黑曲霉B1401固態(tài)發(fā)酵茶葉加工廢料產(chǎn)單寧酶的研究

肖甜甜，胡娜，馮子娟，吳鑫穎*，邱樹(shù)毅

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

單寧?；饷福‥C 3.1.1.20），也稱(chēng)單寧酶、鞣酸酶，催化可水解單寧，如單寧的酯鍵分解，產(chǎn)生沒(méi)食子酸、葡萄糖、六羥基聯(lián)苯二甲酸及醇類(lèi)等物質(zhì)[1-2]。單寧酶是被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）確認(rèn)并公布的一種安全的食品添加劑[3]，日本等多個(gè)國(guó)家均已批準(zhǔn)將其應(yīng)用于食品工業(yè)，我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的2008年第26號(hào)公告中也將單寧酶加入食品添加劑目錄[4]。在食品工業(yè)中，單寧酶是一種重要的酶，在飲料工業(yè)尤其是茶飲料工業(yè)中，具有不可替代的作用[5-6]。單寧酶通過(guò)水解茶多酚與沒(méi)食子酸間的酯鍵，降低茶湯渾濁度、提高茶葉有效成分的溶出、改善茶飲料感官品質(zhì)。此外，在釀酒行業(yè)中，由于多酚物質(zhì)的存在，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)，單寧酶可以降解酚類(lèi)，使啤酒澄清、改善葡萄酒風(fēng)味、提高麥芽多酚穩(wěn)定性、降低果酒和果汁質(zhì)變的可能性等[4，7]。單寧酶廣泛存在于霉菌、酵母、細(xì)菌中，通過(guò)微生物發(fā)酵是獲取單寧酶的主要手段，曲霉屬真菌（Aspergillus）是當(dāng)前單寧酶產(chǎn)生菌中被廣泛研究并得以生產(chǎn)應(yīng)用的一類(lèi)微生物，具有優(yōu)異的單寧酶合成能力。單寧酶是一種誘導(dǎo)型細(xì)胞外酶（誘導(dǎo)酶），利用不同的曲霉菌株，以棕櫚仁餅[8]、甘蔗渣和稻草桿[9]、腰果渣[10]等含單寧類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)品加工廢料為底物，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵可提高單寧酶的產(chǎn)量，降低酶的生產(chǎn)成本[1]。因此，作為富含單寧的農(nóng)產(chǎn)品加工廢料是低成本生產(chǎn)單寧酶底物的良好來(lái)源。茶葉加工廢料中含豐富的單寧，僅茶葉梗中就含18%～36%[11]。同時(shí)，茶葉加工廢料價(jià)格低廉，除單寧外，纖維素和半纖維素等碳水化合物含量豐富，是微生物發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶的潛在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。與其它研究相比，利用茶葉加工廢料的成本較低，單寧酶產(chǎn)率較高[12-13]。開(kāi)發(fā)高酶活、高穩(wěn)定性、低成本的單寧酶生產(chǎn)工藝，對(duì)單寧酶的工業(yè)生產(chǎn)和食品工業(yè)的發(fā)展具有重要意義[14-16]。

貴州作為我國(guó)產(chǎn)茶大省，也是世界知名的茶葉原生地和優(yōu)生區(qū)。在制茶過(guò)程中的廢料大部分都被丟棄，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，生產(chǎn)每噸綠茶的廢料約30 kg，紅茶的廢料50 kg，烏龍茶的廢料高達(dá)400 kg，僅貴州省每年茶葉加工廢料達(dá)數(shù)萬(wàn)噸[17-18]。為避免茶資源的浪費(fèi)，開(kāi)發(fā)一種茶葉加工廢料的綜合利用方式具有重要意義。本研究為了開(kāi)發(fā)貴州茶葉生產(chǎn)過(guò)程中廢料的綜合利用價(jià)值，采用課題組實(shí)驗(yàn)室中前期誘變的菌株黑曲霉B1401[19]固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶，并優(yōu)化發(fā)酵工藝，可獲得用于食品工業(yè)的低成本的單寧酶產(chǎn)品，開(kāi)發(fā)新型單寧酶的生產(chǎn)原料，奠定食品工業(yè)化應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉 B1401（Aspergillus niger B1401）：貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏；茶葉加工廢料：貴州省遵義市湄潭縣永興茶廠(chǎng)；尿素、硝酸鈉、可溶性淀粉、磷酸氫二鉀（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；培養(yǎng)基：0.3% NaNO3、0.1% K2HPO4·3H2O、0.05% MgSO4·7H2O、0.05% KCl、0.001% FeSO4、1%單寧酸、2%蔗糖、4%瓊脂，pH 5.0。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：5g茶葉加工廢棄物，8mL蒸餾水，于121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì)（721S）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；霉菌培養(yǎng)箱（MJ-160B-II）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng)；高速多功能粉碎機(jī)（HC-280T2）：永康市綠可食品機(jī)械有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（BXM-30R）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；pH計(jì)（PHS-3C）：上海虹誼儀器儀表有限公司；顯微鏡（ECLIPSE-E200）：Nikon公司；高速冷凍離心機(jī)（MutlifugeX1R）：德國(guó) Themo Scietific Heraeus；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-111B）：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉B1401孢子菌懸液的制備

參照胡娜等[20]的孢子懸浮液的制備方法，制成孢子菌懸液，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板鏡檢，使菌種數(shù)達(dá)到1.0×108CFU/mL的水平。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶

1.3.2.1 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基配好后于121℃滅菌20 min，冷卻后在無(wú)菌條件下接種1 mL黑曲霉B1401孢子懸液，混勻置于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)96 h。

1.3.2.2 粗酶液的制備

在發(fā)酵成熟培養(yǎng)物中加入pH 5.0的檸檬酸緩沖溶液50 mL，攪拌均勻，140 r/min浸提1 h，浸提后的培養(yǎng)基用快速定性濾紙過(guò)濾，獲得粗酶液。

1.3.3 酶活力測(cè)定

酶活力的定義：在40℃，pH 5.0條件下，每分鐘內(nèi)水解底物沒(méi)食子酸丙酯產(chǎn)生1 μmol沒(méi)食子酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

酶活力的測(cè)定方法：按照保玉心等[21]和胡娜等[20]的方法并做相關(guān)改進(jìn)，根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算。

酶活力X=（A測(cè)定值-A對(duì)照）×K×c×200×0.001/（5×5）

式中：X為酶活力，U/g；K為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程的斜率；c為稀釋的倍數(shù)。200為0.25 mL酶液轉(zhuǎn)換成50 mL總酶液的倍數(shù)；0.001為μmol/L變換μmol/mL的倍數(shù)；5為單寧酶催化底物反應(yīng)的時(shí)間，min；5為固體發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在原料顆粒40目，無(wú)機(jī)鹽離子0.05% K2HPO4、0.1% NaCl、0.1% MgSO4，表面活性劑0.5% Tween-80條件下的培養(yǎng)基中各因素固定值分別為：碳源為0.6%可溶性淀粉、氮源比（尿素 ∶硝酸鈉）為 0.7 ∶0.3（g/g）、裝載量5 g、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間96 h、液固比為1.8∶1（mL/g）、接種量20%。保持其它6個(gè)因素不變，每次改變1個(gè)因素，測(cè)定酶活，以研究各因素變量與酶活力的關(guān)系。

1.3.5 Plackett-Burman試驗(yàn)（PB試驗(yàn)）

Plackett-Burman試驗(yàn)是篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要針對(duì)因子數(shù)較多，且未確定眾因子相對(duì)于響應(yīng)變量的顯著影響，采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[22]。通過(guò)單因素優(yōu)化結(jié)果，對(duì)氮源比（A）、可溶性淀粉含量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）、接種量（E）、液固比（F）、裝載量（G）7個(gè)因素進(jìn)行考察，篩選影響單寧酶酶活力的顯著性因素。每個(gè)影響因素取高低2個(gè)水平，以高水平（1）和低水平（-1）表示，以單寧酶酶活力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。選用試驗(yàn)次數(shù)N=11的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，預(yù)留4個(gè)虛擬項(xiàng)（H、J、K、L）做誤差分析，試驗(yàn)重復(fù) 3次取平均值，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 PB試驗(yàn)因素水平Table 1 The level of experiment factors of PB test

1.3.6 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)（BB試驗(yàn)）

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，篩選出氮源比、可溶性淀粉含量、發(fā)酵時(shí)間這3個(gè)影響單寧酶酶活力的顯著性因素。以這3個(gè)因素為自變量，單寧酶酶活力為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 BB試驗(yàn)因素水平Tabel 2 The level of experimental factors of BB test

1.3.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)響應(yīng)面法得到的最優(yōu)組合條件進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)置5組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證模型的有效性。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，Origin 8.6軟件作圖，多重比較 （Duncan氏新復(fù)極差檢測(cè)）相關(guān)統(tǒng)計(jì)利用SPSS17.0和Design-expert（version 8.0.6.1）分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

氮源比例對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，當(dāng)尿素與硝酸鈉的比例逐漸增大時(shí)，單寧酶酶活力先增加后減少，當(dāng)比例為0.7∶0.3（g/g）時(shí)，單寧酶酶活力達(dá)最大值26.82 U/g。所以選擇尿素與硝酸鈉的比例為0.7∶0.3（g/g）作為培養(yǎng)基的氮源。

圖1 不同氮源比例對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響Fig.1 Effect of different nitrogen source proportion on tannase produced by Asp.niger B1401

可溶性淀粉含量對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同可溶性淀粉含量對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響Fig.2 Effect of different soluble starch concents on tannase produced by Asp.niger B1401

由圖2可知，菌株在低含量的可溶性淀粉條件下酶活力很弱，隨著可溶性淀粉含量的增加，菌株產(chǎn)酶呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。當(dāng)可溶性淀粉含量達(dá)0.5%時(shí)，菌株B1401產(chǎn)酶活力為17.43 U/g。繼續(xù)增加可溶性淀粉含量，酶活力反而降低，這可能是因?yàn)樘荚吹暮窟^(guò)高，容易出現(xiàn)抑制效應(yīng)，阻礙單寧酶的合成。適宜的碳源含量有利于微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。所以最終選擇0.5%的可溶性淀粉作為培養(yǎng)基的碳源。

裝載量對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響見(jiàn)圖3。

圖3 裝載量對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響Fig.3 Effect of different medium contents on tannase produced by Asp.niger B1401

由圖3可知，隨著裝載量的增加，單寧酶酶活力逐漸下降。三角瓶中的裝載量與裝載厚度會(huì)直接影響培養(yǎng)基中氧氣的供應(yīng)及內(nèi)部溫度。適量的供氧能促進(jìn)本試驗(yàn)菌株對(duì)單寧酶的合成，同時(shí)少的裝載量能加快培養(yǎng)基內(nèi)部熱量的散發(fā)，防止溫度太高而致使菌體生長(zhǎng)緩慢而影響產(chǎn)酶。但裝載量過(guò)小，降低了設(shè)備利用率，不利于控制溫度和濕度。在生產(chǎn)過(guò)程中可以通過(guò)加強(qiáng)通風(fēng)和補(bǔ)水來(lái)提高酶活的產(chǎn)量。所以最終選培養(yǎng)基裝載量為5 g進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響Fig.4 Effect of different fermentation time on tannase produced by Asp.niger B1401

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，單寧酶活力先升高后下降。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到96 h時(shí)，單寧酶的活力達(dá)到最大值33.64 U/g。這是由于在發(fā)酵早期時(shí)，孢子開(kāi)始萌發(fā)，菌絲體逐漸形成，此時(shí)微生物生長(zhǎng)速度緩慢，因而產(chǎn)酶量較低。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸上升。但繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵液中碳氮源及其它微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)慢慢被消耗，菌體會(huì)開(kāi)始出現(xiàn)衰老，在后期菌株甚至出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，進(jìn)而影響產(chǎn)酶。所以選擇發(fā)酵時(shí)間為96 h。

發(fā)酵溫度對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響Fig.5 Effect of different fermentation temperature on tannase produced by Asp.niger B1401

由圖5可知，發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，單寧酶的活力達(dá)到最大值31.59 U/g。發(fā)酵溫度過(guò)低或過(guò)高時(shí)，直接影響黑曲霉中的許多生化反應(yīng)和代謝活動(dòng)，也可能會(huì)引起許多環(huán)境因子的改變，從而使黑曲霉生長(zhǎng)緩慢，單寧酶酶活降低。所以選擇發(fā)酵溫度為30℃進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

接種量對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響見(jiàn)圖6。

圖6 接種量對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響Fig.6 Effect of different inoculum size on tannase produced by Asp.niger B1401

由圖6可知，隨著接種量的增加，單寧酶活力先增加后減少。當(dāng)接種量為30%時(shí)，單寧酶的活力達(dá)到最大值35.1 U/g。這可能是接種量增加，使目標(biāo)菌成為基質(zhì)中的優(yōu)勢(shì)菌群，快速適應(yīng)環(huán)境，從而減少雜菌生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)，縮短延遲期。但當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)，營(yíng)養(yǎng)、溶氧等不能滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)需要，酶活力下降。因此，最終選擇接種量30%。

液固比對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響見(jiàn)圖7。

圖7 液固比對(duì)黑曲霉B1401產(chǎn)單寧酶的影響Fig.7 Effect of different liquid-solid ratio on tannase produced by Asp.niger B1401

由圖7可知，液固比為1.8∶1（mL/g）時(shí)，單寧酶的活力最高為34.4 U/g。培養(yǎng)基含水量影響微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。當(dāng)培養(yǎng)基中含水量低時(shí)，沒(méi)有充足的水分供微生物生長(zhǎng)利用；當(dāng)培養(yǎng)基中含水量過(guò)高時(shí)，培養(yǎng)基易出現(xiàn)成團(tuán)現(xiàn)象，會(huì)阻礙培養(yǎng)基中的菌株的氧分供應(yīng)，進(jìn)而降低了酶活力。所以，培養(yǎng)基中適宜的含水量能夠彌補(bǔ)固體在發(fā)酵過(guò)程中的水分損失，有利于單寧酶的產(chǎn)生。因此，最終選擇鹽溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基的比例為 1.8 ∶1（mL/g）。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

PB試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、各因素影響情況見(jiàn)表4及PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)主效應(yīng)分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 PB試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The experimental results in PB test

表4 各因素對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)單寧酶影響情況Table 4 Various factors on the fermentation medium for tannase production

由表4可以得出液固比、裝載量、接種量對(duì)提高發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)單寧酶酶活力有正效應(yīng)；可溶性淀粉含量、氮源比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度則具有負(fù)效應(yīng)。由表5可知，這7個(gè)因素對(duì)單寧酶酶活提高的影響順序依次為：發(fā)酵時(shí)間>可溶性淀粉含量>氮源比>接種量>發(fā)酵溫度>裝載量>液固比。因此選擇發(fā)酵時(shí)間、可溶性淀粉含量和氮源比3個(gè)顯著因素進(jìn)行下一步優(yōu)化。

表5 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)主效應(yīng)分析結(jié)果Table 5 The main effect analysis results of PB experimental design

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析見(jiàn)表7。

表6 BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值結(jié)果Table 6 The results of BB experiment design and its response value

表7 BB響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 7 Analysis of variance of Box-Behnken response surface design

采用Design-expert（version8.0.6.1）分析軟件對(duì)表6中的響應(yīng)值與各因素進(jìn)行擬合回歸，得到單寧酶酶活力對(duì)氮源比（A）、可溶性淀粉含量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）的多元二次響應(yīng)面回歸模型：酶活力/（U/g）=44.82+5.64A-1.33B+4.03C-0.45AB+2.79AC-2.94BC-15.55A2-6.67B2-9.47C2。

由表7可知，回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來(lái)判定，概率p值越小，則其相應(yīng)變量的顯著程度就越高[23]。模型p=0.000 1<0.01，表明回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)p=0.103 4>0.05不顯著，因素A、C 極顯著（p＜0.01），因素 B 顯著（p＜0.05）；各因素的二次項(xiàng)均極顯著（p＜0.01）；交互項(xiàng)中AC及BC極顯著（p＜0.01）而 AB 不顯著（p＞0.05）。該模型的決定系數(shù)R2=0.996 9，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.992 8，說(shuō)明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度較好，自變量與響應(yīng)值之間線(xiàn)性關(guān)系顯著，即該試驗(yàn)可靠，可以用此模型對(duì)黑曲霉B1401利用茶葉加工廢料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶酶活力進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

響應(yīng)面結(jié)果見(jiàn)圖8～圖10。

圖8 氮源比和可溶性淀粉含量對(duì)黑曲霉B1401發(fā)酵產(chǎn)單寧酶活性影響的響應(yīng)面結(jié)果Fig.8 Response surface result of the effect of nitrogen source ratio and soluble starch content on the activity of tanninase produced by Asp.niger B1401 fermentation

由圖8～圖10的響應(yīng)面結(jié)果可知，兩因素之間的影響基本呈拋物線(xiàn)型關(guān)系，且均有一個(gè)極值點(diǎn)，變化趨勢(shì)都是先增大后減少，等高線(xiàn)呈圓形說(shuō)明兩因素交互作用不顯著，呈橢圓或者馬鞍形則表明作用顯著[24]。圖8中單寧酶的酶活力隨氮源比和可溶性淀粉含量的增加先升高后降低，圖9中酶活力大小隨氮源比和發(fā)酵時(shí)間的增加呈先升高后降低，圖10中單寧酶的酶活力大小隨著可溶性淀粉含量和發(fā)酵時(shí)間的增加，呈先升高后降低。結(jié)合表7可知，氮源比和發(fā)酵時(shí)間對(duì)單寧酶的酶活力影響大于可溶性淀粉含量。

圖9 氮源比和發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉B1401發(fā)酵產(chǎn)單寧酶活性影響的響應(yīng)面結(jié)果Fig.9 Response surface result of the effect of nitrogen source ratio and fermentation time on the activity of tanninase produced by Asp.niger B1401 fermentation

圖10 可溶性淀粉含量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉B1401發(fā)酵產(chǎn)單寧酶活性影響的響應(yīng)面結(jié)果Fig.10 Response surface result of the effect of soluble starch content and fermentation time on the activity of tanninase produced by Asp.niger B1401 fermentation

2.4 最優(yōu)配方的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

由Design-expert（version8.0.6.1）軟件分析得出：當(dāng)?shù)幢龋ˋ）即尿素：硝酸鈉為 0.74 ∶0.26（g/g）、可溶性淀粉含量（B）為0.48%、發(fā)酵時(shí)間（C）為99 h時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到最大值，酶活力為46.06 U/g。為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，在預(yù)測(cè)最佳培養(yǎng)基配方條件下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)（重復(fù)試驗(yàn)5次），試驗(yàn)結(jié)果表明（表8），實(shí)際酶活值與預(yù)測(cè)值的精度達(dá)99.91%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化的模型適合于黑曲霉B1401利用茶葉加工廢料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的工藝。該試驗(yàn)基于響應(yīng)面優(yōu)化的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有使用價(jià)值。

表8 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)Table 8 Response surface verification test

3 結(jié)論與展望

影響黑曲霉生長(zhǎng)代謝的因素較多，Plackett-Burman設(shè)計(jì)可通過(guò)比較各個(gè)因子兩水平的差異與整體的差異來(lái)確定因子的顯著性，從而達(dá)到篩選的目的，避免在后期的優(yōu)化試驗(yàn)中由于因子數(shù)太多或部分因子不顯著而浪費(fèi)試驗(yàn)資源，但篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)不能區(qū)分主效應(yīng)與交互作用的影響。Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面通過(guò)回歸分析可研究幾種因素間的交互作用，通過(guò)建立擬合性較好的數(shù)學(xué)模型，既能進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的擬合，篩選出最佳工藝，又能較好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)的響應(yīng)值，信息量大，精密度高。

本研究運(yùn)用Plackett-Burman試驗(yàn)，結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化黑曲霉B1401利用茶葉加工廢料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件。試驗(yàn)結(jié)果表明：0.48%可溶性淀粉，氮源為復(fù)配氮源，即尿素∶硝酸鈉為 0.74 ∶0.26（g/g），接種量 30%，裝載量 5 g，液固比為 1.8 ∶1（mL/g），發(fā)酵溫度為 30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為 99 h，此條件下單寧酶酶活力可達(dá)46.06 U/g。而吳昌正等[25]研究的茶梗固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶酶活力為23.6 U/g，張楓等[26]研究的黑曲霉JMU-TS528模擬固態(tài)發(fā)酵茶梗產(chǎn)單寧酶酶活為19.22 U/g，周羅娜等[27]研究的高產(chǎn)單寧酶的黑曲霉菌株在固態(tài)培養(yǎng)中獲得的酶活力為27.68 U/g。同時(shí)楊亞力等[28]利用黑曲霉發(fā)酵所得的單寧酶對(duì)滇橄欖汁進(jìn)行處理，使滇橄欖汁的澄清度、穩(wěn)定性均有提高，汁中懸浮物、總酸、黏度都得到降低，顯著提高了滇橄欖汁的感官品質(zhì)。本研究中的黑曲霉菌株利用茶葉加工廢料固態(tài)發(fā)酵可獲得高產(chǎn)量的單寧酶酶活力（46.02 U/g），可有效降低成本，若將本工藝生產(chǎn)所得的單寧酶應(yīng)用到食品工業(yè)化生產(chǎn)中，在提高產(chǎn)品品質(zhì)的同時(shí)又能降低工業(yè)生產(chǎn)成本。但本研究還需在合適的生物反應(yīng)器中進(jìn)行放大試驗(yàn)生產(chǎn)，以促進(jìn)單寧酶固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。