桔小實蠅雌成蟲對寄主揮發(fā)物β-石竹烯的行為反應(yīng)

高 揚，李慧靜，陸永躍，程代鳳*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣州 510642)

桔小實蠅Bactroceradorsalis是一種可對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害的害蟲，其經(jīng)濟(jì)寄主超過 150多種水果和蔬菜(Chenetal., 2008; Schutzeetal., 2017)。目前，桔小實蠅已在熱帶和亞熱帶的大部分地區(qū)廣泛分布，并且被許多國家和地區(qū)列為檢疫性有害生物。已有研究表明，植物源揮發(fā)物可有效引誘或驅(qū)避桔小實蠅，某些揮發(fā)物已被用于桔小實蠅監(jiān)測。例如，植物源的甲基丁香酚可強(qiáng)烈地引誘桔小實蠅的雄蟲(Tanetal., 2014)，接觸過甲基丁香酚的雄蟲會獲得交配競爭優(yōu)勢(Shelly 2000; Vargasetal., 2010; Tan and Nishida 2012; Tanetal., 2014)。另外，甲基丁香酚還可以驅(qū)避桔小實蠅的寄生蜂(Guetal., 2018)。香茅草中的香茅醛可顯著驅(qū)避桔小實蠅產(chǎn)卵(Yietal., 2014)，芒果中的γ-辛內(nèi)酯、惕各酸乙酯、苯并噻唑和蘑菇醇則可影響桔小實蠅對產(chǎn)卵場所的選擇(Kamala Jayanthietal., 2014; Pagadala Damodarametal., 2014; Pagadala Damodarametal., 2015)。

β-石竹烯(beta-caryophyllene)是一種許多植物都能合成的揮發(fā)物，研究發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)對昆蟲具有雙重效果。例如β-石竹烯對赤擬谷盜Triboliumcastaneum和嗜卷書虱Liposcelisbostrychophila(Wangetal., 2019)具有非常顯著的驅(qū)避作用，對中華蜜蜂Apiscerana(Annammaetal., 2018)、煙青蟲Helicoverpaassulta(Sunetal., 2012)和斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fangetal., 2018)則有顯著的引誘作用。中華蜜蜂在覓食過程中會顯著偏好于可產(chǎn)生β-石竹烯的Jacquemontiapentanthos(Annammaetal., 2018)。另外，研究還發(fā)現(xiàn)β-石竹烯對庫蚊Culextritaeniorhynchus、按蚊Anophelessubpictus和伊蚊Aedesalbopictus有非常高的毒性(Govindarajanetal., 2016)。植物中β-石竹烯還可被植食性昆蟲取食誘導(dǎo)并選擇性地引誘植食性昆蟲的寄生天敵(Kollneretal., 2008)。

已有相關(guān)文獻(xiàn)報道β-石竹烯對實蠅類昆蟲行為的影響。例如，在缺少β-石竹烯的情況下白漿果對繞實蠅Rhagoletiszephyria的吸引力會顯著下降(Chaetal., 2017)。β-石竹烯和α-蛇麻烯的混合物會強(qiáng)烈的引誘番石榴實蠅(Jaleeletal., 2019)。芒果中的β-石竹烯則可以引起地中海實蠅顯著的觸角電位反應(yīng)，而且對雌蟲的反應(yīng)要顯著強(qiáng)于雄蟲(Cosséetal., 1995)。然而，關(guān)于β-石竹烯對桔小實蠅產(chǎn)卵行為的影響尚未見報道。本文對桔小實蠅3種寄主水果揮發(fā)物進(jìn)行了鑒定，測試了共有物質(zhì)β-石竹烯對桔小實蠅的引誘作用，為開發(fā)該蟲植物源誘集提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1供試?yán)ハx

桔小實蠅于2016年5-6月采集于廣東省廣州市楊桃公園，在室內(nèi)溫度25±1℃、相對濕度70%～80%、光周期16 L ∶8 D的養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)。實驗室桔小實蠅使用人工飼料飼養(yǎng)(Chengetal., 2017)。

1.1.2供試材料及藥品配制

β-石竹烯精油(95%，東京化成工業(yè)株式會社，CAS:87-44-5)500 mL密度0.9 g/cm3。分別用無水乙醇稀釋至0.9、9、90和900 μg/mL的溶液，冰箱低溫(-18℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1產(chǎn)卵選擇實驗

取30頭處于產(chǎn)卵期的桔小實蠅雌蟲置于一個長寬高均為40 cm的籠子中，在籠子中放置特制的產(chǎn)卵誘集盒(一個高和直徑均為3 cm的圓柱形食料盒，盒蓋上鉆有3排12個小孔供實蠅產(chǎn)卵)對實蠅卵進(jìn)行收集。分別在市場購買番石榴、橙子和芒果，將3種水果分別用榨汁機(jī)勻漿成果泥。分別在產(chǎn)卵誘集盒中加入2 g果泥放入實蠅籠子中進(jìn)行產(chǎn)卵誘集，3 h后取出誘集盒并計算誘集盒中實蠅卵的數(shù)量。

在測試β-石竹烯對桔小實蠅產(chǎn)卵的影響時，取 4個產(chǎn)卵誘集盒放置于籠子中，在誘集盒中分別加入2 g番石榴果泥，其中3個誘集盒中的果泥分別混入9、90和900 μg β-石竹烯(體積為1 mL)，另一個加入同樣體積的無水乙醇作為空白對照。對桔小實蠅產(chǎn)卵誘集3 h后取出誘集盒并計算每個誘集盒中實蠅卵的數(shù)量。

1.2.2果實中揮發(fā)物的鑒定

用氣相質(zhì)譜(GC-MS)(安捷倫科技有限公司，GC:7890B, MS:5977B)分析方法對番石榴、橙子和芒果中揮發(fā)物進(jìn)行鑒定。具體操作方法：將2 g果泥添加到一個20 mL的棕色瓶中，然后用100-μm聚二甲基硅氧烷固相微萃取萃取頭(PMDS)對果泥中揮發(fā)物進(jìn)行萃取，萃取時間為40 min，萃取溫度為水浴37℃。萃取結(jié)束后將萃取頭插入氣相質(zhì)譜儀的進(jìn)樣口，在250℃下熱解析3 min后進(jìn)行氣相質(zhì)譜分析。氣相質(zhì)譜條件，柱子：HP-5 MS (30 m, 0.25 mm內(nèi)徑, 0.25 μm厚度)；載氣：110.9 kPa氦氣；柱箱溫度50℃保持2 min，以5℃/min升至140℃，其后以10℃/min升至250℃，保持10 min。β-石竹烯根據(jù)NIST普庫中的特征離子片段進(jìn)行鑒定，同時購買β-石竹烯的標(biāo)準(zhǔn)品對鑒定到的β-石竹烯進(jìn)行再次確認(rèn)。為了測定果泥中β-石竹烯的絕對含量，取β-石竹烯的標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇稀釋至250，25，2.5，0.25，0.025，0.0025 μg/μL 6個濃度梯度，取2 mL不同濃度梯度的β-石竹烯用PMDS萃取頭在水浴37℃萃取40 min后在氣相質(zhì)譜儀中進(jìn)樣檢測，對β-石竹烯的峰面積和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品中β-石竹烯的峰面積可用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算β-石竹烯的濃度。

1.2.3桔小實蠅雌蟲觸角電位(GC-EAD)測試

用GC-EAD方法測試桔小實蠅雌蟲觸角對β-石竹烯的反應(yīng)。氣相色譜(7890B)條件，柱子：HP-5 (30 m, 0.25 mm內(nèi)徑, 0.25 μm厚度)；載氣：110.9 kPa氦氣；柱箱溫度：40℃保留2 min，10℃/min升至250℃，保留5 min。將桔小實蠅雌蟲頭部沿中間切下，將其中一個觸角末端切開，然后連接到觸角電位儀的兩個玻璃電極上，其中參考電極連接頭部，記錄電極連接觸角端部。在氣相色譜儀進(jìn)樣口進(jìn)1 μL β-石竹烯 (10 μg/mL，測試桔小實蠅的觸角電位反應(yīng)，實驗中測試3對以上雌蟲觸角對β-石竹烯的反應(yīng)。

1.2.4桔小實蠅對β-石竹烯的嗅覺反應(yīng)測試

應(yīng)用一個Y型嗅覺儀測試單頭桔小實蠅雌蟲對β-石竹烯的行為反應(yīng)。在實驗中，分別測試雌蟲對900、90、9和0.9 μg/mL β-石竹烯(溶于無水乙醇當(dāng)中)的反應(yīng)。實驗過程中，在Y型嗅覺儀的一個味源瓶中加入1 mL β-石竹烯溶液，另一個味源瓶中加入1 mL無水乙醇作為對照。實驗過程中保持氣流流速為1.3 L/min。雌蟲放入Y型管中觀察5 min，當(dāng)雌蟲進(jìn)入Y型管一側(cè)超過3 cm且停留時間超過1 min則記為1個有效選擇。實驗過程中只統(tǒng)計有效選擇的蟲數(shù)。在進(jìn)行10個有效重復(fù)后，將裝置拆解開用酒精進(jìn)行沖洗并烘干，然后再進(jìn)行重復(fù)實驗，每組實驗記錄60個有效重復(fù)。

應(yīng)用一個四臂嗅覺儀(中央昆蟲活動室：55 cm長，3 cm深)測試桔小實蠅雌蟲群體對β-石竹烯的反應(yīng)。在四臂嗅覺儀四個臂的味源瓶中分別加入1 mL無水乙醇，0.9、9和90 μg/mL β-石竹烯溶液，在4個臂中持續(xù)通入1.3 L/min的氣流，各項條件準(zhǔn)備好后在昆蟲活動室中放入100頭處于產(chǎn)卵期的桔小實蠅雌蟲。實驗中將整個裝置用不透光的黑布罩住，防止光源對實蠅的選擇造成影響。實驗4次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用卡方檢驗(P<0.05)分析Y型嗅覺儀中處理與對照間差異，單因素方差分析比較不同果中產(chǎn)卵量及石竹烯含量的差異，Kendall非參數(shù)檢驗比較分析四臂嗅覺儀中雌蟲對β-石竹烯各濃度的選擇及產(chǎn)卵差異，以上分析均使用SPSS 17。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試水果果泥對桔小實蠅產(chǎn)卵的引誘作用

3種水果的果泥均可引誘處于產(chǎn)卵期的桔小實蠅雌蟲產(chǎn)卵，3 h內(nèi)每種果泥均能誘集到超過200粒卵，且3種水果誘集到卵的數(shù)量無顯著差異(F2, 26=3.189，P=0.0577; 圖1)。這表明所選水果果泥中均可能存在引誘桔小實蠅雌蟲產(chǎn)卵的揮發(fā)物。

2.2 果泥中β-石竹烯含量及雌蟲對其觸角電位反應(yīng)

應(yīng)用GC-MS分析中發(fā)現(xiàn)，番石榴、橙子和芒果中均含有β-石竹烯(圖2)，而且3種水果中β-石竹烯的含量沒有顯著差異(F2, 15=3.049，P=0.0774; 圖3)。另外，10 μg/mL的β-石竹烯能夠引起所有測試雌蟲的觸角電位反應(yīng)(圖4)。

圖1 不同水果上桔小實蠅的產(chǎn)卵量Fig.1 Egg of the fruit fly on the different fruits注：圖中黑點數(shù)表示重復(fù)次數(shù)，相同字母表示數(shù)據(jù)示鄧肯氏多重比較在0.05水平上差異不顯著。Note: Number of black dots means the biological replicates. Same letters indicated figure was not different by Duncan’s test at 0.05 level.

圖2 果實中β-石竹烯的GC-MS鑒定Fig.2 Identification of β-caryophyllene by GC-MS

圖3 3種水果中β-石竹烯的含量Fig.3 β-caryophyllene content in fruits注：A，β-石竹烯定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B，β-石竹烯在果實中的含量。圖中黑點數(shù)表示重復(fù)次數(shù)，相同字母表示數(shù)據(jù)示鄧肯氏多重比較在0.05水平上差異不顯著。Note: A, Standard curve of β-caryophyllene quantification; B, Content of β-caryophyllene in different fruits. Number of black dots means the biological replicates. Same letters indicated figure was not different by Duncan’s test at 0.05 level.

圖4 桔小實蠅雌蟲對β-石竹烯的觸角電位反應(yīng)Fig.4 Electroantennogram response of β-caryophyllene to female antenae

2.3 β-石竹烯對桔小實蠅雌蟲的引誘作用

Y型嗅覺儀實驗結(jié)果表明，9 μg/mL的β-石竹烯可顯著引誘桔小實蠅，而0.9、90和900 μg/mL的β-石竹烯對桔小實蠅雌蟲均無顯著誘集作用(圖5)；四臂嗅覺儀實驗也表明桔小實蠅雌蟲會顯著趨向于9 μg/mL的β-石竹烯，當(dāng)β-石竹烯濃度高于9 μg/mL時，β-石竹烯濃度越高對實蠅的誘集效果就越差(Kendall W=0.728, df=3,P=0.012, 圖6)。另外，產(chǎn)卵誘集實驗則進(jìn)一步表明果泥中β-石竹烯含量在10.09 μg/g(自然情況下果中β-石竹烯的濃度)左右時可顯著誘集桔小實蠅產(chǎn)卵，且當(dāng)果中β-石竹烯濃度高于自然情況下的濃度時，β-石竹烯濃度越高誘集實蠅產(chǎn)卵的數(shù)量就越少(Kendall W=0.396, df=3,P=0.008, 圖7)。

圖5 雌蟲在Y型嗅覺儀中對不同濃度β-石竹烯的選擇Fig.5 Selection of females to different concentration of β-caryophyllene注：NS，差異不顯著；***, P < 0.01。Note: NS, no difference；***, P < 0.01.

圖6 雌蟲在四臂嗅覺儀中對不同濃度β-石竹烯的選擇Fig.6 Selection of females to different concentration of β-caryophyllene注：圖中黑點數(shù)表示重復(fù)次數(shù)，不同字母表示數(shù)據(jù)經(jīng)Kendall非參數(shù)檢驗在0.05水平上差異顯著。Note: Number of black dots means the biological replicates. Different letters indicated figure significantly different by Kendall nonparametric test at 0.05 level.

圖7 番石榴中不同含量β-石竹烯對產(chǎn)卵量的影響Fig.7 Effect of β-caryophyllene concentration in guava on oviposition注：圖中黑點數(shù)表示重復(fù)次數(shù)，番石榴果β-石竹烯原始濃度為10.7 μg/g，圖中不同字母表示數(shù)據(jù)經(jīng)Kendall非參數(shù)檢驗在0.05水平上差異顯著。Note: Number of black dots means the biological replicates. β-caryophyllene concentration in guava is 10.7 μg/g. Different letters indicated figure significantly different by Kendall nonparametric test at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)番石榴、橙子和芒果3種水果的果泥對桔小實蠅雌蟲產(chǎn)卵均具有較好的引誘作用，通過對3種水果果泥中的揮發(fā)物進(jìn)行鑒定和功能研究發(fā)現(xiàn)β-石竹烯是3種果泥中共有的揮發(fā)物；β-石竹烯對桔小實蠅雌蟲產(chǎn)卵具有顯著的引誘作用，但這種引誘作用取決于β-石竹烯的濃度，當(dāng)果泥中β-石竹烯濃度為9 μg/g時對雌蟲產(chǎn)卵的誘集效果最好，而當(dāng)β-石竹烯濃度高于9 μg/g時誘集效果則會下降，甚至?xí)?qū)避實蠅產(chǎn)卵。本研究首次報道了β-石竹烯濃度與桔小實蠅產(chǎn)卵誘集效果之間的關(guān)系，對進(jìn)一步認(rèn)識桔小實蠅雌蟲對寄主進(jìn)行產(chǎn)卵選擇的行為具有重要意義。

研究結(jié)果表明，低濃度的β-石竹烯對桔小實蠅產(chǎn)卵具有引誘效果，而高濃度下引誘效果會減弱甚至產(chǎn)生驅(qū)避效果。這說明桔小實蠅對β-石竹烯的嗅覺反應(yīng)受不同劑量β-石竹烯的影響。這種現(xiàn)象在其他雙翅目昆蟲中同樣存在。劉燕等(2018)發(fā)現(xiàn)β-石竹烯在低劑量下，對斑翅果蠅Drosophilasuzukii雌成蟲產(chǎn)卵行為表現(xiàn)為引誘效果，而高劑量下對其表現(xiàn)為產(chǎn)卵驅(qū)避效果，且隨劑量升高，單雌累積產(chǎn)卵量呈下降趨勢。另外，在模式生物果蠅中也存在這種現(xiàn)象。例如，低濃度的醋酸會顯著引誘果蠅，而高濃度的醋酸對果蠅的吸引作用則會顯著下降(Semmelhack & Wang, 2009)；果蠅對一些鹽的趨性也存在類似的劑量效應(yīng)，低鹽食物可顯著引誘，而高鹽食物則會驅(qū)避果蠅(Zhangetal., 2013)。通過對相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，果蠅對不同濃度的醋酸表現(xiàn)出的趨向或驅(qū)避反應(yīng)是通過激活不同的嗅神經(jīng)小球來介導(dǎo)的，低濃度的醋酸可激活DM1和VA2兩個嗅神經(jīng)小球進(jìn)而引起果蠅的趨向反應(yīng)，而高濃度的醋酸則會激活另外的嗅神經(jīng)小球從而引起驅(qū)避反應(yīng)(Semmelhack & Wang, 2009)。果蠅對不同濃度鹽分的識別是通過不同的味覺神經(jīng)元介導(dǎo)的，一種名為IR76b的促離子型谷氨酸受體是用于識別低濃度的鹽分的，而高濃度的鹽分則是通過另外的受體識別的(Zhangetal., 2013)。桔小實蠅對不同濃度的β-石竹烯表現(xiàn)出的不同反應(yīng)是否也是由類似機(jī)制介導(dǎo)則還需進(jìn)一步證實。

近些年有許多研究人員對桔小實蠅的寄主選擇行為進(jìn)行了研究。金菊等(2015)發(fā)現(xiàn)不同品種的蓮霧果實對桔小實蠅的引誘效果存在顯著差異，同時他們也指出蓮霧中的β-石竹烯對雌蟲具有明顯的引誘作用；施偉等(2009)選取馬切蘇芒和三年芒的完全成熟和未成熟果實對桔小實蠅進(jìn)行趨性測試，結(jié)果表明桔小實蠅對2種完全成熟芒果的趨性更加明顯，同時β-石竹烯均可在測試芒果中鑒定出來；王澤槐等(2010)在網(wǎng)室中測試了番石榴完全成熟果和腐爛果對桔小實蠅性成熟雌蟲的引誘作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腐爛果對桔小實蠅的誘集作用要顯著高于完全成熟果，而β-石竹烯也可在2種番石榴中鑒定出來。然而，上述研究人員均未指出桔小實蠅寄主選擇的偏好是否與β-石竹烯濃度存在相關(guān)性。事實上我們進(jìn)一步分析他們的揮發(fā)物鑒定數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，上述研究中桔小實蠅嗜好寄主中β-石竹烯的含量均要低于桔小實蠅非嗜好的寄主。施偉等(2009)發(fā)現(xiàn)完全成熟芒果對桔小實蠅的引誘作用要大于未成熟芒果，而β-石竹烯在未成熟果的含量要遠(yuǎn)高于成熟果[三年綠硬芒(含量：1.67)VS三年黃軟芒(含量：0.93)；馬切蘇綠硬芒(含量：3.31)VS馬切蘇黃軟芒(含量：0.50)]；另外，王澤槐等(2010)發(fā)現(xiàn)β-石竹烯在番石榴完全成熟果中的含量也要遠(yuǎn)高于腐爛果[完全成熟果(含量：12.21)VS腐爛果(含量：1.44)]。結(jié)合我們的研究結(jié)果，我們認(rèn)為桔小實蠅對不同品種，成熟度和腐爛與否寄主的選擇偏好可能跟這些不同寄主中β-石竹烯濃度的不同具有相關(guān)性。

在害蟲防治的方法中有一種通過控制害蟲行為的推拉策略，即在作物田內(nèi)，利用行為調(diào)控物質(zhì)驅(qū)離害蟲；在作物田外或田邊，則利用引誘物質(zhì)吸引害蟲，并將害蟲集中消滅(Cooketal., 2007)。桔小實蠅對不同濃度β-石竹烯表現(xiàn)出的不同反應(yīng)則為田間桔小實蠅的防治提供了一種新的思路，可在實蠅寄主所在地放置一些高濃度β-石竹烯釋放裝置從而提高寄主周邊β-石竹烯的濃度，但在稍遠(yuǎn)離寄主的位置則可放置β-石竹烯濃度(例如，9 μg/mL)剛好合適的誘集裝置，從而形成一個對桔小實蠅的推拉系統(tǒng)來誘集桔小實蠅雌成蟲，但該策略是否可行還需要進(jìn)一步進(jìn)行田間實驗驗證并優(yōu)化。