大孔樹脂分離紅花籽粕酶解產物制備抗氧化肽的工藝研究

（武漢工商學院環(huán)境與生物工程學院，湖北 武漢 430065）

紅花籽是紅花（Carthamus tinctorius L.）的種子，經機械壓榨或溶劑浸提制油后的副產品即為紅花籽粕[1]。紅花籽粕不僅價格低廉，而且具有很高的營養(yǎng)和藥用價值[2-3]。紅花榨油后的餅粕中粗蛋白的含量約為19%，去殼榨油后的餅粕中粗蛋白的含量約為36%，且粗蛋白消化率達到77%，其蛋白質中還有人體所需的18種氨基酸，且有30%左右的氨基酸為人體必需氨基酸，除此之外紅花籽中還有多種微量成分，如木脂素、黃酮類、多酚、糖苷以及苯丙烯酞-5-羥色胺等[4-5]。

從植物中以酶解法制備的天然抗氧化肽已經得到廣泛研究，這充分證明植物中優(yōu)質蛋白具有制備抗氧化多肽的潛力[6-7]。與合成抗氧化劑相比，植物性抗氧化肽安全性高、抗氧化活性好，被廣泛地應用于功能性食品和食品添加劑等[8-9]。孫立等采用酶法制備紅花籽粕抗氧化肽，采用超濾、凝膠過濾層析對紅花籽多肽的抗氧化活性進行研究，證實了紅花籽粕制備抗氧化肽的可行性[10-11]。

目前大孔樹脂廣泛用于純化天然產物中的活性物質[12]。程云輝等發(fā)現(xiàn)DA201-C大孔樹脂能有效分離富集麥胚蛋白酶解物中含疏水性氨基酸的肽段，從而顯著提高其體外抗氧化活性[13]。玫瑰多酚粗提液經AB-8樹脂分離純化后獲得的純化多酚均比原液有更好的DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和羥基自由基清除能力[14]。

目前大多數(shù)紅花籽粕被簡單地加工成廉價飼料，而忽略其中優(yōu)質蛋白的研究和開發(fā)利用。對紅花籽粕的研究多集中于營養(yǎng)分析及蛋白提取方法、酶解工藝等。本文比較不同酶解產物抗氧化性后，研究大孔樹脂分離工藝對多肽含量的影響，制備抗氧化肽，為提高紅花籽粕附加值，尋求植物原料抗氧化肽提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅花籽：市售；堿性蛋白酶 Alcalase（240 000 U/g）：丹麥諾維信；中性蛋白酶（60 000 U/g）：武漢市華順生物技術有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；AB-8、X-5、D101、D301、HPD600、D315、D450大孔樹脂（純度99%）：天津市海光化工有限公司；三氯乙酸、三氯化鐵、焦性沒食子酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、鄰菲啰啉（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司。

超聲波清洗機（KQ-100E型）：昆山市超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機（GL-21M）：湘麓離心機儀器有限公司；恒溫水浴鍋（HH-2）：金壇市宏華儀器廠；冷凍真空干燥機（SCIENTZ-10N）：寧波新芝生物科技股份有限公司；紫外分光光度計（752型）、可見分光光度計（722E型）：上海光譜儀器有限公司；自動部分收集器（BSZ-160）、恒流泵（HL-2）：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅花籽預處理

將紅花籽經石油醚浸出法提油后收集沉淀并烘干至恒重，放入粉碎機再次粉碎，過50目篩，收集粉末即為紅花籽粕[15]。

1.2.2 紅花籽粕酶解工藝

取2.5 g紅花籽粕于錐形瓶中，加入50 mL磷酸鹽緩沖液，酶在酶解溫度下保溫10 min后，按照表1方式酶解。酶解產物置于離心管中用高速冷凍離心機4 ℃，10 000 r/min離心 20 min，取上清液備用[16-20]。紅花籽粕酶解工藝見表1。

表1 紅花籽粕酶解工藝Table 1 The enzymatic hydrolysis process of safflower seed meal

1.2.3 酶解產物抗氧化性測定

對上清液進行還原力、DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力的測定[21-23]，篩選出最適酶解工藝。

1.2.4 多肽含量測定

采用雙縮脲法，在540 nm波長下測定吸光值，以吸光值為縱坐標（y），牛血清白蛋白濃度為橫坐標（x），通過Excel繪制標準曲線，求得樣品溶液的多肽含量（mg/mL）[24]。標準曲線回歸方程為：y=0.123 6x+0.002 6，R2=0.998 2（>0.99），線性關系較好，通過吸光度可計算出樣品多肽含量。

1.2.5 大孔樹脂的篩選

1.2.5.1 吸附率的計算

選用 AB-8、X-5、D101、D301、HPD600、D315、D450 7種大孔樹脂，取不同種類的大孔樹脂2.5 g于錐形瓶中，加入20 mL酶解液，放入恒溫振蕩箱中24 h（25℃，120 r/min）后取上清液測定溶液中剩余多肽含量[25]。根據公式（1）計算吸附率[26]。

式中：A1為吸附前溶液初始多肽含量，mg/mL；A2為吸附后溶液剩余多肽含量，mg/mL。

1.2.5.2 解析率的計算

將充分吸附24 h后的樹脂取出過濾放入錐形瓶中，加入20 mL體積分數(shù)為70%的乙醇，乙醇能和大孔樹脂進行分子態(tài)的物質競爭吸附，使物質轉為溶解于乙醇，從而被解析下來[27]。放入恒溫振蕩箱中24 h（25℃，120 r/min），此時溶液中乙醇已揮發(fā)殆盡。取上清液測定溶液中剩余多肽含量。根據公式（2）計算解析率。

式中：A1為吸附前溶液初始多肽含量，mg/mL；A2為吸附后溶液剩余多肽含量，mg/mL；A3為解析后溶液多肽含量，mg/mL；V1為解析液體積，mL；V2為吸附液體積，mL。

1.2.6 動態(tài)洗脫工藝的確定

1.2.6.1 確定最佳上樣流速

將層析柱垂直安裝，徑高比為1∶12，裝柱后加入pH 7.0的磷酸鹽緩沖液沖洗至平衡后上樣12 mL酶解產物，多肽含量約8 mg/mL～10 mg/mL。試驗選用1、3、5、7、9 BV/h的流速進行收集，待酶解產物吸附完后，用恒流泵不斷注入70%乙醇溶液，每管收集3 mL，按照1.2.4的方法測定多肽含量，繪制曲線，確定最佳上樣流速[25]。

1.2.6.2 確定最佳上樣量

根據最佳上樣流速進行收集，每管收集3 mL，測定多肽含量，繪制泄漏曲線，確定最佳上樣量。

1.2.6.3 確定最佳乙醇洗脫濃度

根據最佳上樣量上樣，控制上樣流速直至吸附飽和，用pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗直至平衡，選用乙醇濃度分別為60%、70%、80%進行洗脫，控制洗脫速度為0.5 mL/min[26]。每管收集5 mL，測定多肽含量，確定最佳乙醇洗脫濃度。

1.2.6.4 確定最佳洗脫速度

試驗洗脫流速分別為0.25、0.50、1.00 mL/min進行洗脫。測定每管多肽含量，并繪制曲線，確定最佳洗脫速度[23]。

1.3 數(shù)據處理

2 結果與分析

2.1 酶解產物抗氧化性比較

按照1.2.2方法進行酶解，測定產物其抗氧化性，結果如表2所示。

表2 酶解產物抗氧化性試驗結果Table 2 The antioxidant activity result of enzymatic hydrolysis products

根據表2可知，堿性蛋白酶Alcalase酶解液具有較高的還原力和DPPH自由基清除能力，數(shù)值分別為1.755%和39.84%；木瓜蛋白酶水解的樣品羥自由基清除能力最高36.67%，但木瓜蛋白酶和超聲輔助木瓜蛋白酶得到酶解液超氧陰離子自由基清除能力太低，不足10%。原因可能為：還原力、超氧陰離子自由基清除能力等均為經典的體外抗氧化試驗，但側重點略有不同；再則外界酶解工藝條件的不同造成數(shù)據有偏差。

綜合分析，堿性蛋白酶Alcalase酶解得到酶解液具有最佳抗氧化性，確定該酶解產物進行大孔樹脂分離。測定Alcalase酶解產物中多肽含量為（10.71±0.23）mg/mL。

2.2 大孔樹脂的篩選

按照1.2.5的方法進行大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解析，計算吸附率和解析率，結果如表3所示。

表3 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解析試驗結果Table 3 Experimental results of static adsorption and analysis with different macroporous resins

由表3可知AB-8和HPD600的吸附率最高，分別為（92.16±1.03）%和（88.45±1.72）%；但是HPD600的解析率卻遠低于AB-8，且AB-8的解析率也是各類大孔樹脂當中最高的，為（90.65±2.57）%。AB-8型大孔吸附樹脂具有弱極性、網狀結構和高比表面積，能對分子大小不同的化合物進行篩選，適合于生物工程下游技術中蛋白質、多肽、核酸類等的分離純化[28]。由于它對多肽類的吸附不受pH值的影響，能簡化工藝，可以直接上樣[29]。對大孔樹脂AB-8靜態(tài)吸附與解析試驗進行重復試驗，其吸附率為（91.16±0.9）%、解析率為（87.13±0.4）%。故表明AB-8試驗數(shù)據穩(wěn)定可信，重復性高，因此可以使用AB-8進行后續(xù)試驗。

2.3 AB-8動態(tài)洗脫工藝的確定

2.3.1 最佳上樣流速的確定

按1.2.6.1試驗方法收集溶液，測定每管樣品多肽含量，結果如圖1所示。

圖1 不同上樣流速洗脫曲線Fig.1 Elution curves of different sample velocities different sample velocities

由圖1可知，當上樣流速大于等于5 BV/h時，曲線迅速達到峰值，流出液中多肽濃度高，說明上樣速度過快導致樹脂表面吸附達到飽和后，物質未被充分吸附并進入樹脂內部就被沖出柱外；當上樣流速為1、3 BV/h時，剛開始收集液中多肽含量緩慢增加，收集液20 mL時多肽含量達到峰值，分別為0.71、0.83 mg/mL，然后隨時間推移逐漸下降。從峰形出峰位置，3 BV/h比較合理穩(wěn)定，選用上樣流速3 BV/h合適。

2.3.2 最佳上樣量的確定

用3 BV/h上樣流速1.2.6.2試驗方法收集溶液，測定其多肽含量，結果如圖2所示。

圖2 AB-8大孔樹脂的泄漏曲線Fig.2 AB-8 leakage curve of macroporous resin

由圖2可知，當柱體積不變時，多肽含量隨著流出液的體積增加而增加，當收集到30 mL時，多肽含量達到最高1.31 mg/mL，隨后多肽濃度處于穩(wěn)定狀態(tài)，說明AB-8達到吸附飽和的狀態(tài)；由于收集的液體在24 mL時，多肽的濃度達到1.27 mg/mL，大于20 mL時為1.14 mg/mL，略小于30 mL的1.31 mg/mL，說明大孔樹脂已經趨于飽和狀態(tài)。從經濟角度出發(fā)，選用24 mL作為最佳上樣量適用。

2.3.3 最佳乙醇洗脫濃度的確定

采用3 BV/h上樣流速，上樣量為24 mL時，按試驗1.2.6.3的方法進行收集，測定收集液每管多肽含量，結果如圖3所示。

圖3 不同濃度乙醇洗脫曲線Fig.3 Elution curves of ethanol at different concentrations

由圖3可知，70%的乙醇作為洗脫液時出峰速度最快；60%乙醇在20 mL時出峰，達到為0.91 mg/mL后迅速下降；80%乙醇出峰較慢，但目標物峰值最大，達到1.30 mg/mL左右。根據目標物回收情況，選用80%乙醇作為洗脫液進行動態(tài)洗脫。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，乙醇作為洗脫劑分離純化活性產物時所用的濃度70%～80%之間，此時能解析分子量在1 500 kd以下小分子活性物質，如75%乙醇洗脫小麥蛋白得到抗氧化能力最高[30]、75%乙醇洗脫組分得到漢麻籽粕降血糖肽酶活最高[31]、75%的乙醇溶液純化麥冬總皂苷酶解產物效果最佳等[32]。

2.3.4 最佳洗脫流速的確定

按試驗1.2.6.4方法，以80%乙醇洗脫液對樣品進行洗脫，結果如圖4所示。

由圖4可知，當流速為0.25 mL/min時峰值最低，此時多肽最高僅為0.86 mg/mL，且拖尾現(xiàn)象嚴重；當洗脫速度為0.50 mL/min時，洗脫峰較低，拖尾現(xiàn)象明顯；流速0.50 mL/min時洗脫峰最大達到1.19 mg/mL，但峰面積較小，也存在一定的拖尾現(xiàn)象；1.00 mL/min洗脫時峰值最大，達到1.27 mL/min，且峰面積最大。綜上所述，洗脫流速選用1.00 mL/min較合適。

圖4 不同洗脫流速洗脫曲線Fig.4 Elution curves at different elution velocities

采用上樣流速3 BV/h、上樣量24 mL、乙醇洗脫濃度80%乙醇、洗脫流速1.00 mL/min最佳工藝進行分離純化堿性蛋白酶Alcalase酶解液，此時層析柱徑高比為1∶12，樹脂裝載量大，吸附率為93.35%，解析率90.43%，多肽損失率在15.60%左右，在合理范圍內。

2.4 AB-8大孔樹脂分離后抗氧化性測定

采用最佳工藝對堿性蛋白酶Alcalase酶解液進行分離，收集10 mL～30 mL洗脫液，冷凍干燥后用去離子水稀釋，測定AB-8分離后酶解液抗氧化性，結果如表4所示。

表4 AB-8分離后抗氧化性試驗結果Table 4 The antioxidant activity result after AB-8 separation

由表4可知，分離后隨著多肽含量的增加，抗氧化性增強；多肽含量1.00 mg/mLDPPH自由基清除能力達到37.08%，與分離前10.71 mg/mL相當；羥自由基清除能力1.00 mg/mL時達到39.21%，比分離前增加12.45%；超氧陰離子自由基清除能力57.14%，是原來的2.21倍。這說明AB-8分離后樣品與之前相比，較低濃度多肽含量，其DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力都有所增強。

3 結論

本文以紅花籽粕為原料，比較不同工藝下酶解籽粕后得到多肽的抗氧化性，研究大孔樹脂分離工藝，對比分離前后多肽抗氧化性，結果表明：堿性蛋白酶Alcalase酶解產物抗氧化性為最佳，測得還原力為1.755，DPPH自由基清除率39.84%，羥自由基清除率26.76%、超氧陰離子清除率25.90%，多肽含量達到10.71 mg/mL；比較不同大孔樹脂酶解產物的吸附率和解析率，AB-8效果最好，分別為92.16%和90.65%；選擇AB-8樹脂分離，采用上樣流速3BV/h、上樣量24mL、洗脫液濃度80%乙醇、洗脫流速1.00 mL/min時為最佳分離工藝。

比較AB-8分離前后樣品抗氧化性，多肽含量為1.00mg/mL時DPPH自由基清除能力達到37.08%，與分離前10.71 mg/mL相當；羥自由基清除能力1.00 mg/mL時達到39.21%，增加了12.45%；超氧陰離子自由基清除能力57.14%，是原來的2.21倍。說明AB-8分離后樣品比之前酶解樣品抗氧化性增強，可將其干燥后制成固體抗氧化肽，作為食品添加劑，為提高紅花籽粕附加值提供參考。