基于生物信息學方法對抑郁癥小鼠腦組織差異基因表達的分析

陳盛，王高華

抑郁癥是一種情感性精神障礙綜合征，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展、生活節(jié)奏的加快，抑郁癥患者數(shù)量逐年增加，研究表明，全球范圍內(nèi)抑郁癥發(fā)病率約17%，抑郁癥已經(jīng)成為人類心理疾病的頭號殺手[1]。目前，臨床上對于抑郁癥患者主要以藥物治療為主[2]，選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）最常用，SSRI 通過抑制突觸前神經(jīng)元對5-羥色胺的再攝取，提高突觸間隙5-羥色胺濃度，從而提高神經(jīng)元興奮性，發(fā)揮抗抑郁作用，然而長期使用患者可出現(xiàn)耐藥性，藥效降低[3]。隨著基因組學、分子生物學、影像學、病理學等多學科的發(fā)展，基于疾病發(fā)病機理開發(fā)的各種靶向藥物廣泛應用于臨床，特別是惡性腫瘤人群，而當前對于藥物治療無效的抑郁癥患者，尚缺乏有效的個性化和靶向治療手段。

生物信息學是將信息技術應用于分子生物學的一門新興的交叉學科，隨著當前各種高通量測序技術的發(fā)展，越來越多的學者將測序手段應用于科研中，通過對疾病模型或者生物學過程進行廣泛篩選，并利用生物信息學技術挑選出目的基因，然后通過各種細胞實驗、分子實驗及動物實驗驗證其功能，由此篩選出調(diào)控某些疾病發(fā)生或生物學過程的關鍵基因和信號通路，為疾病的早期診斷和藥物開發(fā)提供研究基礎[4,5]。本研究基于公共數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學這一新興研究手段，篩選與抑郁癥的發(fā)生相關的生物學過程和核心基因，以期為探索抑郁癥的發(fā)病機理和靶向藥物開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站中的基因表達綜合庫中，以“Major Depressive Disorder”為關鍵詞，設置小鼠組織和基因表達矩陣為過濾條件，獲得GSE151807數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集基于高通量測序檢測慢性溫和應激模型誘導的抑郁癥小鼠和對照組小鼠海馬和杏仁核組織中基因表達水平。

1.2 方法

1.2.1 差異基因的篩選 本研究基于抑郁癥組和對照組小鼠海馬和杏仁核組織中基因表達值倍數(shù)變化（Fold change，F(xiàn)C）和P值，使用R軟件并借助Bioconductor中的Limma 功能包對差異基因（differentially expressed genes，DEGs）進行篩選，設置篩選條件為：|log2FC| ＞0.5且P-Val ＜0.05。

1.2.2 GSEA 分析 使用GSEA3.0 軟件對數(shù)據(jù)集GSE151807 的基因表達矩陣進行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA），根據(jù)NominalP-Value 和標準化富集得分（Normalized Enrichment Score，NES）對富集的信號通路進行過濾，設置過濾條件為：NominalP-Value ＜0.05且|NES|＞1。

1.2.3 基因本體論富集分析 利用David（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery）在線分析工具對抑郁癥小鼠海馬和杏仁核組織中的差異基因進行基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析，使用R軟件及ggplot2功能包進行數(shù)據(jù)可視化。該分析從生物學過程（Biological Process，BP）、細胞組成（Cellular Component，CC）和 分 子 功 能（Molecular Function，MF）三個方面分析差異基因可能涉及的功能，設置篩選條件為：P-Val ＜0.05。

1.2.4 KEGG 信號通路富集分析 利用David在線分析工具對抑郁癥小鼠海馬和杏仁核組織中的差異基因進行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號通路富集分析，數(shù)據(jù)可視化借助R 軟件進行，當P值小于0.05時認為此信號通路顯著富集。

1.2.5 差異基因表達蛋白相互作用網(wǎng)絡分析及關鍵基因篩選 使用String 在線網(wǎng)站（網(wǎng)址：http://stringdb.org/）構建抑郁癥小鼠海馬和杏仁核組織中的差異基因表達蛋白間相互作用網(wǎng)絡（Protein-Protein Interaction，PPI），將蛋白間相互作用數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.2 軟件，利用MCODE 插件工具進行模塊聚類分析及數(shù)據(jù)可視化，利用Cytohubba 插件工具，基于不同的算法挑選前10 位關鍵基因（Hub gene），不同算法之間進行Venn分析，篩選出核心基因。

2 結果

2.1 差異基因的篩選

選取GEO數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)集GSE151807，共含有12個小鼠海馬和杏仁核組織樣本，其中對照組小鼠6個，抑郁癥組小鼠6個。結果表明，與對照組小鼠相比，抑郁癥小鼠海馬和杏仁核組織中共有351個基因表達水平發(fā)生改變，其中182個基因上調(diào)，169個基因下調(diào)，見圖1。

2.2 數(shù)據(jù)集GSE151807基因富集分析

對數(shù)據(jù)集GSE151807基因表達矩陣進行GSEA分析發(fā)現(xiàn)，抑郁癥小鼠海馬和杏仁核組織中神經(jīng)活性配體-受體相互作用、泛素介導的蛋白水解、亨廷頓氏病、谷胱甘肽代謝、過氧化物酶、長期抑郁等有關的基因顯著富集，見圖2。

2.3 差異基因GO富集分析

圖1 數(shù)據(jù)集GSE151807差異基因的篩選

圖2 數(shù)據(jù)集GSE151807基因富集分析

利用David在線分析工具進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因富集在RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的調(diào)控（GO:0006357）、單-多細胞生物過程（GO:0044707）、系統(tǒng)發(fā)育（GO:0048731）等生物學過程，見圖3A；主要分布在細胞內(nèi)膜結合細胞器（GO:0043231）、細胞內(nèi)細胞器（GO:0043229）等細胞組分，見圖3B；具有轉錄因子活性調(diào)控（GO:0000982）、轉錄調(diào)控區(qū)DNA 結合調(diào)控（GO:0044212）等分子功能，見圖3C、表1。

圖3 差異基因GO富集分析

2.4 差異基因KEGG信號通路富集分析

KEGG 信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因富集在煙酸酯和煙酰胺代謝（mmu:00760）、孕激素介導的卵母細胞成熟（mmu:04914）、ECM-受體相互作用（mmu:04512）等信號通路中，見圖4。

2.5 差異基因表達蛋白互作網(wǎng)絡分析及核心基因篩選

通過String在線分析工具，構建了317個差異基因表達蛋白相互作用的蛋白-蛋白網(wǎng)絡，見圖5A；使用Cytoscape軟件中MCODE 插件工具進行聚類，共含有9 個模塊，前3 個模塊系數(shù)較高，見圖5B～D，與適應性免疫過程有關。使用Cytoscape軟件中Cytohubba功能包進行核心基因的篩選，基于6種不同的算法，得到前10位核心基因，見表2；其中，F(xiàn)os和Itpkb基因在此6種算法中均居于前10位，見圖5E；Fos基因在抑郁癥小鼠海馬和杏仁核組織中為下調(diào)基因，Itpkb基因在抑郁癥小鼠海馬和杏仁核組織中為上調(diào)基因，見圖5F。

3 討論

既往研究表明，海馬和杏仁核與抑郁癥的發(fā)生密切相關[6]。海馬體積縮小是抑郁癥神經(jīng)影像學研究中最為常見的發(fā)現(xiàn)[7]，對抑郁癥患者死亡后腦分析發(fā)現(xiàn)基底外側杏仁核功能障礙與抑郁癥的病理生理有關，同時有研究表明，杏仁核體積及活動減少與抑郁癥嚴重程度密切相關[8,9]。Shen 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，杏仁核中存在膽囊收縮素陽性和陰性兩種神經(jīng)元，管理小鼠“厭惡”和“愉悅”兩種情緒體驗，進一步研究發(fā)現(xiàn)，膽囊收縮素陽性的神經(jīng)元表達大量的大麻素受體，敲低大麻素受體的小鼠在社會應激壓力下更容易出現(xiàn)抑郁樣表現(xiàn)，這些研究均表明，海馬及杏仁核功能異常與抑郁癥的發(fā)生密切相關。因此，本研究利用生物信息學手段，對抑郁癥小鼠海馬和杏仁核組織中基因表達情況進行深入分析，結果發(fā)現(xiàn)，抑郁癥小鼠海馬和杏仁核組織中有大量基因表達水平發(fā)生改變，這些差異基因主要分布在細胞內(nèi)細胞器中，參與調(diào)控RNA聚合酶II啟動子轉錄的調(diào)控等生物學過程，與煙酸酯和煙酰胺代謝過程密切相關，而既往的研究已經(jīng)表明，抑郁癥大鼠體內(nèi)存在煙酸酯和煙酰胺代謝異常[11]。此外，基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，與長期抑郁有關的基因顯著富集，表明此種分析方法具有一定的可靠性和科學性。隨后，本研究構建差異基因表達蛋白相互作用網(wǎng)絡，并進行核心基因的篩選，發(fā)現(xiàn)Fos 和Itpkb 基因可能是與抑郁癥有關的核心基因。

Fos 基因?qū)儆贔os 基因家族的一員，該家族包括：Fos、Fosl1、Fosl2 和Fosb 共4 個基因，其編碼的蛋白質(zhì)c-Fos 作為一種核蛋白轉錄因子，廣泛參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程，與惡性腫瘤、阿爾茲海默病、帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病密切相關[12,13]，而Fos 基因在抑郁癥發(fā)生、發(fā)展中的作用目前尚未完全闡明。既往研究表明，在慢性應激誘導的抑郁癥大鼠海馬中，c-Fos蛋白水平顯著降低，同樣，在右旋苯丙胺戒斷誘發(fā)的大鼠抑郁癥模型中，海馬及杏仁核組織中Fos基因mRNA水平顯著降低[14]。而Ionov等[15]研究發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥能上調(diào)大鼠側內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬背側下室c-Fos的表達，這些研究均提示，F(xiàn)os可能作為一個保護性基因抑制抑郁癥的發(fā)生。Itpkb 基因編碼一種肌醇三磷酸激酶，即肌醇1,4,5-三磷酸3-激酶B，屬于肌醇多磷酸激酶家族，該家族包括Itpka、Itpkb和Itpkc三種同工酶，其中Itpkb 在腦組織中廣泛表達，參與調(diào)節(jié)免疫反應和細胞內(nèi)Ca2+平衡。目前關于Itpkb的報道，主要集中在自身免疫性疾病和腫瘤等領域。研究表明，Itpkb與T細胞的活化，腫瘤細胞的生長、轉移及耐藥等生物學行為有關[16,17]。此外，也有研究報道，Itpkb在阿爾茨海默病患者的大腦皮質(zhì)中的水平顯著增加，Itpkb 過表達可以加劇小鼠阿爾茨海默病[18]，而關于Itpkb 在抑郁癥疾病中的作用還未見報道。既往有學者認為，磷酸肌醇-鈣離子功能相對亢進及腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸腺苷系統(tǒng)功能減退是抑郁發(fā)生的根本原因[19]，而Itpkb 本身就具有催化肌醇1, 4, 5-三磷酸(IP3)至肌醇1,3,4,5-四磷酸(IP4)及維持Ca2+平衡的功能，因此，Itpkb 過表達可能是通過引起磷酸肌醇-鈣離子功能相對亢進及腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸腺苷系統(tǒng)功能減退從而促進抑郁癥的發(fā)生。不過，本研究尚未構建抑郁癥動物模型進一步驗證海馬和杏仁核組織中Fos和Itpkb基因的變化，也未能從動物水平驗證Fos和Itpkb 基因敲低及過表達對慢性溫和應激誘導的小鼠抑郁癥的影響，這有待后續(xù)進一步探究。

表1 差異基因GO富集分析，包括生物過程、細胞組分、分子功能

圖4 差異基因KEGG信號通路富集分析

圖5 差異基因表達蛋白互作網(wǎng)絡分析及核心基因篩選

總之，本研究基于公共數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學這一快速且經(jīng)濟的方法，發(fā)現(xiàn)Fos 和Itpkb 可能是與抑郁癥發(fā)生相關的關鍵基因，為后期實驗驗證提供基礎，F(xiàn)os和Itpkb可能作為潛在的抗抑郁藥物治療靶點。