紅松多糖的提取工藝及生物活性研究進(jìn)展

劉垠澤，李沛檑，喬連成，吳恒梅*

（1. 佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2. 樺南縣林草事業(yè)發(fā)展中心，黑龍江佳木斯 154007）

紅 松（Pinus koraiensisSieb. et Zucc.）為松 科（PinaceaeLindl.）松屬（PinusL.）常綠喬木，始載于《名醫(yī)別錄》，又名紅果松、朝鮮松、海松等。耐寒性強(qiáng)，常見(jiàn)于我國(guó)小興安嶺至長(zhǎng)白山一帶［1］，生于海拔150～1 800 m 的棕色森林土中，是東北地區(qū)特有的果材兼用型植物，也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)型林木，于1999 年被國(guó)務(wù)院立為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。國(guó)外僅在日本、朝鮮和俄羅斯的小部分地區(qū)有分布［2］。紅松樹(shù)干常因結(jié)構(gòu)細(xì)膩且耐腐蝕性強(qiáng)而被用作工業(yè)原料，早在古希臘時(shí)期，松樹(shù)皮就被歐洲人用作治療外傷，也可從中提取松節(jié)油、栲膠。紅松球果中松籽被開(kāi)發(fā)、出口為滋養(yǎng)食用品，《本草綱目》紀(jì)錄了松塔、松針的醫(yī)藥價(jià)值，可磨粉入藥，醫(yī)咳喘、濕氣、炎癥、心神不安等病癥。

多糖是維持生命活動(dòng)所必需的四大基本物質(zhì)之一。隨著國(guó)際分子水平研究的進(jìn)步，各國(guó)對(duì)多糖的研究愈發(fā)重視，認(rèn)為二十一世紀(jì)將是多糖的世紀(jì)［3］?，F(xiàn)代研究表明，紅松中含有萜類、多糖、多酚等有效化學(xué)成分，其不同部位的水提物具有抗氧化、抗病毒和降血脂等藥理活性。該文對(duì)紅松多糖的提取工藝及生物活性進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，以期為紅松資源的合理開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 紅松多糖的提取工藝

多糖的提取技術(shù)是天然產(chǎn)物研究中不可或缺的分支，植物多糖的毒副作用極低，應(yīng)用領(lǐng)域?qū)挿?。目前成熟的提取技術(shù)繁多，針對(duì)紅松多糖提取層面，國(guó)內(nèi)研究多集中于提取條件的優(yōu)化。不同方法提取出的多糖構(gòu)象、提取量和藥理活性有差別，紅松各部分均含有一定量的多糖，提取時(shí)應(yīng)先將材料粉碎烘干，根據(jù)提取原料部位的不同，酌情考慮是否進(jìn)行預(yù)處理溶解脂類物質(zhì)。

1.1 溶劑浸提法

溶劑浸提法即根據(jù)相似相溶原理，按照生物活性成分的溶解度不同選擇合適的溶劑，將胞內(nèi)有效物質(zhì)遷徙至溶劑中，再進(jìn)行分離純化。水、酸堿溶液等是常用于提取多糖的溶劑。

水提法是傳統(tǒng)的多糖提取方法。相較于冷水提取，溶劑溫度的提升可使分子移速加快，顯著增加多糖提取得率。水提法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、干擾成分少、可工業(yè)化應(yīng)用，但得率低且耗時(shí)，不能確定高溫下是否改變多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在水提法中，提取參數(shù)決定了最后的多糖得率，因此控制適宜的提取條件顯得大有可觀。當(dāng)提取物中含糖醛酸或酸性多糖時(shí)，可選用堿提取法。通過(guò)控制濃度，使細(xì)胞在堿性條件下破裂，釋放內(nèi)容物從而進(jìn)行提取，提取速度和效率比水提法要略高，但操作繁瑣、易產(chǎn)生雜質(zhì)，堿濃度過(guò)高時(shí)將會(huì)損害多糖結(jié)構(gòu)［4］。

曲航［5］先對(duì)影響松仁多糖提取率的因素進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，以多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)考察最優(yōu)提取參數(shù)，得到最優(yōu)工藝方案為：固液比1：40 g·mL-1，溫度95℃，時(shí)間1.5 h，提取3 次，提取率為9.26%±0.10%。丁寧［6］采用水提醇沉法，將料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)選為實(shí)驗(yàn)條件，設(shè)置單因素試驗(yàn)并確定因素適宜范圍，在此基礎(chǔ)上設(shè)置三因素三水平正交試驗(yàn)進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化，結(jié)果表明影響紅松松籽殼多糖得率的強(qiáng)弱順序?yàn)椋汗桃罕?提取次數(shù)>提取時(shí)間，最佳提取參數(shù)為：固液比1：15 g·mL-1，提取時(shí)間2 h，提取3 次，在此條件下多糖平均得率為2.9%。楊鑫等［7］在單因素考察的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，將松塔多糖提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)其方差分析結(jié)果可知，浸提溫度和固液比對(duì)多糖得率呈顯著性影響，主次順序?yàn)椋汗桃罕?浸提溫度>浸提時(shí)間，當(dāng)料液比為1：12 g·mL-1，浸提溫度100℃，浸提時(shí)間4 h 時(shí)多糖得率最高，為1.52%。紅松提取物內(nèi)含水溶性酸性多糖的比例約16%～23%［8］，因此也可選用堿提取法進(jìn)行多糖提取。

1.2 超聲輔助提取法

利用聲波的振動(dòng)傳播改變細(xì)胞外壓力，溶液內(nèi)產(chǎn)生微氣核空化泡，這些空化泡在壓縮到極限時(shí)會(huì)崩潰釋放能量，形成局部的高溫高壓環(huán)境，有助于加速溶質(zhì)擴(kuò)散，細(xì)胞瞬時(shí)破裂釋放出多糖等化學(xué)物質(zhì)。此法適應(yīng)性強(qiáng)，在常溫下即可操作，過(guò)程中產(chǎn)生的熱效應(yīng)會(huì)使溶液溫度基本維持在57℃，有水浴加熱作用，極大提高了多糖提取效率。與傳統(tǒng)的水提取相比，超聲輔助法的材料損失率更低、提取時(shí)間短、得率和質(zhì)量有所增加。當(dāng)超聲功率、時(shí)間等因素設(shè)置不當(dāng)時(shí)，也存在多糖結(jié)構(gòu)被改變的可能性，且由于設(shè)備受限問(wèn)題，大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)還需要一定時(shí)間。

李明謙［9］選用超聲輔助水提法提取紅松松籽殼多 糖（Pinus koraiensis pinon shell polysaccharides，PPSP），設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，從固液比、提取溫度、浸提時(shí)間和提取次數(shù)四因素層面考察，分析各因素對(duì)多糖提取率的影響，得到如下順序：提取溫度>浸提時(shí)間>浸提次數(shù)>固液比，其中溫度和時(shí)間對(duì)多糖含量的影響呈極顯著差異。提取最優(yōu)參數(shù)為：固液比1：6 g·mL-1，溫度85℃，時(shí)間45 min，提取2次，此時(shí)PPSP總含量達(dá)最高值54.41%。李桂娟等［10］在超聲功率恒定450 W 條件下，通過(guò)改變固液比、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)以確定最佳提取工藝，在該研究中提取時(shí)間對(duì)得率影響最低，影響順序依次為：提取溫度>浸提次數(shù)>固液比>浸提時(shí)間，當(dāng)固液比為1：50 g·mL-1，溫度60℃，時(shí)間30 min，提取1 次時(shí)多糖得率最高，為44.26%。在原料、提取次數(shù)和料液比相同的情況下，超聲輔助比水提多糖得率高9.94%，所需溫度更低，在節(jié)能的同時(shí)更能保障多糖活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

1.3 微波輔助提取法

利用電磁波透過(guò)細(xì)胞壁輻射溶劑和細(xì)胞液，使細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)吸能產(chǎn)熱汽化膨脹，細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生壓力差，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，有效成分流出溶解。此法節(jié)能、高效、重現(xiàn)性好，但也需嚴(yán)格把控功率的設(shè)定，若時(shí)間過(guò)久或功率較高，將會(huì)導(dǎo)致多糖浸出率低、糖苷鍵斷裂等缺陷。

王振宇等［11］在單因素考察的基礎(chǔ)上，以松籽多糖含量為考察指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，分析固液比、微波功率、處理時(shí)間和浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響，結(jié)果表明固液比和微波功率對(duì)多糖得率有顯著性影響，其余因素的影響不顯著，當(dāng)固液比為1：15 g·mL-1，功率320 W，處理時(shí)間5 min，浸提時(shí)間60 min時(shí)達(dá)到最優(yōu)提取條件，多糖得率為6.01%。與傳統(tǒng)水提法相比，微波輔助在用料相同的情況下，所需溶劑減少了1/4、時(shí)間節(jié)省一半、多糖得率升高0.1%。

1.4 生物酶提取法

酶解法是多糖提取中較為溫和高效的方法，其原理是根據(jù)多糖化合物的化學(xué)組成特性差異，在溶劑中選擇性的加入生物酶，降低活化能，軟化水解細(xì)胞壁，增大細(xì)胞通透性，促使胞內(nèi)活性成分流于溶劑中［12］。對(duì)于植物性多糖，通常選用木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等生物酶進(jìn)行提取，在提取多糖的過(guò)程中，多酚等物質(zhì)也會(huì)被分離提取，部分提取物的質(zhì)量還會(huì)在酶的作用下增加。此法在溫和條件下即可操作，提取率高、能有效避免降解多糖的生物活性且易除雜質(zhì)，但在操作時(shí)要確保條件適宜、酶活性穩(wěn)定不失活，由于酶解法成本較高、提取條件嚴(yán)格，工業(yè)化應(yīng)用不太現(xiàn)實(shí)。

賀便等［13］采用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助酶解法提取松針多糖，在提取中以1：1 的比例加入果膠酶和纖維素酶，各因素對(duì)多糖得率影響順序?yàn)椋好柑砑恿?提取溫度>超聲時(shí)間>固液比>酶解時(shí)間，當(dāng)固液比為1：25 g·mL-1，超聲時(shí)間25 min，酶解時(shí)間2 h，提取溫度60℃，酶添加量5% 時(shí)為最佳提取工藝，此時(shí)松針多糖提取率為3.97%。

1.5 超臨界流體萃取法

超臨界流體的密度相似于液體且擴(kuò)散系數(shù)遠(yuǎn)大于液體，有較強(qiáng)的滲透溶解力，能夠迅速滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，適合作為溶劑進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)。對(duì)于某些特定物質(zhì)來(lái)說(shuō)一般存在一個(gè)臨界點(diǎn)，當(dāng)處于超臨界狀態(tài)下，提取物被隔段萃取，恢復(fù)正常氣壓后，提取物與氣體分離溶于溶劑中，達(dá)到萃取效果［14］。此法工藝簡(jiǎn)便、過(guò)程易調(diào)控、萃取效率高且無(wú)溶劑殘留，能夠確保多糖生物活性穩(wěn)定。王振宇等［15］將紅松籽殼磨粉、過(guò)40～60 目篩，以過(guò)氧化值為參考設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，得出最佳萃取參數(shù)為：提取溫度35℃，萃取壓力40 MPa，提取時(shí)間2 h，得率為2.4%。

1.6 陰離子反向膠束體系萃取法

陰離子反向膠束體系萃取技術(shù)在多糖提取方面屬于新興技術(shù)，用該種方法提取植物多糖是一種協(xié)同過(guò)程，即溶液在水相形式下接觸反膠束微粒，此時(shí)多糖移入微粒中屬于萃取過(guò)程；當(dāng)該微粒接觸其他水相時(shí)多糖會(huì)回到水相中，該過(guò)程屬于反萃取過(guò)程，經(jīng)過(guò)整個(gè)萃取與反萃取后，多糖化合物就被分離出來(lái)［16］。此法快速高效、能夠保障多糖生物活性不流失，但有關(guān)陰離子反向膠束體系萃取法提取紅松多糖的研究報(bào)道罕見(jiàn)，需在今后進(jìn)一步研究試驗(yàn)，完善相關(guān)技術(shù)資料。

2 紅松多糖的生物活性

2.1 抗氧化活性

自由基是含有未成對(duì)電子的原子基團(tuán)，具有強(qiáng)氧化性。自由基內(nèi)的單電子為形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，常傾向和其他原子結(jié)合，因此自由基常處于活潑不穩(wěn)定狀態(tài)。機(jī)體內(nèi)常見(jiàn)自由基有：羥自由基、烷氧基、超氧陰離子等。在正常狀態(tài)下，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)會(huì)嚴(yán)格控制自由基含量，使其處于動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)體內(nèi)自由基累積過(guò)多時(shí)，會(huì)產(chǎn)生氧化脅迫，對(duì)各細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成損傷、導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂、加速衰老并且誘發(fā)出多種疾病［17］。1956 年被提出的自由基學(xué)說(shuō)是目前公認(rèn)的衰老學(xué)說(shuō)之一，而具還原力的抗氧化物質(zhì)能夠?qū)Χ嘤嘧杂苫鸬阶钄嗲宄饔?，達(dá)到延緩衰老的效果。

多糖屬于外源性抗氧化物質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)許多藥用植物多糖具有抗氧化活性，植物多糖通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性從而阻斷氧化反應(yīng)過(guò)程，利用多糖內(nèi)的羥基結(jié)構(gòu)絡(luò)合氧化必需的金屬離子，也可以直接作用于自由基抑制其增多。

付昊雨等［18］進(jìn)行小鼠體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)，結(jié)果表明高濃度的松籽殼多糖提高了肝臟血清中超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，呈極顯著性影響；從總體數(shù)據(jù)來(lái)看，在低濃度下多糖依然提高了小鼠的抗氧化活性。通過(guò)進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn)測(cè)定松塔多糖的抗氧化活性，以抗壞血酸的清除率作為對(duì)照，結(jié)果顯示當(dāng)多糖濃度為15 mg·mL-1時(shí)，對(duì)ABTS?+的清除率達(dá)到80%；當(dāng)濃度持續(xù)升高到30 mg·mL-1時(shí)，ABTS?+的清除率升高幅度趨于平緩，羥基自由基清除率達(dá)80%［19］。劉超［20］在測(cè)定松塔粗多糖還原能力和DPPH自由基清除率的研究中發(fā)現(xiàn)，不同組分的粗多糖都具有一定的體外抗氧化活性，且抗氧化能力與多糖濃度呈正相關(guān)。沈巳焱［21］在對(duì)比紅松不同部位多糖的半最大效應(yīng)濃度（Concentra?tion for 50% of maximal effect，EC50）值時(shí)認(rèn)為，多糖分子量、單糖組分的區(qū)別會(huì)影響清除自由基的能力。由于松針多糖分子量小、D-葡萄糖和D-木糖含量多，因此羥基自由基清除率最高，在8 mg·mL-1時(shí)就達(dá)到了67.72%；而松塔多糖中糖醛酸和D-甘露糖含量高，ABTS?+清除力和還原力強(qiáng)于其他部位的多糖。

2.2 抗腫瘤活性

腫瘤是機(jī)體局部細(xì)胞在刺激因素的作用下，增生與異常分化形成的新生物，會(huì)嚴(yán)重威脅到機(jī)體正常生命活動(dòng)。目前已有多種植物多糖化合物被證實(shí)有抗腫瘤活性，這些多糖大都有硫酸基。植物活性多糖對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞的毒副作用很小，能夠通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)活性對(duì)抗腫瘤細(xì)胞，或者抑制腫瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)其凋亡［9］。

呂永俊等［22］選用三種腫瘤細(xì)胞分別給小鼠接種0.2 mL，以此考察紅松多糖的抗腫瘤活性，結(jié)果表明60 mg·kg-1的松塔多糖對(duì)鼠肉瘤細(xì)胞的抑制率達(dá)48.9%，有極顯著性影響；60 mg·kg-1的松籽殼多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞平均抑制率為38.2%，對(duì)肝癌腹水型小鼠的生命延長(zhǎng)率有21.4%。有研究顯示，100 mg·kg-1的松塔多糖對(duì)荷瘤小鼠的毒副作用小，抑瘤率為33.07%，有顯著性影響；當(dāng)濃度達(dá)到200 mg·kg-1時(shí)，抑瘤率升高至48.33%，但毒副作用也隨之加強(qiáng)［23］。

2.3 免疫調(diào)節(jié)活性

免疫調(diào)節(jié)是機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答過(guò)程中維持自身穩(wěn)定的生理功能。植物多糖能夠作為免疫調(diào)節(jié)劑以多種途徑參與生理活動(dòng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用、結(jié)合壞死細(xì)胞清除病原體；促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞免疫；激活補(bǔ)體系統(tǒng)；促進(jìn)細(xì)胞因子的生成。

有研究者運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法對(duì)松籽殼多糖進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)研究，結(jié)果顯示：100 mg·kg-1的多糖對(duì)小鼠臟脾中T細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白含量有升高作用；200 mg·kg-1的多糖使血清干擾素蛋白含量比對(duì)照組增加了54.56 ng·L-1，使腫瘤壞死因子上調(diào)，較對(duì)照升高了30.67 ng·L-1；該實(shí)驗(yàn)證實(shí)紅松多糖能夠間接活化某些細(xì)胞以達(dá)到調(diào)節(jié)免疫功效，具有免疫調(diào)節(jié)活性［9］。T Baba 等［24］證明松籽殼多糖能增強(qiáng)激活小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，隨之激活T 細(xì)胞對(duì)異體抗原的反應(yīng)性。孫芳［25］采用遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和碳廓清試驗(yàn)對(duì)松仁多糖的免疫功能進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示250 mg·kg-1的多糖對(duì)小鼠足跖厚度和吞噬指數(shù)有顯著性增加效果，松仁多糖能夠使免疫器官增重，提高機(jī)體免疫力。

2.4 抗菌活性

有關(guān)多糖抑菌活性的研究，多數(shù)集中在植物多糖和微生物多糖上。馮雪［26］采用牛津杯法，測(cè)定抑菌圈以考察松塔多糖的抑菌情況，結(jié)果顯示隨多糖濃度增加，抑菌效果越好；對(duì)大腸桿菌、青霉的抑制作用較強(qiáng)，抗菌能力是有選擇性的；最小抑菌濃度分別為：大腸桿菌0.5 mg·mL-1，青霉0.25 mg·mL-1，釀酒酵母0.25 mg·mL-1；用不同分子量的多糖抑制不同菌種，各菌種間抑制強(qiáng)弱效果不同。在蒙琦［27］的研究中，松塔多糖濃度和對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌的抑制作用呈正相關(guān)，當(dāng)濃度為0.5% 時(shí)即可對(duì)沙門氏菌產(chǎn)生抑制效果，各菌種抑制強(qiáng)弱為：沙門氏菌>大腸桿菌>志賀氏菌。

2.5 其他活性

通常，內(nèi)含硫酸基的多糖具有抗病毒活性，微生物細(xì)胞壁具β-1，3 葡聚糖結(jié)構(gòu)，而這種結(jié)構(gòu)屬于機(jī)體防御誘發(fā)基因［28］。多糖通過(guò)抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫等途徑，對(duì)皰疹病毒、登革熱病毒、甲型肝炎病毒等病毒有抑制作用，且對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)毒副作用［29］。 此外，紅松多糖還具有降血脂［30］、降血糖［31］、抗輻射［32］等多種生物活性。

3 問(wèn)題與展望

我國(guó)紅松資源豐富，但松塔、松針等常作為加工副產(chǎn)品丟棄，以至于資源轉(zhuǎn)化率較低。有關(guān)多糖的研究是21世紀(jì)的熱點(diǎn)問(wèn)題，已有研究證實(shí)紅松多糖具有多種生物活性，提取方法的差異會(huì)導(dǎo)致多糖中單糖組成不同，進(jìn)而影響生物活性效果。今后可以從紅松多糖構(gòu)象等分子方面進(jìn)行后續(xù)深入探索，為紅松資源的合理開(kāi)發(fā)提供多種可行方案。