土田七中化學(xué)成分的分離與鑒定

馬麗芳，李 燕，陳 凱，汪 倫

(1.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都610065；2.四川大學(xué) 生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041)

土田七[Stahlianthus involucratus（King ex Bak.）Craib]，別名也叫姜七、三七姜、姜葉三七、竹葉三七，為姜科土田七屬植物土田七的塊根和根莖。姜科植物是多年生草本植物大家族，種類繁多，是熱帶和亞熱帶地區(qū)分布最廣的植物之一，大約有47屬1400種。姜科植物是次生代謝產(chǎn)物的來源，具有豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)和重要的生物活性。目前，姜科植物因其植物化學(xué)和藥理特性被廣泛研究，許多姜科植物中分離出多種具有藥理作用的活性化合物。

植物土田七，分布于中國的云南、廣西、廣東、福建等省，在印度也有分布[1]。其味辛、微苦，性溫，具有散瘀消腫，活血止血之功效。作為一種民間藥，它的根莖長期以來一直用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中治療炎癥，疼痛和發(fā)燒[2]。

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，目前從土田七中分離得到的化合物包含麥角烷二聚物、倍半萜類、卡丹烷二聚體[3-6]。由于對該植物成分與活性的報(bào)道較少，給該藥用植物的使用、推廣以及鑒定等方面帶來較大的困難。為了進(jìn)一步尋找土田七中化學(xué)成分，給土田七的應(yīng)用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，作者利用半制備型高效液相色譜、柱色譜等多種色譜分離技術(shù)對土田七進(jìn)行分離純化，并采用質(zhì)譜和核磁共振波譜鑒定了所得化合物的結(jié)構(gòu)，為土田七的活性研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與材料

Bruker avance 400型核磁共振儀，德國布魯克公司；QTOF質(zhì)譜儀和ESI離子源，英國沃特世公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞典BUCHIR200；半制備型高效液相色譜，美國沃特斯；Water 2695液相色譜儀，美國Waters公司；中壓柱層析系統(tǒng)，瑞士Buchi Flawil公司；MCI-gel CHP 20樹脂，日本三菱公司；Sephadex LH-20，美國Amersham P-harmacia Biotech公司；柱層析硅膠，德國默克公司。

藥材由四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室胡以國教授提供，采自云南，并鑒定為土田七[Stahlianthus involucratus（King ex Bak.）Craib]。

1.2 提取與分離

土田七提取流程圖如圖1所示。土田七根莖2 kg，經(jīng)粉碎后，采用60目的篩網(wǎng)過篩，用75%乙醇（3 L）加熱回流提取，每次提取3 h，提取3次合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得到浸膏412 g。將浸膏用溫水（5 L）分散，分別用正己烷（5 L/次）、乙酸乙酯（5 L/次）、正丁醇（5 L/次）3種溶劑進(jìn)行萃取，每種溶劑萃取3次，將各部分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到正己烷部分26 g，乙酸乙酯部分61 g，正丁醇部分146 g。

圖1 土田七提取分離流程圖Fig.1 Flowchar t for extraction and isolation of Stahlianthus involucratus

將正己烷部分（20 g）用硅膠（60～100目）干法拌樣，旋干后進(jìn)行中壓柱層析（100～200目）分離，用石油醚-乙酸乙酯作流動相進(jìn)行梯度洗脫（1∶0～0∶1，v/v），每250 mL收集1次，通過TLC（薄層色譜法）進(jìn)行檢測，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將洗脫液分別減壓回收溶劑，得到6個(gè)組分（Fr.P.1～Fr.P.6）。Fr.P.3（2.69 g）采用中壓柱層析（200～300目），用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫（50∶1～0∶1，v/v），每50 mL收集1次，通過TLC進(jìn)行檢測，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將洗脫液分別減壓回收溶劑，得到5個(gè)組分（Fr.P.3.1～Fr.P.3.5）。進(jìn)一步對Fr.P.3.1用中壓柱層析（200～300目）分離，用石油醚和乙酸乙酯作流動相進(jìn)行梯度洗脫（50∶1～0∶1，v/v），經(jīng)TLC檢測后得到了4個(gè)組分（Fr.P.3.1.1～Fr.P.3.1.4）。Fr.P.3.1.3采用半制備液相色譜柱（填料為Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（95∶5，v/v）進(jìn)行等度洗脫，得到化合物1。

將乙酸乙酯部分（50 g）用硅膠（60～100目）干法拌樣，旋干后進(jìn)行中壓柱層析（100～200目）分離，用石油醚-乙酸乙酯作流動相進(jìn)行梯度洗脫（1∶0～0∶1，v/v）。通過TLC進(jìn)行檢測，每500 mL收集1次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將收集的洗脫液分別減壓回收溶劑，得到7個(gè)組分（Fr.E.1～Fr.E.7）。Fr.E.3（2.3 g）用硅膠（200～300目）干法拌樣，旋干后進(jìn)行中壓柱層析（200～300目）分離，用石油醚和乙酸乙酯作流動相進(jìn)行梯度洗脫（40∶1～0∶1，v/v），每100 mL收集1次，通過TLC進(jìn)行檢測，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將收集的洗脫液分別減壓回收溶劑，得到6個(gè)組分（Fr.E.3.1～Fr.E.3.6）。Fr.E.3.6用半制備液相色譜柱（填料為Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），在甲醇和水（80∶20，v/v）的條件下等度洗脫，得到化合物8。Fr.E.4（5.9 g）用Sephadex LH-20柱（填料為Sephadex LH-20，50μm），采用二氯甲烷和甲醇（1∶1，v/v）進(jìn)行等度洗脫，共得到5個(gè)組分（Fr.E.4.1～Fr.E.4.5）。Fr.E.4.3采用SephadexLH-20柱（填料為Sephadex LH-20，50μm），用二氯甲烷和甲醇（1∶1，v/v）進(jìn)行等度洗脫，得到9個(gè)組分（Fr.E.4.3.1～Fr.E.4.3.9）。進(jìn)一步采用半制備液相色譜柱（填料為Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm）對Fr.E.4.3.1分離，用甲醇和水（60∶40，v/v）進(jìn)行等度洗脫得到化合物2。Fr.E.4.3.4采用中壓柱層析（200～300目），用石油醚和乙酸乙酯作流動相進(jìn)行梯度洗脫（20∶1～1∶1，v/v），共得到5個(gè)組分（Fr.E.4.3.4.1～Fr.E.4.3.4.5）。Fr.E.4.3.4.1用半制備液相色譜柱（填料為Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（60∶40，v/v）作流動相進(jìn)行等度洗脫，得到化合物4和5。Fr.E.4.3.4.2用半制備液相色譜柱（填料為Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（55∶45，v/v）作流動相進(jìn)行等度洗脫，得到化合物3。Fr.E.4.3.4.4利用半制備液相色譜柱（填料為Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（50∶50，v/v）作流動相進(jìn)行等度洗脫，得到化合物7。Fr.E.4.3.6利用半制備液相色譜柱（填料為Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（45∶55，v/v）進(jìn)行等度洗脫得到化合物6，利用半制備液相色譜柱（填料為Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm）對Fr.E.4.3.7分離，用甲醇和水（45∶55，v/v）進(jìn)行等度洗脫得到化合物9和10。采用MCI柱（填充材料為MCI-gel CHP 20P，70～150μm）對Fr.E.7（25.6 g）進(jìn)行分離，用乙醇和水（1∶3，1∶1，3∶1和1∶0，v/v）進(jìn)行梯度洗脫得到4個(gè)組分（Fr.E.7.1～Fr.E.7.4）。將Fr.E.7.3進(jìn)一步采用乙醇和水（3∶1～1∶0，v/v）做流動相用MCI柱（填充材料為MCI-gel CHP 20P，70～150μm）分離，得到5個(gè)組分（Fr.E.7.3.1～Fr.E.7.3.5）。最后采用半制備液相色譜柱（填料為Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm）純化Fr.E.7.3.3，用甲醇和水（35∶65，v/v）進(jìn)行等度洗脫得到化合物11。

分離純化所得化合物進(jìn)一步采用核磁共振波譜鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，根據(jù)核磁譜圖和薄層色譜（TLC）可判定化合物純度無雜質(zhì)，純度較高。

1.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無定型粉末。ESI-MS（m/z）：413.3705（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ：5.35（1H，m，H-6），5.15（1H，dd，J=8.4，H-22），5.02（1H，dd，J=8.4，H-23），3.53（1H，m，H-3），2.30～0.64（43H，m）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）：δ：140.77（C-5），138.32（C-22），129.30（C-23），121.72（C-6），71.81（C-3），56.88（C-14），55.98（C-17），51.25（C-24），50.18（C-9），42.32（C-4），42.23（C-13），40.49（C-20），39.70（C-12），37.27（C-1），36.53（C-10），36.16（C-25），31.89（C-8），31.68（C-2），28.92（C-7），25.41（C-15），24.37（C-16），24.31（C-28），21.22（C-21），21.10（C-11），19.41（C-19），18.99（C-26），12.25（C-18），12.06（C-29）11.87（C-27）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[7]一致，故鑒定化合物1為豆甾醇。

化合物2：無定型粉末。ESI-MS（m/z）：253.0641（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：7.40（1H，d，J=3.6，H-2），6.60（1H，d，J=3.6，H-3），6.38（1H，d，J=3.1，H-2′），6.30（1H，d，J=3.1，H-3′），5.40（1H，s，H-7），4.63（2H，s，H-5），4.51（2H，s，H-5′）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：178.06（C-6），161.82（C-4），154.70（C-4′），152.50（C-1），150.65（C-1′），123.43（C-2），109.51（C-3），108.83（C-2′），107.47（C-3′），97.89（C-7），56.25（C-5），55.98（C-5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8]一致，故鑒定的化合物2為5，5′-二羥甲基糠醛。

化合物3：無定型粉末。ESI-MS（m/z）：257.1025（[M+H]+）。1H NMR（400 Hz，CD3OD）：δ：5.98（1H，q，J=6.8，H-2），5.20（1H，s，H-10），4.86（1H，s，H-10），3.02（2H，s，H-4），1.97（1H，s，CH3-12），1.91（3H，d，J=6.8，CH3-1），1.62（3H，s，CH3-7）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：172.39（C-7），170.04（C-11），169.53（C-8），146.38（C-5），138.64（C-2），130.56（C-3），111.61（C-10），82.98（C-6），35.54（C-4），20.94（C-9），19.84（C-12），14.55（C-1）。命名為順式-6-甲基-5-亞甲基-3-亞乙基-6-乙酰氧基己二酸。

化合物4：無定型粉末。ESI-MS（m/z）：259.1103（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.06（1H，d，J=7.1，H-2），2.61（1H，m，H-4），2.18（1H，m，H-5），2.10（1H，m，H-4），2.09（3H，s，CH3-11），2.02（3H，d，J=7.1，CH3-1），1.72（3H，s，CH3-9），0.82（3H，d，J=7.2，CH3-12）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：173.02（C-10），170.12（C-7），169.77（C-8），138.28（C-2），130.83（C-3），83.49（C-6），35.61（C-4），32.23（C-5），21.02（C-9），19.93（C-11），14.52（C-1），12.11（C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[9]一致，故鑒定化合物4為反式-（2R，3S）-2，3-二甲基-5-亞乙基-2-乙酰氧基己二酸。

化合物5：無定型粉末。ESI-MS（m/z）：217.0154（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.16（1H，d，J=7.6，H-2），2.57（1H，m，H-4），2.28（1H，m，H-5），2.20（1H，m，H-4），2.01（3H，d，J=7.6，CH3-1），1.39（3H，s，CH3-9），0.92（3H，d，J=6.8，CH3-10）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：174.70（C-7），165.42（C-8），145.06（C-2），122.48（C-3），84.69（C-6），34.47（C-4），32.53（C-5），20.67（C-9），15.12（C-1），12.23（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]一致，故鑒定化合物5為反式-（2R，3S）-2，3-二甲基-5-亞乙基-2-羥基己二酸。

化合物6：無定型粉末。ESI-MS（m/z）：125.0541（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.93（1H，s，H-2），6.82（1H，d，J=7.5，H-5），6.68（1H，d，J=7.5，H-4），1.96（3H，s，H-1）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：147.90（C-6），145.38（C-3），126.58（C-1），121.33（C-5），115.09（C-4），113.66（C-2），21.33（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[12]一致，故鑒定化合物6為2，5-二羥基甲苯。

化合物7：無定型粉末。ESI-MS（m/z）：115.0681（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.99（1H，m，H-2），2.43（1H，m，H-4），2.23（1H，m，H-4），1.67（3H，d，J=6.3，H-5），0.88（3H，d，J=7.1，H-1）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：167.98（C-6），141.03（C-3），124.81（C-2），28.51（C-4），12.66（C-5），12.64（C-1）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[13]一致，故鑒定化合物7為2-乙基-2-丁烯酸。

化合物8：無定型粉末。ESI-MS（m/z）：165.0475（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：7.52（1H，d，J=16，H-7），7.34（2H，d，J=8.5，H-2/6），6.73（1H，d，J=8.5，H-3/5），6.18（1H，d，J=16，H-8）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：169.67（C-9），159.76（C-4），145.25（C-7），129.68（C-2/6），125.85（C-1），115.42（C-3/5），114.40（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[14]一致，故鑒定化合物8為糠酸。

化合物9：無定型粉末。ESI-MS（m/ z ）：165.0521（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：7.49（2H，d，J=8.5，H-2/6），6.72（1H，d，J=12，H-7），6.65（1H，d，J=8.5，H-3/5），5.66（1H，d，J=12，H-8）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：169.62（C-9），157.98（C-4），142.61（C-7），132.23（C-2/6），126.36（C-1），115.98（C-8），114.37（C-3/5）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[14]一致，故鑒定化合物9為反式-4-羥基肉桂酸。

化合物10：無定型粉末。ESI-MS（m/z）：336.1721（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.16（1H，s，H-2），5.76（1H，q，J=7.2，H-20），5.35（1H，d，J=11.6，H-9），5.26（1H，s，H-7），4.94（1H，s，H-8），4.32（1H，m，H-3），4.14（1H，d，J=11.6，H-9），3.80（1H，m，H-3），3.05（1H，m，H-5），2.48（1H，m，H-6），2.39（1H，m，H-6），2.15（1H，m，H-14），1.75（3H，d，J=7.2，CH3-21），1.72（1H，m，H-14），1.59（1H，m，H-13），1.29（3H，s，CH3-18），0.79（3H，d，J=7.4，CH3-19）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：176.78（C-11），166.78（C-16），135.46（C-20），132.55（C-2），132.39（C-1），130.66（C-15），77.97（C-8），76.80（C-12），73.43（C-7），60.90（C-3），57.94（C-9），52.82（C-5），38.60（C-13），37.95（C-14），33.71（C-6），23.81（C-18），13.89（C-21），9.74（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[15]一致，故鑒定化合物10為千里光寧堿。

化合物11：無定型粉末。ESI-MS（m/z）：376.1682（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.07（1H，s，H-2），5.98（1H，q，J=7.2，H-20），5.30（1H，s，H-7），5.21（1H，s，H-19），4.97（1H，s，H-19），4.65（1H，d，J=11.6，H-9），4.99（1H，s，H-8），4.44（1H，d，J=11.6，C-9），4.35（1H，m，H-3），3.86（1H，m，H-3），3.81（1H，m，H-5），3.25（1H，m，H-14），3.07（1H，m，H-5），2.87（1H，m，H-14），2.33（1H，m，H-6），1.98（3H，d，J=7.2，CH3-21），1.82（3H，s，H-23），1.65（3H，s，CH3-18）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：170.24（C-11），169.86（C-22），166.20（C-16），145.45（C-13），137.67（C-20），131.46（C-2），130.76（C-1），130.72（C-15），114.97（C-19），82.65（C-12），77.67（C-8），72.86（C-7），60.35（C-3），58.75（C-9），53.35（C-5），36.73（C-14），33.41（C-6），20.65（C-18），19.81（C-21），14.29（C-23）。以上的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[16]一致，因此鑒定化合物11為乙?；Ю锕夥屏謮A。

2 結(jié)果與討論

化合物3為新化合物，無定型粉末。質(zhì)譜數(shù)據(jù)給出[M+Na]+=279.0841，可確定該化合物的分子式為C12H16O6，不飽和度為5。1H NMR譜數(shù)據(jù)給出3個(gè)烯烴氫信號，分別為[δ（H）5.98（1H，d，J=6.8，H-2），5.21（1H，s，H-10），4.86（1H，s，H-10）]，2個(gè)亞甲基氫信號[δ（H）3.02（2H，s，H-4）]，9個(gè)甲基氫信號[δ（H）1.91（3H，d，H-1），1.62（3H，s，H-9），1.97（3H，s，H-12）]。

13C NMR譜圖顯示化合物共12個(gè)碳，與高分辨數(shù)據(jù)對應(yīng)。13C NMR數(shù)據(jù)給出1個(gè)烯烴上的次甲基和亞甲基信號δ（C）138.64（C-2）和111.61（C-10），1個(gè)亞甲基信號δ（C）35.54（C-4），3個(gè)甲基信號δ（C）20.94（C-12），19.84（C-9），14.55（C-1），3個(gè)羰基信號δ（C）172.39（C-7），170.04（C-11），169.53（C-8），2個(gè)烯烴季碳信號δ（C）146.38（C-5）和130.56（C-3），1個(gè)季碳信號δ（C）82.98（C-6）。

如表1所示，通過結(jié)合13C NMR和HSQC數(shù)據(jù)可以更進(jìn)一步的確定C-H關(guān)系：δH 5.20（1H，s，H-10），4.86（1H，s，H-10）為末端烯烴雙氫，1個(gè)孤立的亞甲基信號δH 3.02（2H，s，H-4），1個(gè)與次甲基耦合的甲基信號δH 1.91（3H，d，J=6.8，CH3-1），2個(gè)甲基信號δH 1.97（1H，s，CH3-12）和1.62（3H，s，CH3-9）。

表1 化合物3的核磁數(shù)據(jù)Tab.1 NMR spectral data of compound 3

如圖2所示，根據(jù)COSY譜可以推斷C-2位烯烴與C-1位甲基具有相關(guān)性，在HMBC譜中，4-H和5-C、6-C、3-C、8-C以及10-C、2-C，1-C均相關(guān)，2-H和1-C、3-C，4-C、5-C、8-C相關(guān)，10-H與5-C、6-C、7-C相關(guān)，9-H與7-C、6-C、5-C相關(guān)，12-H與11-C相關(guān)，根據(jù)以上分析可以知道該化合物結(jié)構(gòu)與已知化合物4的骨架相似，可以推測出該化合物的基本碳骨架為―CO―C-（＝CH―CH3）―CH2―C（＝CH2）―C（CH3，CH3COO）―CO―，再結(jié)合該化合物的分子式可以推斷該化合物結(jié)構(gòu)。

圖2 化合物3的2D-NMR耦合信息Fig.2 2D-NMR correlationsof compound 3

根據(jù)表1，C-2烯烴質(zhì)子（1H，d，J=6.8 Hz）可推測C-2和C-3之間的烯烴為Z型。根據(jù)以上的分析，可以知道該化合物的結(jié)構(gòu)如圖3所示，命名為順式-6-甲基-5-亞甲基-3-亞乙基-6-乙酰氧基己二酸。

圖3 化合物3結(jié)構(gòu)Fig.3 Structureof compound 3

3 結(jié) 論

綜合運(yùn)用多種現(xiàn)代色譜分離純化技術(shù)和波譜鑒定技術(shù)，從土田七中分離、鑒定出11個(gè)化合物，其中化合物3為新化合物順式-6-甲基-5-亞甲基-3-亞乙基-6-乙酰氧基己二酸，豐富了土田七植物的化學(xué)成分研究，為土田七植物的使用和開發(fā)提供參考。