苦蕎抗氧化肽AFYRW穩(wěn)定性研究

孫浩，左婕，雷霆雯，王筑婷，莫曉川，張禮林，許慶忠，李紅梅

（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

食源性天然抗氧化肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性和較高的安全性，因此制備食源性抗氧化肽逐漸受到人們的重視[1]。已有研究者從發(fā)酵乳、鳶烏賊、大豆、乳清、玉米、雞蛋和魚(yú)等多種食材中制備得到抗氧化肽[2-6]。這些研究主要集中在抗氧化肽的酶解工藝、分離純化、功能鑒定等方面，而生產(chǎn)加工及儲(chǔ)存條件對(duì)其活性的影響研究較少。多肽作為蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物，與蛋白質(zhì)有類(lèi)似的性質(zhì)，其活性易受環(huán)境因素的影響，例如pH值、高溫、重金屬鹽、有機(jī)溶劑、超聲波、高壓等。肽類(lèi)物質(zhì)在生產(chǎn)加工、儲(chǔ)存過(guò)程中，可能會(huì)因氧化、脫氨基、水解或環(huán)化等作用而發(fā)生降解，導(dǎo)致其生物活性下降甚至完全喪失，這將嚴(yán)重影響到肽類(lèi)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用[7-8]。所以，研究肽類(lèi)物質(zhì)在不同環(huán)境中的穩(wěn)定性顯得尤為重要。

苦蕎作為一種重要的農(nóng)作物，因其風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有很好的保健食療作用，被譽(yù)為“長(zhǎng)壽食品”，已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。苦蕎的蛋白質(zhì)含量為13.4%，富含賴(lài)氨酸、苯丙氨酸等多種必需氨基酸，是一種營(yíng)養(yǎng)均衡的蛋白質(zhì)，可以很好地為人體所利用。有研究發(fā)現(xiàn)苦蕎蛋白具有降低膽固醇、降血脂、抗衰老、抑制乳腺癌的發(fā)生、抑制膽結(jié)石等作用[9-12]。前期通過(guò)堿性蛋白酶酶解苦蕎清蛋白得到苦蕎清蛋白酶解液，然后通過(guò)超濾分離、陰離子交換色譜、反向高效液相色譜成功分離出苦蕎活性肽組分，經(jīng)測(cè)序其氨基酸序列為Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp（AFYRW），分子量大小為741.8 Da，并發(fā)現(xiàn)其在體外有良好的抗氧化活性[13]，其清除羥自由基和DPPH自由基的IC50分別為0.65 mmol/L和0.64 mmol/L，同時(shí)還具有顯著的脂質(zhì)過(guò)氧化活性和還原性。這些結(jié)果表明AFYRW可能具有作為食品添加劑或功能性食品的潛在用途。然而，多肽必須抵抗胃腸道蛋白酶的降解，并通過(guò)腸道屏障完整的吸收，才能在人體系統(tǒng)發(fā)揮生理作用[14]。作為食品添加劑，還應(yīng)考慮溫度和加工條件對(duì)多肽的穩(wěn)定性的影響。因此，本文研究了pH值、高溫、凍融、金屬離子以及模擬胃腸消化對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響，為其后期開(kāi)發(fā)為食品添加劑、功能性食品等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

苦蕎抗氧化肽AFYRW（純度≥98%）：上海淘普生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海思域化工科技有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/mg）：大連美侖生物科技有限公司；胰蛋白酶（250 U/mg）、Triton X-100：北京索萊寶科技有限公司；羥自由基測(cè)試試劑盒：南京建成生物工程研究所；無(wú)水乙醇、鹽酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：重慶茂業(yè)化工試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PE28 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Epoch2全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Tek公司；DF-II數(shù)顯集熱式磁力攪拌器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；CP214電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；SHHW21恒溫水浴箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1·OH清除率的計(jì)算

采用南京建成生物公司的羥自由基測(cè)試試劑盒測(cè)定樣品的·OH清除率，嚴(yán)格按照羥自由基測(cè)試試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行試驗(yàn)，并按照下面的公式計(jì)算羥自由基清除率。

羥自由基清除率/%=（Aa-Ab）/Aa×100

式中：Aa為空白吸光度；Ab為樣品吸光度。

1.3.2 DPPH自由基清除率的計(jì)算

根據(jù)LIU等[15]描述的方法測(cè)定DPPH自由基清除率，并稍作修改。用95%乙醇溶液制備0.1 mmol/L的DPPH溶液。將100 μL樣品和100 μL DPPH溶液在96孔板中混合。將混合物在黑暗中靜置30 min。通過(guò)全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為517 nm的條件下測(cè)量吸光度。使用乙醇做空白。DPPH自由基清除率通過(guò)以下公式計(jì)算。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（Aa-Ab）/Ac]×100

式中：Aa為樣品加DPPH溶液的吸光度值；Ab為樣品加無(wú)水乙醇的吸光度值；Ac為無(wú)水乙醇加DPPH溶液的吸光度值。

1.3.3 pH值對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

配制濃度為1 mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，用1 mol/L氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整溶液pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室溫（25 ℃）振蕩反應(yīng) 2 h，結(jié)束后直接測(cè)定·OH清除率和DPPH自由基清除率。

1.3.4 溫度對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

配制濃度為1 mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，分別在 37、65、98 ℃水浴中保溫 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 h，測(cè)定·OH清除率和DPPH自由基清除率。

1.3.5 反復(fù)凍融對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

配制濃度為1 mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，將其放置-80 ℃冰箱反復(fù)凍融 0、1、2、4、6、8、10次，測(cè)定·OH清除率和DPPH自由基清除率。

1.3.6 金屬離子對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

配制濃度為2 mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，向其添加等體積的 K+、Mg2+、Na+、Ca2+金屬離子溶液，使每種金屬離子濃度分別為0、0.05、0.10、0.20 mol/L，室溫（25℃）放置2 h，測(cè)定·OH清除率和DPPH自由基清除率。

1.3.7 體外模擬胃腸道消化對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

根據(jù)ZHU等[16]的方法并稍加改動(dòng)，配制濃度為1 mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，向其加入4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的胃蛋白酶，37℃水浴2 h，反應(yīng)完成后，沸水浴10 min，6 000 r/min離心10 min，上清液為胃蛋白酶消化產(chǎn)物；取上清液用0.9 mol/L碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH 5.3，再用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0，向其加入4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的胰蛋白酶，沸水浴10 min，6 000 r/min離心10 min，得到的上清液為胃蛋白酶、胰蛋白酶消化樣品；取1mg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW溶液，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 8.0，向其加入4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的胰蛋白酶，沸水浴10 min，6 000 r/min離心10 min，得到的上清液為胰蛋白酶消化樣品。將上述樣品的pH值調(diào)至7.0，測(cè)定上清液的·OH清除率和DPPH自由基清除率。

1.3.8 苦蕎抗氧化肽AFYRW溶血活性的測(cè)定

根據(jù)SOUZA等[17]的方法測(cè)定苦蕎抗氧化肽AFYRW的溶血活性，取新鮮分離的人紅細(xì)胞，用pH 7.4，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，然后在150 g，4℃離心10 min，重復(fù)3次，得到洗滌紅細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液配制濃度為4%（體積分?jǐn)?shù)）的紅細(xì)胞懸液；將100 μL 濃度為 0、10、50、100、200、300、400、500 μg/mL的苦蕎抗氧化肽AFYRW加入到含有100 μL 4%的紅細(xì)胞懸液的96孔板中，37℃共同孵育1 h，225 g，4℃離心10 min，取100 μL上清液，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450nm的吸光度值。0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液為陰性對(duì)照，0.1%的Triton X-100為陽(yáng)性對(duì)照。重復(fù)3次。并按照下面的公式計(jì)算溶血率。

紅細(xì)胞溶血率/%=（Aa-Ab）/（Ac-Ab）×100

式中：Aa為樣品吸光度值；Ab為0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液的吸光度值；Ac為0.1%的Triton X-100的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

pH值對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性的影響如圖1所示。

圖1 pH值對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of pH on antioxidant activity of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

由圖1可以看出，pH值為3時(shí)，苦蕎抗氧化肽AFYRW對(duì)·OH清除率和DPPH自由基清除率最強(qiáng)，分別為63.81%和57.80%，隨著pH值的上升，苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性顯著下降（P<0.05），在pH值為11時(shí)，抗氧化活性最低，但也保持著較高的水平，這時(shí)·OH清除率和DPPH自由基清除率分別為47.52%和44.24%。與pH值為3時(shí)比較，pH值為11時(shí)對(duì)·OH清除率和DPPH自由基清除率分別下降了16.29%（P<0.05）和 13.56%（P<0.05）。這可能是隨著 pH值增大，多肽易發(fā)生消旋作用，造成一些L型氨基酸變成D型氨基酸，進(jìn)而引起極性和空間位阻等結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化，降低生物活性[18]。因此，在加工利用過(guò)程中，應(yīng)避免在強(qiáng)堿性環(huán)境下使用苦蕎抗氧化肽AFYRW。

2.2 溫度對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

溫度對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性的影響如圖2、圖3所示。

圖2 溫度對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW的·OH清除率的影響Fig.2 Effect of temperature on·OH scavenging rate of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

由圖 2、圖 3可以看出，在 37、65、98℃時(shí)，苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性保持在比較穩(wěn)定的狀態(tài)（P>0.05）。這可能是因?yàn)榉肿恿枯^小的肽不具備熱敏感的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)[19]，苦蕎抗氧化肽AFYRW是只有5個(gè)氨基酸的小肽，過(guò)高溫度處理，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能并不會(huì)改變苦蕎抗氧化肽AFYRW的結(jié)構(gòu)，也沒(méi)有影響其抗氧化活性，這與WONG等[20]研究黃貂魚(yú)水解液抗氧化肽的結(jié)果相一致。這表明苦蕎抗氧化肽AFYRW在生產(chǎn)加工中是耐高溫的。

圖3 溫度對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW的DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of temperature on DPPH radical scavenging activity of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

2.3 反復(fù)凍融對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

反復(fù)凍融對(duì)苦蕎活性肽AFYRW的抗氧化活性影響如圖4所示。

圖4 凍融對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of freezing and thawing on antioxidant activity of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

從圖4中可以看出，即使反復(fù)凍融10次，苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性還保持在比較穩(wěn)定的狀態(tài)（P>0.05），說(shuō)明反復(fù)凍融并不會(huì)影響苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性，這也表明苦蕎抗氧化肽AFYRW在生產(chǎn)加工過(guò)程中是可以?xún)鋈凇⒛偷蜏氐摹?/p>

2.4 金屬離子對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

金屬離子對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性如圖5、圖6所示。

圖5 金屬離子對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW的·OH清除率的影響Fig.5 Effect of metal ions on·OH clearance of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

圖6 金屬離子對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW的DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of metal ions on DPPH radical scavenging activity of antioxidant peptide AFYRW from tartary buckwheat

由圖 5 和圖 6 可以看出，Mg2+、Na+在 0～0.20 mol/L時(shí)，對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性影響不顯著（P>0.05）；K+可以提高苦蕎抗氧化肽AFYRW的·OH清除率，濃度為0.20 mol/L時(shí)，·OH清除率相比未添加K+時(shí)可以提高9.67%（P<0.05），K+對(duì)苦蕎活性肽AFYRW的DPPH自由基清除率的影響不顯著（P>0.05）；Ca2+在 0～0.10mol/L 時(shí)，對(duì)苦蕎抗氧化肽 AFYRW的DPPH自由基清除率的影響不顯著（P>0.05），Ca2+在0.20 mol/L時(shí)，抑制了苦蕎抗氧化肽AFYRW的DPPH自由基清除率，比未添加Ca2+低4.4%左右（P<0.05）；Ca2+對(duì)苦蕎抗氧化肽的·OH清除率沒(méi)有顯著影響（P>0.05）。結(jié)果表明，苦蕎抗氧化肽AFYRW在加工儲(chǔ)存過(guò)程中，可以與含有Mg2+、Na+、K+的原輔料一起加工，但應(yīng)該盡量避免與Ca2+接觸。

2.5 體外模擬胃腸道消化對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW抗氧化活性的影響

模擬胃腸道消化對(duì)苦蕎抗氧化肽的抗氧化活性影響如圖7所示。

圖7 模擬胃腸消化對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性的影響Fig.7 Effect of simulated gastrointestinal digestion on antioxidant activity of antioxidant peptide AFYRW in tartary buckwheat

經(jīng)過(guò)2 h模擬胃液消化后，與消化前相比，·OH清除率和DPPH自由基清除率分別下降了12.03%（P<0.05）、16.86%（P<0.05）；經(jīng)過(guò) 2 h 模擬腸液消化后，與消化前相比，·OH清除率和DPPH自由基清除率分別下降了 9.02%（P<0.05）、11.63%（P<0.05）；先經(jīng)過(guò)胃液消化2 h后，再經(jīng)腸液消化2 h，與消化前相比，·OH清除率和DPPH自由基清除率分別下降了14.71%（P<0.05）、19.96%（P<0.05）。通常，胃蛋白酶會(huì)水解食源性蛋白質(zhì)生成分子量超過(guò)10 kDa的肽混合物，后者會(huì)被胰蛋白酶進(jìn)一步水解為小肽。CHITTCHANG等[21]發(fā)現(xiàn)分子量大于3 kDa的肽在胃消化過(guò)程中比分子量小于3 kDa的肽更容易被降解。然而，CING MARS等[22]發(fā)現(xiàn)低分子量的活性肽優(yōu)先比高分子量肽水解。研究結(jié)果表明，除了分子量外，肽的其它特性，如酸堿性、疏水性和碳氮末端氨基酸組成也對(duì)肽的胃腸消化穩(wěn)定性有影響[23]。因此，苦蕎抗氧化肽AFYRW的胃腸消化穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步研究和分析。

2.6 苦蕎抗氧化肽AFYRW溶血活性

苦蕎抗氧化肽AFYRW對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用如圖8所示。

由圖8可以看出，苦蕎抗氧化肽AFYRW的濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí)，其吸光度與0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液吸光度無(wú)差異（P>0.05），溶血率為0，說(shuō)明苦蕎抗氧化肽AFYRW對(duì)紅細(xì)胞無(wú)溶血作用，這一結(jié)果也與YANG等[24]研究的抗菌肽AMP-17對(duì)紅細(xì)胞的作用相一致。因此，苦蕎抗氧化肽AFYRW對(duì)人的紅細(xì)胞是安全的。

3 結(jié)論

以苦蕎抗氧化肽AFYRW為對(duì)象，研究了不同因素和體外模擬胃腸消化對(duì)其抗氧化活性的影響，以及抗氧化肽AFYRW對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用。結(jié)果表明：苦蕎抗氧化肽AFYRW具有較好的熱穩(wěn)定性；反復(fù)凍融、Na+、Mg2+對(duì)抗氧化肽AFYRW抗氧化活性無(wú)顯著變化；Ca2+會(huì)降低抗氧化肽AFYRW的DPPH自由基清除率，K+會(huì)提高抗氧化肽AFYRW的·OH清除率；隨著pH值升高，抗氧化肽AFYRW的·OH和DPPH自由基清除率下降，不利于苦蕎抗氧化肽AFYRW活性的保持。不同因素對(duì)苦蕎抗氧化肽AFYRW活性影響不同，因此，在苦蕎抗氧化肽AFYRW的生產(chǎn)加工中，采用合理優(yōu)化的條件有利于避免其活性的下降?？嗍w抗氧化肽AFYRW對(duì)紅細(xì)胞無(wú)溶血作用，說(shuō)明苦蕎抗氧化肽AFYRW無(wú)毒性作用。但模擬胃腸消化后發(fā)現(xiàn)苦蕎抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性下降，說(shuō)明胃腸消化道酶可能會(huì)降解肽或改變其結(jié)構(gòu)，因此在整個(gè)胃腸消化過(guò)程中可能需要使用一些策略來(lái)提高其生物利用度，在這方面，還需要進(jìn)一步研究，以評(píng)價(jià)肽作為功能性食品的生物活性和生物利用度，以及可能對(duì)人體產(chǎn)生的生理影響。