)的重要方向。通過調(diào)控鈣磷代謝而影響碳酸鈣的沉積是改善后期蛋殼品質(zhì)的研究重點(diǎn)。研究表明，飼糧添加鋅[41]、枯草芽孢桿菌[42]、有機(jī)酸和中草藥添加劑[43]以及調(diào)控飼糧鈉氯水平[44]、使用硫酸鈉部分代替氯化鈉[45]等，可改善產(chǎn)蛋后期的蛋殼品質(zhì)，主要是調(diào)控碳酸鈣的沉積，通過促進(jìn)鈣離子的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和降低骨鈣流失等發(fā)揮作用。

3 小 結(jié)

蛋殼品質(zhì)受鈣磷代謝的影響受到廣泛關(guān)注，通過調(diào)控鈣源和水平、鈣磷比例、添加維生素等調(diào)控蛋殼品質(zhì)，也已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。但仍有許多問題有待進(jìn)一步研究和探討，歸結(jié)起來主要有如下4個(gè)方面：1)腸道和子宮部上皮細(xì)胞仍然存在許多未鑒定或功能不清楚的離子載體，通過組學(xué)技術(shù)與表型數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析，有助于發(fā)現(xiàn)或解析其在蛋殼形成的功能和作用途徑。2)子宮上皮細(xì)胞鈣離子的分泌，不僅需要鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體，還與其他離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和平衡有關(guān)，可從整體上，調(diào)控離子穩(wěn)態(tài)平衡而改善蛋殼品質(zhì)。3)蛋殼鈣化的動(dòng)態(tài)時(shí)序性過程中，需要持續(xù)不斷的提供大量的鈣離子，受體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，受1,25-二羥維生素D3、雌激素、降鈣素、PTH和鈣離子調(diào)節(jié)等影響。然而，激素水平的變化受多種因素影響，如何應(yīng)用營養(yǎng)手段進(jìn)行調(diào)控，仍然是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。4)通過調(diào)控鈣離子在腸道的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)而改善蛋殼品質(zhì)已進(jìn)行大量研究，但關(guān)于調(diào)控髓骨鈣的形成和動(dòng)員的研究很少，這將是未來蛋殼品質(zhì)研究的新方向。