德漢勞綿蟹(Lauridromia dehaani)線粒體基因組測(cè)定及短尾下目系統(tǒng)發(fā)生分析

邢雨輝,周 豪,鄒永梅,姚文佳,張晨嶺,印學(xué)晨,鄒修文,陳建琴

(1.南京師范大學(xué)中北學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212310)(2.江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院,江蘇 南京 210013)(3.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023)

短尾下目(Brachyura)是現(xiàn)存甲殼動(dòng)物中物種多樣性最高類群之一,廣泛分布在世界各個(gè)地區(qū)的淡水、海洋和陸地中,種類繁多,超過7 250種[1]. 短尾下目的演化歷程可看作是輻射演化的實(shí)例,在進(jìn)化的歷程中由于不同的生存環(huán)境而朝著不同的方向(淡水、海洋和潮間帶)發(fā)生適應(yīng)演化,最終形成如今具有極高多樣性的類群[2-3]. 正確地認(rèn)識(shí)物種的分類地位和構(gòu)建穩(wěn)健的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系對(duì)追溯短尾下目的起源和演化歷程具有重要的作用. 早期,Guinot對(duì)短尾下目進(jìn)行分類梳理時(shí),把蟹類兩性生殖孔的位置作為高級(jí)階元的分類依據(jù),將短尾下目(Brachyura)分為肢孔派(Podotremata)、異孔派(Heterotremata)和胸孔派(Thoracotremata)[4-5].在Guinot的分類系統(tǒng)中,肢孔派又被分為綿蟹亞派(Dromiacea)和古短尾亞派(Archaeobrachyura),前者由綿蟹總科(Dromioidea)和人面綿蟹總科(Homolodromioidea)組成,后者由人面蟹總科(Homoloidea)、蛙蟹總科(Raninoidea)和圓關(guān)公蟹總科(Cyclodorippoidea)組成[3-5](圖1a). 之后,異孔派和胸孔派被合稱為真短尾派(Eubrachyura)[6-7](圖1b). 但是一些分類學(xué)者沒有使用肢孔派說法,例如:Martin 和 Davis 將綿蟹亞派提升為派,與真短尾派共同組成短尾下目的兩大類群,同時(shí)將古短尾亞派中的人面蟹總科歸入綿蟹派,蛙蟹總科和圓關(guān)公蟹總科歸入真短尾派下新設(shè)立的蛙蟹亞派(Rainoida)[2](圖1c).

圖1 短尾下目高階元的分類系統(tǒng)Fig.1 Classification system of Brachyura

陳惠蓮和孫海寶則將綿蟹亞派和古短尾亞派均提升為派,以代替肢孔派,與真短尾派并稱短尾下目的三大類群. 該分類系統(tǒng)在《中國(guó)海洋生物名錄》中得到了沿用[8-9](圖1d). 近年來,隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,分子標(biāo)記逐漸成為短尾下目分類的重要證據(jù). 部分研究者則提出使用綿蟹派、蛙蟹派(Rainoida)和圓關(guān)公蟹派(Cyclodorippoida)、肢孔派[10-11]. 然而,綿蟹派的內(nèi)部組成依然存在爭(zhēng)議,一些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)人面蟹總科和綿蟹總科形成姐妹群的關(guān)系,支持人面蟹總科歸入綿蟹派[10,12](圖1e);另一些研究結(jié)果則顯示人面蟹與蛙蟹和圓關(guān)公蟹親緣關(guān)系更近,提出應(yīng)當(dāng)把人面蟹總科從綿蟹派移入新設(shè)立的人面蟹派(Homoloida)之中[13-15](圖1f). 然而,在構(gòu)建不同類群之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系時(shí),分類單元不完全或者分子標(biāo)記信息不足會(huì)導(dǎo)致構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹出現(xiàn)長(zhǎng)枝吸引的現(xiàn)象,難以準(zhǔn)確反映各類群之間自然的進(jìn)化關(guān)系[10,16-17].

與部分基因相比,動(dòng)物線粒體基因組可以在序列和基因排列順序兩個(gè)層面提供豐富、有效的進(jìn)化信息,已被廣泛運(yùn)用到各類后生動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)生和進(jìn)化研究中[18-21]. 線粒體基因組全序列數(shù)據(jù)已經(jīng)被許多學(xué)者們應(yīng)用于短尾下目的系統(tǒng)發(fā)生研究,為解決該類群內(nèi)部各階元的系統(tǒng)學(xué)爭(zhēng)議提供了必要的分子學(xué)依據(jù)[16,22-25]. 截止目前,已公布的短尾下目的線粒體基因組已超過75種,但科屬階元取樣存在不均衡現(xiàn)象,相較于真短尾派,已測(cè)定線粒體基因組的物種來自綿蟹總科的僅 1種,人面蟹總科3種,蛙蟹總科3種. 為了增加綿蟹總科不同分類單元的取樣,本研究首次選取了綿蟹總科(Dromioidea)綿蟹科(Dromiidae)的典型代表物種——德漢勞綿蟹(Lauridromiadehaani)作為研究對(duì)象,應(yīng)用高通量測(cè)序方法測(cè)定其線粒體基因組全序列,通過序列比對(duì)和比較研究,分析德漢勞綿蟹的線粒體基因組結(jié)構(gòu)和基因排列順序的進(jìn)化特征,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,明確德漢勞綿蟹的系統(tǒng)發(fā)生位置,解析短尾下目的各派及亞派組成及其之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 樣本采集和保存

德漢勞綿蟹標(biāo)本 2017年11 月采集于廣西北海,無水乙醇浸泡. 樣本鑒定參考《中國(guó)海洋蟹類》和《中國(guó)動(dòng)物志 短尾次目 海洋低等蟹類》[8,26].

1.2 DNA提取、擴(kuò)增及質(zhì)量檢測(cè)

取 30 mg 樣本組織,浸泡于生理鹽水,每 30 min 更換一次生理鹽水,脫醇處理. 使用細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(generay biotech)進(jìn)行DNA提取(詳細(xì)提取步驟參照說明書). 獲得的總DNA樣品,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性,使用微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及質(zhì)量. 將質(zhì)量達(dá)標(biāo)樣品送至諾禾致源公司,進(jìn)行總DNA測(cè)序.

1.3 序列組裝和基因注釋

以毛刺貝綿蟹線粒體基因組(GenBank檢索號(hào):KT182070)的13條蛋白編碼基因PCGs和2條rRNA基因作為參考序列,使用Geneious 9.1.4 對(duì)Illumina 測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行序列組裝,得到每個(gè)基因相應(yīng)的重疊序列群. 將相應(yīng)基因的重疊序列群通過重頭組裝的方式進(jìn)行再次組裝,獲取線粒體基因組全序列. 獲得的全序列與毛刺貝綿蟹進(jìn)行BLAST比對(duì),進(jìn)行初步的基因注釋,使用在線MITOS2對(duì)組裝序列進(jìn)行再次識(shí)別確認(rèn)[27].

1.4 線粒體基因組組成與結(jié)構(gòu)特征分析

利用MITOS2在線網(wǎng)址來推測(cè)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)[27]. 使用MEGAX 軟件對(duì)獲得的蛋白編碼基因的核苷酸序列進(jìn)行堿基組成分析. 為了進(jìn)一步分析綿蟹的線粒體基因組蛋白編碼基因的選擇壓力,利用KaKs_Calculator 2.0對(duì)德漢勞綿蟹和毛刺貝綿蟹的13條蛋白編碼基因的非同義替換率(Ka)、同義替換率(Ks)及兩者的比值(Ka/Ks)進(jìn)行計(jì)算,計(jì)算方法使用YN模型[28].

1.5 系統(tǒng)發(fā)生分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載24種歪尾類、75種短尾類和28種十足目其他分類單元,共127個(gè)物種的線粒體基因組13條蛋白編碼基因和2條 rRNA 基因序列,結(jié)合德漢勞綿蟹的線粒體基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析. 將13條蛋白編碼基因的氨基酸序列和2條 rRNA 序列分別使用MAFFT 7.215 進(jìn)行比對(duì)[29],使用 GblockV. 0.91b對(duì)序列的保守性位點(diǎn)進(jìn)行選擇[30]. 根據(jù)比對(duì)、修改后的氨基酸序列,將蛋白編碼基因的核苷酸序列和 rRNA 序列修改后串聯(lián)成總的數(shù)據(jù)集. 按照不同的基因和密碼子位將數(shù)據(jù)集劃分成 41 個(gè)分區(qū)子集,然后使用 PartitionFinder 2確定數(shù)據(jù)集的最優(yōu)分區(qū)方案和每個(gè)分區(qū)的最佳核苷酸替換模型,并以此結(jié)果修改數(shù)據(jù)集[31]. 使用IQtree構(gòu)建最大似然樹,ultrafast bootstrap(BS)設(shè)置為1000[32-33]. 使用 MrBayes 3.2.6進(jìn)行貝葉斯分析,蒙特卡洛馬爾科夫鏈(markov chain monte carlo,MCMC)設(shè)置運(yùn)行1 000萬代,每1 000代取樣一次,其中前 25% 的取樣舍棄掉(burn-in)后,余下的取樣將被用于匯總出貝葉斯后驗(yàn)概率[34].

2 結(jié)果與討論

2.1 德漢勞綿蟹線粒體基因組結(jié)構(gòu)

德漢勞綿蟹的線粒體基因組是一個(gè)環(huán)狀DNA,全長(zhǎng)為15 755 bp,其全部序列被提交至GenBank,檢索號(hào)為MW239076. 序列分析結(jié)果顯示其全長(zhǎng)序列的堿基組成AT含量71.3%(36.2% A、35.1% T、19.0% C、9.7% G),包含典型的 37 條基因:13 條蛋白編碼基因、22 條 tRNA 基因和 2 條 rRNA 基因,其中14條基因在輕鏈編碼,23 條基因在重鏈編碼. 一個(gè)主非編碼區(qū)(main non-coding region,mNCR)長(zhǎng)度為566 bp,位于rrnS和trnI基因之間,其AT含量偏高,為80.9%.

和其他短尾下目一樣,德漢勞綿蟹線粒體基因組由37條基因緊湊排列而成,13 處相鄰基因之間存在堿基對(duì)的重疊,重疊長(zhǎng)度在 1 bp～7 bp 之間(見表1),這種重疊通常被認(rèn)為具有防止基因順序發(fā)生重排或防止基因在進(jìn)化中發(fā)生丟失的作用[12,17]. 德漢勞綿蟹線粒體基因組中還存在9處較長(zhǎng)的基因間隔(32 bp～130 bp),位于trnE-trnF、trnF-trnT、trnT-nad6、trnS2-trnH、trnH-nad5、nad5-nad4、nad4L-trnP、trnP-nad1和nad1-trnL1的連接處. 已公布的毛刺貝綿蟹同樣存在較長(zhǎng)的基因間隔(24 bp～482 bp),位于nad5-nad4、trnS2-nad1、nad1-trnL1、trnQ-trnL1、rrnS-trnI和trnI-trnM的連接處[35]. 這些長(zhǎng)的間隔序列恰好發(fā)生在基因重排的斷裂點(diǎn)處,被認(rèn)為是基因重排時(shí)重復(fù)的基因拷貝因隨機(jī)丟失不完全留下的冗余序列,可以作為基因重排的信號(hào)為推算基因重排的機(jī)制提供有力證據(jù)[21].

表1 德漢勞綿蟹(Lauridromia dehaani)線粒體基因組特點(diǎn)Table 1 Mitogenomic features of Lauridromia dehaani

2.2 蛋白編碼基因

13 條蛋白編碼基因中有11條蛋白編碼基因的起始密碼子為三聯(lián)體密碼子ATN(ATG、ATT、ATA),nad5基因的起始密碼子為GTG.cox1基因則以一種不常見的三聯(lián)體密碼子ACG為起始密碼子,這種以ACG 作為cox1基因的起始密碼子均在蛙蟹科、貝綿蟹科、人面蟹科等低等蟹類的線粒體基因組中發(fā)現(xiàn)過,被認(rèn)為是低等蟹類共同的特征[36]. 蛋白編碼基因的終止密碼子以TAA、TAG為主,cox2、cob和nad4的終止密碼子均為單個(gè)堿基T,這種不完整的終止密碼子可以通過mRNA成熟過程中多聚腺苷酸化作用補(bǔ)齊、轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾慕K止密碼子[37].

不同呼吸功能的蛋白編碼基因的A+T含量和選擇壓力存在明顯的差異. 參與呼吸鏈的復(fù)合體I亞基合成的基因(nad1、nad2、nad3、nad5、nad4和nad6)的A+T含量和Ka/Ks相對(duì)較高,分別在70.0%～74.5%和0.033 42～0.065 749;參與復(fù)合體 IV亞基合成的基因(cox1、cox2和cox3)和復(fù)合體Ⅲ亞基合成的基因(cob)的A+T含量和Ka/Ks值相較于其他基因偏低,分別在64.9%～68% 和0.005 79～0.017 71;參與ATP 合酶合成的atp8基因的AT含量和Ka/Ks最高,說明atp8基因受到的選擇壓力較小(見圖2).

圖2 德漢勞綿蟹(Lauridromia dehaani)線粒體基因組13條蛋白編碼基因的A+T含量和Ka/Ks值Fig.2 A+T content and Ka/Ks in 13 protein coding genes of Lauridromia dehaani

2.3 tRNA基因

22 條 tRNA基因的長(zhǎng)度在62 bp～71 bp,其中trnC最短,trnV最長(zhǎng). 除了trnS1基因缺少 DHU 臂外,其他tRNA基因都具有典型的三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu).trnS1基因缺少 DHU 臂的現(xiàn)象在已公布的毛刺貝綿蟹和其他短尾類中也發(fā)現(xiàn)過,這種臂的松散或缺失現(xiàn)象被認(rèn)為和進(jìn)化壓力有關(guān)[35-36,38-43].另外,trnS1的反密碼子臂由4個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成,其他tRNA基因均由5個(gè)核苷酸對(duì)構(gòu)成.所有tRNA基因的氨基酸接受臂由7個(gè)核苷酸對(duì)構(gòu)成. DHU臂和TΨC 臂上分別由2～4 和3～5 個(gè)核苷酸對(duì)構(gòu)成. 22 條tRNA的接受臂、DHU臂、反密碼子臂和TΨC臂上出現(xiàn)G/U的錯(cuò)配24次,trnY的反密碼子臂上出現(xiàn)U/U錯(cuò)配,trnK的接受臂上出現(xiàn) C/U 錯(cuò)配(見圖3).

圖3 德漢勞綿蟹(Lauridromia dehaani)22條tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 22 tRNA secondary structures of Lauridromia dehaani

2.4 基因重排

與短尾類線粒體基因組原始的基因排列比較[21],德漢勞綿蟹的線粒體基因組發(fā)生了顯著重排:基因塊[nad6-cob-trnS2]從trnP和nad1基因之間易位到trnF和nad5基因之間;trnT基因從nad4L和trnP基因間易位到基因塊[nad6-cob-trnS2]的上游;trnF易位到trnE和trnT之間,最終在trnE與nad1基因之間形成新的排列順序,即[trnF-trnT-nad6-cob-trnS2-trnH-nad5-nad4-nad4L-trnP].毛刺貝綿蟹僅trnH、trnQ和mNCR發(fā)生了易位:trnQ從trnI和trnM基因之間易位到trnL1和rrnL基因之間,mNCR從rrnS和trnI基因之間易位到trnL1和trnQ基因之間[35](圖4). 根據(jù)斷裂點(diǎn)和串聯(lián)重復(fù)隨機(jī)丟失模型[20-21],推斷出德漢勞綿蟹的線粒體基因組重排的途徑(圖4):首先基因片段[trnH-trnF-nad5-nad4-nad4L-trnT-trnP-nad6-cob-trnS2]發(fā)生一次重復(fù),然后第一個(gè)片段中trnH、[nad5-nad4-nad4L]和trnP丟失,第二個(gè)片段中trnF、trnT和[nad6-cob-trnS2]丟失,由于重復(fù)基因不完全丟失會(huì)在trnE-trnF、trnF-trnT、trnT-nad6、trnH-nad5、nad4L-trnP和trnP-nad1的基因連接處留下較長(zhǎng)的基因間隔(32 bp～130 bp). 另外,trnS2-trnH和nad5-nad4的基因連接處的間隔是由于trnH從[nad5-nad4]基因塊易位到基因塊[nad3-nad5]之間時(shí)留下.師國(guó)慧等人曾對(duì)毛刺貝綿蟹線粒體基因發(fā)生重排的路徑進(jìn)行了推導(dǎo):首先基因塊[rrnL-trnV-rrnS-mNCR-trnI-trnQ]經(jīng)歷一次串聯(lián)重復(fù),隨后丟失了第一個(gè)拷貝中的[rrnL-trnV-rrnS]和trnI,第二個(gè)拷貝中的mNCR和trnQ,最終形成毛刺貝綿蟹線粒體基因排列順序.依據(jù)此推斷結(jié)果,nad1和trnL1基因之間不會(huì)存在長(zhǎng)的基因間隔,但是實(shí)際發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因之間存在482 bp 的基因間隔,因此推斷重復(fù)的起始位置為trnL1,并且基因塊[trnL1-rrnL-trnV-rrnS-mNCR-trnI-trnQ]經(jīng)歷兩次串聯(lián)重復(fù),隨后第一個(gè)拷貝片段上的基因全部丟失,最終在nad1和trnL1基因之間留下長(zhǎng)片段的非編碼區(qū).另外,在毛刺貝綿蟹線粒體基因組中,trnQ-trnL1、rrnS-trnI和trnI-trnM處的基因間隔經(jīng)過 MITOS2 重新被確認(rèn)為 137 bp、270 bp 和31 bp.

圖4 德漢勞綿蟹(Lauridromia dehaani)與毛刺貝綿蟹(Dynomene pilumnoides)線粒體基因組排列順序的比較及其可能的重排機(jī)制Fig.4 Comparisons of mitochondrial gene orders and putative rearrangement process for Lauridromia dehaani and Dynomene pilumnoides

基因排列可以作為特定譜系和分類群的共衍生性狀,為系統(tǒng)發(fā)生重建和進(jìn)化關(guān)系推導(dǎo)提供重要的分子證據(jù)[18-25]. 已有研究發(fā)現(xiàn),trnH從[nad5-nad4]基因塊易位到基因塊[nad3-nad5]之間被認(rèn)為是短尾類線粒體基因組所共享的特征[21],并被證實(shí)在已測(cè)定的短尾類線粒體基因組中均存在[23,25]. 本研究中德漢勞綿蟹和已公布的毛刺貝綿蟹均存在trnH易位現(xiàn)象,提示綿蟹應(yīng)歸置于短尾下目. 與短尾類線粒體基因組原始排列順序相比[25],德漢勞綿蟹和毛刺貝綿蟹的線粒體基因組基因排列順序存在著明顯差異,前者發(fā)生巨大的基因重排,涉及到nad6、cob、trnH、trnF、trnS2和trnT等6條基因發(fā)生了易位,后者僅trnQ和mNCR2條基因發(fā)生了易位,這兩種獨(dú)特的排列順序是否在綿蟹科和貝綿蟹科的其他類群中也存在,還需今后獲得更多的樣本加以驗(yàn)證.

2.5 短尾下目的各派及亞派的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

基于 13 條蛋白編碼基因和 2 條rRNA基因聯(lián)合數(shù)據(jù)集構(gòu)建的最大似然樹(ML)和貝葉斯樹(BI)得到了幾乎一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖5所示). 結(jié)果顯示,24種歪尾類物種和75種短尾類物種各聚成一支,支持度均為 BS/BPP=100/1.00. 短尾下目的各派及亞派之間展現(xiàn)出強(qiáng)健的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):(綿蟹總科,人面蟹總科),(蛙蟹總科,真短尾派),其中德漢勞綿蟹和毛刺貝綿蟹聚成的一支(BS/BPP=100/1.00),再與人面蟹總科的物種形成姐妹群關(guān)系,成為短尾下目的基部分支,支持度均為 BS/BPP=100/1.00;蛙蟹總科的3個(gè)物種聚成一支,與胸孔亞派和異孔亞派組成的真短尾派形成姐妹群關(guān)系,支持度為 BS/BPP=98.9/1.00;在真短尾派中,來自異孔亞派的溪蟹科(Potamidae)和束腰蟹科(Parathelphusidae)的物種聚成一個(gè)分支,并與胸孔亞派的類群形成姐妹群的關(guān)系,節(jié)點(diǎn)支持度為BS/BPP=100/1.00.

圖5 基于13 條蛋白編碼基因(PCGs)和2條rRNA基因的構(gòu)建的最大似然樹(ML)和貝葉斯樹(BI)自舉值(BS)和貝葉斯后驗(yàn)概率(BPP)均在內(nèi)部節(jié)點(diǎn)顯示Fig.5 Phylogenetic trees derived for Brachyura using maximum likelihood(ML)and Bayesian inference(BI)analyses based on 13 protein coding genes(PCGs)and two rRNAs. Maximum likelihood bootstrap(BS) and Bayesian posterior probabilities(BPP)values were shown at the corresponding nodes

在所有蟹類中,綿蟹的成體還有退化的尾肢,鰓數(shù)甚多,有14～20對(duì)絲狀鰓(非葉狀鰓)[8];從個(gè)體發(fā)育來看,蚤狀幼體沒有長(zhǎng)的背刺,第3顎足無外肢,具有歪尾類(Anomura)的特征,因此早期有些學(xué)者將其歸入歪尾下目[44-46],該結(jié)果得到了Speares 使用18S rRNA 作為分子標(biāo)記的支持,但是節(jié)點(diǎn)支持度薄弱[47]. 截止目前,大部分的分類學(xué)者認(rèn)為綿蟹的成體更接近真正蟹類的外形特征,即其頭胸部發(fā)達(dá),腹部極為退化并折附于頭胸部腹面,而后大量的分子系統(tǒng)發(fā)生樹也顯示綿蟹和和其他短尾類具有緊密的親緣關(guān)系,均支持將綿蟹歸入短尾下目[7-11,26,48-49]. 本研究中,聯(lián)合分子系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和線粒體排列順序的共衍性狀共同佐證綿蟹派隸屬短尾下目.

研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),如果使用肢孔派的分類觀點(diǎn),肢孔派的綿蟹總科、人面綿蟹總科、人面蟹總科、蛙蟹總科和圓關(guān)公蟹總科應(yīng)該聚為一支,然而本研究中蛙蟹總科與真短尾派形成姐妹群的關(guān)系,不支持肢孔派的單系性. 越來越多的分子和形態(tài)證據(jù)支持使用多派分類的方法以替代肢孔派. 然而縱觀各學(xué)派的分類觀點(diǎn)時(shí),各派內(nèi)部的組成和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系沒有得到統(tǒng)一,特別是人面蟹總科的系統(tǒng)發(fā)生地位搖擺不定:或與圓關(guān)公蟹總科和蛙蟹總科親緣關(guān)系近支持三者組成古短尾派[8-9](圖6a);或與(綿蟹總科+人面綿蟹總科)形成姐妹群關(guān)系支持人面蟹總科歸置于綿蟹派[2,10,48,50],同時(shí)圓關(guān)公蟹總科和蛙蟹總科形成姐妹群關(guān)系(圖6b);或與(圓關(guān)公蟹總科+蛙蟹總科+真短尾派)的分支形成姐妹群關(guān)系支持單獨(dú)設(shè)立一派,但圓關(guān)公蟹總科和蛙蟹總科哪個(gè)與真短尾派親緣關(guān)系更近也未得到一致結(jié)論[13,15,51](圖6c、d). 相較于Shi等人使用線粒體基因組蛋白編碼基因構(gòu)建的短尾下目的系統(tǒng)發(fā)生樹[36],本研究增加了綿蟹總科的取樣避免長(zhǎng)枝吸引對(duì)樹結(jié)構(gòu)的影響[16]. 研究結(jié)果顯示,人面蟹總科與綿蟹總科,蛙蟹總科與真短尾派具有緊密的親緣關(guān)系,節(jié)點(diǎn)支持度明顯增加. 遺憾的是,由于缺少圓關(guān)公蟹總科和人面綿蟹總科的樣本,這5個(gè)總科之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系依然比較模糊,亟需獲取其他兩個(gè)總科的代表物種的線粒體基因組全序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹加以解析.

圖6 短尾下目?jī)?nèi)部個(gè)派之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的假說Fig.6 Hypotheses of interrelationships among brachyuran section

在真短尾派中,若按照雌、雄生殖孔分別在第六胸節(jié)及第四步足底節(jié)的特征,原生淡水蟹應(yīng)被分配到異孔亞派[7]. 然而,Von Sternberg和Cumberlidge 根據(jù)更為細(xì)致的雄性生殖孔的解剖特征,提出溪蟹科、陸溪蟹科(Gecarcinucidae)和擬束腹蟹科(Pseudothelphusidae)應(yīng)放置在胸孔亞派[52-53]. 本研究結(jié)果顯示溪蟹科(Potamidae)和束腰蟹科(Parathelphusidae)的代表物種聚成的分支與胸孔亞派形成姐妹群的關(guān)系,且節(jié)點(diǎn)支持度高,證實(shí)了之前使用部分基因、線粒體基因組和轉(zhuǎn)錄組序列推斷的系統(tǒng)發(fā)生結(jié)果,支持溪蟹科和束腰蟹科與胸孔亞派的親緣關(guān)系更近[11,16,22,54]. 但與Tsang等人綜合部分線粒體基因和核基因的重建的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系相矛盾,其研究結(jié)果顯示舊大陸的非洲溪蟹科(Potamonautidae)、溪蟹科和陸溪蟹科的代表物種形成的一個(gè)單系類群,成為異孔亞派的早期分支,但是節(jié)點(diǎn)支持度薄弱[10]. 雖然線粒體基因組序列能夠構(gòu)建出強(qiáng)健的系統(tǒng)發(fā)生樹,若要進(jìn)一步厘定淡水蟹的分類地位以及追溯淡水蟹的起源,仍需要針對(duì)淡水蟹類、胸孔亞派和其他異孔亞派等類群進(jìn)行廣泛取樣,重建它們之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系.

3 結(jié)論

本研究首次測(cè)定德漢勞綿蟹的線粒體基因組,確定其序列全長(zhǎng)為15 755 bp,其蛋白編碼基因和 tRNA 呈現(xiàn)以下進(jìn)化特征:不同呼吸功能的蛋白編碼基因的堿基組成(AT含量)和選擇壓力(Ka/Ks)呈現(xiàn)差異,atp8基因最高,cox1基因最低;cox1以低等蟹類中常見的 ACG 作為起始密碼子;trnS1缺失了DHU臂. 綿蟹總科的德漢勞綿蟹線與該總科的毛刺貝綿蟹的線粒體基因組排列順序完全不同,意味著該總科其他類群存在基因重排的潛能,兩者又共享短尾類線粒體基因組中trnH易位特征,為支持綿蟹總科歸置于短尾下目提供了獨(dú)立佐證. 系統(tǒng)發(fā)生樹解析出強(qiáng)健的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),揭示出綿蟹總科與人面蟹總科之間,蛙蟹總科與真短尾派之間均形成姐妹群關(guān)系,為短尾下目高階元分類提供分子依據(jù).