葛根素聯(lián)合磷酸三鈣支架的制備及對激素性股骨頭壞死大鼠的修復(fù)作用研究

唐 華，萬銳杰，劉 偉，陳 倩

(1.四川現(xiàn)代醫(yī)院骨科，四川 成都 610000 2.重慶市中醫(yī)院康復(fù)科，重慶 400021 3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院骨科，重慶 401120 4.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶 400016)

激素性股骨頭壞死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH)是一種常見的骨科非創(chuàng)傷性股骨頭壞死疾病，是由于過量或長期不當(dāng)使用激素導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，干擾了正常的股骨頭血供過程，進(jìn)而致使股骨頭部分區(qū)段骨小梁與骨髓壞死，最終導(dǎo)致骨骼結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。SANFH在臨床上早期無癥狀且難以診斷，因此，大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)股骨頭塌陷，一旦出現(xiàn)股骨頭塌陷，SANFH病程就難以逆轉(zhuǎn)[1]。利用骨組織工程學(xué)技術(shù)構(gòu)建工程支架材料已成為治療骨缺損的主要手段。天然膠原蛋白由骨骼礦物質(zhì)組成，而磷酸三鈣具有優(yōu)良的機(jī)械強(qiáng)度和骨傳導(dǎo)性，經(jīng)常在研究中用作自體骨的替代物[2]。在不同的組織中制備生物材料作為生物支架，能夠?yàn)榻M織中特定的細(xì)胞提供生長空間與結(jié)構(gòu)支撐，并能夠引導(dǎo)組織再生和控制組織結(jié)構(gòu)。葛根素是從中藥葛根中提取的有效活性成分，已有研究表明，葛根素能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，對于治療股骨頭壞死大鼠也具有顯著效果[3]。鑒于磷酸三鈣和葛根素以上的特性，本研究通過構(gòu)建葛根素/磷酸三鈣支架材料，并將其植入激素性股骨頭壞死大鼠的壞死股骨處觀察其修復(fù)作用，以期為進(jìn)一步治療體內(nèi)股骨頭壞死奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：60只清潔級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為(200±20)g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將大鼠飼養(yǎng)于溫度恒定在24℃，濕度45%，12h/12h晝夜循環(huán)的飼養(yǎng)箱中，期間自由飲水與飲食。

1.2主要試劑與材料：骨細(xì)胞株MLO-Y4(上海中科院細(xì)胞庫)，葛根素(純度≥99%，中國藥品生物制品檢定所)，磷酸三鈣(上海貝奧路生物材料有限公司)，MTT、DMEM、胎牛血清(Hyclone公司)，二甲基亞砜、胰蛋白酶、大腸埃希桿菌內(nèi)毒素(Sigma公司)，甲基強(qiáng)的松龍(輝瑞公司)，堿性磷酸酶和骨鈣素檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，HE染色試劑和免疫組織化學(xué)染色試劑(上海碧云天生物研究所)，Runχ2抗體和VEGF抗體(Abcam公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)。

1.3方 法

1.3.1葛根素聯(lián)合磷酸三鈣支架的制備：參考吳濤等人[4]的方法進(jìn)行制備，稱取葛根素充分溶解于二甲亞砜中，將磷酸三鈣材料置于溶液中，室溫下在密閉容器內(nèi)20.265kPa吸附8h，將材料取出，放在真空干燥箱內(nèi)，在30℃將制備的材料進(jìn)行真空干燥24h，采用60Co消毒，密封保存。

1.3.2支架材料表面形貌觀測：將支架材料表面進(jìn)行噴金處理后，置于掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察復(fù)合材料斷面的表面形貌，孔隙及支架表面結(jié)晶情況。

1.3.3支架材料孔隙率和力學(xué)性能測定：根據(jù)文獻(xiàn)測量支架孔隙率[5]，將支架材料置于盛滿無水乙醇V1(cm3)的容器中，密封后靜置10min，待支架材料被無水乙醇完全浸透，此時(shí)容器無水乙醇和充滿無水乙醇的支架材料的總體積記為V2(cm3)，將充滿無水乙醇的支架材料從容器中取出，剩余的無水乙醇體積記為V3(cm3)。計(jì)算公式：孔隙率(%)=(V1-V3)/(V2-V3)×100%。把支架材料置于萬能材料試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行力學(xué)性能測試，橫桿垂直方向的加載速率設(shè)置為0.1mm/min，記錄支架材料破碎的最大負(fù)荷值，計(jì)算公式：壓強(qiáng)(P)=支架垂直受力(F)/支架受力面積(S)。

1.3.4葛根素/磷酸三鈣支架材料浸提液的制備：將葛根素/磷酸三鈣支架材料置于體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇中，浸泡24h，PBS緩沖液沖洗后，采用無菌紗布吸干水分，放入含有DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶中，配成不同濃度的液體，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中浸提72h，采用20μm微孔濾膜過濾，制備支架材料浸提液。

1.3.5細(xì)胞培養(yǎng)、處理與增殖檢測：將MLO-Y4骨細(xì)胞株以1×104個(gè)/孔的密度鋪于96孔板上，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同質(zhì)量濃度(1×10-7、1×10-6、1×10-5moL/L)的葛根素/磷酸三鈣支架材料浸提液，以磷酸三鈣材料浸提液作為對照，各組分別于培養(yǎng)后24、48、72h，加入20μL的MTT，37℃孵育4h，棄原培養(yǎng)液并加入150μL DMSO溶液，持續(xù)振蕩10min，使用酶標(biāo)儀在570/630nm處檢測吸光度(A)。

1.3.6掃描電鏡觀察：將葛根素/磷酸三鈣支架材料切成小塊，使用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡24h，DMEM培養(yǎng)液浸泡3d，將支架材料放入24孔板，調(diào)整MLO-Y4細(xì)胞懸液濃度為2×105個(gè)/mL，取20μL細(xì)胞懸液加入材料表面，然后置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。4h后補(bǔ)加1mL培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每24h更換一次培養(yǎng)液。7d后將樣本將支架材料進(jìn)行噴金處理后，采用SEM觀察材料表面細(xì)胞生長情況。

1.3.7大鼠分組、模型制備及處理：60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、復(fù)合支架組，每組20只。模型組和復(fù)合支架組大鼠參照文獻(xiàn)方法[6]造模，給予尾靜脈注射脂多糖(LPS)(2mg/kg)，每天1次，持續(xù)2d，最后一次注射LPS后，腹腔注射甲基強(qiáng)的松龍(20mg/kg)，每天1次，持續(xù)3d，空白對照組大鼠同時(shí)注射等量生理鹽水。2周后隨機(jī)取材6只大鼠進(jìn)行HE染色觀察組織病理學(xué)變化，判斷造模效果。造模成功后，復(fù)合支架組大鼠清理死骨，將葛根素/磷酸三鈣支架材料植入股骨頭孔隙壞死處，活動(dòng)股骨，將植入支架材料卡壓牢靠，縫合傷口。無菌敷料蓋住，臀肌注射青霉素和慶大霉素，每日換藥1次，持續(xù)3d。

1.3.8血清鈣、磷、骨代謝指標(biāo)檢測：大鼠處理后12周進(jìn)行空腹心臟采血，血液在4℃低速離心機(jī)中以4500r/min離心10min，取上清分離血清，經(jīng)全自動(dòng)生化儀檢測血清樣本中鈣、磷含量，酶聯(lián)免疫試劑盒檢測骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(BGP)含量。

1.3.9Micro-CT掃描儀檢測：12周后將大鼠處死，取兩側(cè)股骨，剔除股骨周圍軟組織，將左側(cè)股骨沿平臺長軸放置，采用Micro-CT掃描儀對左側(cè)股骨進(jìn)行掃描，使用CTAn圖像分析儀測量骨礦物質(zhì)密度(BMD)、小梁骨體積分?jǐn)?shù)(Tb.BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁數(shù)目(Tb.N)。

1.3.10HE染色：將各組大鼠的左側(cè)股骨頭組織在4%多聚甲醛中固定后，采用10% EDTA進(jìn)行脫鈣處理，每周更換一次脫鈣液，連續(xù)處理2個(gè)月，直至針頭可刺穿為止。梯度酒精脫水，進(jìn)行石蠟包埋，在股骨頭橫徑最大處切成厚度為4μm的切片，在二甲苯中脫蠟，梯度酒精復(fù)水，加蘇木精染色5min，伊紅染液中染色2min，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.11免疫組化染色：將制備的股骨頭組織切片脫蠟至水，滴加2%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液高溫下進(jìn)行抗原修復(fù)，使用3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加兔抗VEGF(1:200)與Runχ2(1:200)在4℃過夜，次日PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(1:1000)，室溫下孵育1h，PBS沖洗后，滴加DAB，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，在電鏡下觀察，組織中淡黃色、棕黃色顆粒即為陽性表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1葛根素/β-磷酸三鈣支架的表征：通過SEM觀察到，葛根素/磷酸三鈣支架材料具有良好的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部孔隙相互連通，形成蜂窩狀結(jié)構(gòu)，平均孔徑為200～300μm，見圖1。

2.2孔隙率和抗壓強(qiáng)度檢測結(jié)果：與磷酸三鈣比較，葛根素/β-磷酸三鈣支架材料的孔隙率較小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。磷酸三鈣抗壓強(qiáng)度值明顯低于葛根素聯(lián)合磷酸三鈣組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 支架材料抗壓縮測試結(jié)果比較

2.3葛根素/β-磷酸三鈣支架對骨細(xì)胞活性的影響：與磷酸三鈣組比較，不同濃度的葛根素/磷酸三鈣支架材料浸提液在24h、48h、72h的細(xì)胞活性均顯著提高(P<0.05)，呈現(xiàn)出劑量依賴性。且在48h、72h時(shí)，1×10-5moL/L葛根素/磷酸三鈣支架組活性顯著高于另外兩個(gè)濃度作用下的細(xì)胞活性(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度的復(fù)合材料浸提液干預(yù)不同時(shí)間對MLO-Y4細(xì)胞活性的影響

2.4葛根素/β-磷酸三鈣支架與細(xì)胞相容性：通過SEM觀察MLO-Y4細(xì)胞接種至支架材料表面后細(xì)胞生長情況，在磷酸三鈣材料表面MLO-Y4細(xì)胞平鋪，呈貼壁生長的狀態(tài)，由此說明磷酸三鈣材料細(xì)胞相容性較好；在不同濃度的葛根素/β-磷酸三鈣支架材料上，隨載藥劑量的增加，材料表面上貼壁生長的細(xì)胞數(shù)量增多，且在1×10-5moL/L葛根素/β-磷酸三鈣支架材料表面觀察到大量細(xì)胞聚集、疊層生長，見圖2。

圖2 掃描電鏡觀察葛根素/β-磷酸三鈣支架與細(xì)胞相容性

2.5各組大鼠股骨組織形態(tài)學(xué)觀察：HE染色結(jié)果表明，大鼠造模后股骨組織內(nèi)骨小梁出現(xiàn)稀疏、不連續(xù)現(xiàn)象，壞死骨細(xì)胞擴(kuò)散在骨小梁中，說明造模成功。治療后，空白對照組中骨細(xì)胞核染色均勻，骨小梁排列整齊，間隔小且軟骨表面光滑；在模型組中明顯觀察到骨組織出現(xiàn)空洞現(xiàn)象，骨小梁稀疏、結(jié)構(gòu)紊亂，且間距增大；復(fù)合支架組骨小梁密集且排列較整齊，股骨組織病變得到明顯改善，見圖3。

圖3 HE染色觀察各組大鼠股骨組織病理學(xué)變化(×200)

2.6各組大鼠股骨組織光學(xué)檢查和股骨骨密度測定：Micro-CT掃描觀察股骨組織結(jié)果顯示，與空白正常組比較，模型組大鼠股骨頭出現(xiàn)嚴(yán)重壞死現(xiàn)象，同時(shí)BMD顯著降低，Tb.BV/TV、Tb.Th和Tb.N均顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，復(fù)合支架組大鼠股骨頭壞死現(xiàn)象得到明顯改善，BMD顯著升高，Tb.BV/TV、Tb.Th和Tb.N均顯著增加(P<0.05)，見圖4與表3。

圖4 Micro-CT掃描儀檢測各組大鼠股骨變化

表3 各組大鼠股骨頭BMD Tb.BV/TV Tb.Th和Tb.N比較

2.7各組大鼠血清鈣、磷、BALP和StrACP水平比較：與空白對照組比較，模型組大鼠血清中血鈣、血磷水平顯著下降，BALP水平顯著升高，同時(shí)BGP水平顯著下降(P<0.05)；復(fù)合支架組大鼠血清中血鈣、血磷水平較模型組顯著上升，BALP水平顯著降低且BGP水平顯著升高(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠血清鈣磷BALP和BGP水平比較

2.8各組大鼠Runχ2、VEGF免疫組化檢測：免疫組化檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠股骨組織中Runχ2、VEGF陽性表達(dá)率均顯著低于空白對照組(P<0.05)；與模型組比較，復(fù)合支架組中Runχ2、VEGF陽性表達(dá)率顯著升高(P<0.05)，見圖5與表5。

圖5 免疫組化染色檢測各組大鼠股骨組織中Runχ2、VEGF表達(dá)(×200)

表5 各組大鼠Runχ2 VEGF 免疫組化表達(dá)比較

3 討 論

激素濫用是導(dǎo)致股骨頭壞死的主要因素之一。在激素作用下，內(nèi)皮細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙致使股骨頭血液循環(huán)受阻，導(dǎo)致了局部骨組織缺血和壞死[1]。對激素性股骨頭壞死實(shí)施的治療手段包括人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)和藥物療法，然而大部分藥物治療沒有表現(xiàn)出良好的臨床效果[7]。目前，骨組織工程廣泛用于修復(fù)骨缺損，組織工程的三要素包括種子細(xì)胞、生長分化因子和支架材料，已經(jīng)使用幾種方法均取得了進(jìn)展，例如設(shè)計(jì)天然/合成聚合物復(fù)合材料，生物聚合物/骨誘導(dǎo)性生物陶瓷復(fù)合材料等[3]。近年來，將生物材料和生長因子結(jié)合起來構(gòu)建支架材料以增強(qiáng)移植物的功能和骨組織愈合能力，已成為研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。

骨組織工程支架材料的發(fā)展直接取決于材料技術(shù)的變化，用于骨再生的支架應(yīng)具備良好的生物相容性，較高的機(jī)械強(qiáng)度以穩(wěn)定骨組織的形成，并促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化[3]。支架材料的孔隙度也是評價(jià)支架材料一個(gè)重要的參數(shù)?？紫堵蕦τ陴B(yǎng)分傳輸、血液供應(yīng)、細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)物排出都具有重要意義。多項(xiàng)研究表明，磷酸三鈣作為生物活性陶瓷，具有良好的吸收性、骨傳導(dǎo)性、細(xì)胞粘附性和機(jī)械性能，并且與宿主骨組織相容性好[8]。在本研究中，通過檢測發(fā)現(xiàn)葛根素/β-磷酸三鈣支架材料具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，抗壓強(qiáng)度較高，并且在作用于MLO-Y4細(xì)胞后，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長活性，說明具有良好的細(xì)胞相容性，特征與性能均符合骨組織工程支架材料的要求。本研究通過給予大鼠尾靜脈注射LPS和腹腔注射甲基強(qiáng)的松龍建立了大鼠股骨頭壞死模型，將葛根素/β-磷酸三鈣支架材料植入大鼠股骨頭壞死處進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，大鼠股骨組織病變得到明顯改善，骨小梁密集、排列整齊，且間隔均勻，股骨骨礦物質(zhì)密度增加，小梁骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度和骨小梁數(shù)目也均增加。說明在股骨頭壞死處植入葛根素/β-磷酸三鈣支架材料能夠起到較好的骨修復(fù)作用。

血清和骨骼中鈣和磷的濃度可以反映鈣和磷穩(wěn)態(tài)的變化，其含量在正常范圍內(nèi)對于正常的生理功能和骨骼礦化十分重要。此外，血清鈣磷水平與骨吸收和骨重建密切相關(guān)，兩者水平的高低受到多個(gè)因子的調(diào)控，包括骨堿性磷酸酶、骨鈣素、降鈣素等[9]。其中，骨堿性磷酸酶是一種水解酶，參與骨骼礦化和形成過程中鈣和磷的沉積過程，為機(jī)體提供無機(jī)磷以合成骨鹽結(jié)晶，可作為成骨細(xì)胞成熟的早期標(biāo)志之一[10]。骨鈣素由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，其水平升高有利于骨形成，可直接反應(yīng)骨代謝水平[11]。本研究結(jié)果顯示，在植入葛根素/β-磷酸三鈣支架材料的股骨頭壞死大鼠血清中，血鈣、血磷水平均上升，同時(shí)抑制了骨堿性磷酸酶水平異常增高和骨鈣素水平的下降。此外，通過本研究發(fā)現(xiàn)，激素性股骨頭壞死大鼠經(jīng)植入葛根素/β-磷酸三鈣支架材料后，股骨頭組織內(nèi)Runχ2和VEGF的表達(dá)均明顯增加。Runχ2是一種骨特異性基質(zhì)蛋白，可增強(qiáng)成骨細(xì)胞相關(guān)基因的的轉(zhuǎn)錄水平，與骨形成密切相關(guān)。而VEGF在骨形成和骨修復(fù)過程中同樣發(fā)揮至關(guān)重要的作用，能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，加快細(xì)胞增殖、分裂以促進(jìn)壞死骨組織區(qū)域內(nèi)的血管再生，從而修復(fù)壞死骨組織。

綜上，葛根素/β-磷酸三鈣支架材料可對激素性股骨頭壞死大鼠起到較好的修復(fù)作用，并具有骨誘導(dǎo)和骨生成特性，從而抑制股骨頭壞死的病理進(jìn)程。本研究為進(jìn)一步開展臨床試驗(yàn)的后續(xù)研究提供了參考依據(jù)，為臨床治療股骨頭壞死奠定了基礎(chǔ)。