新型鵝星狀病毒的分離鑒定與全基因序列分析

盧秀嫻，張思遠(yuǎn)*，梁昭平，林舉攀，馮盛春，黃 芬，潘俊斌

(1.廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司，廣東廣州 510300；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642)

鵝星狀病毒(Goose astrovirus，GoAstV)是近年危害我國養(yǎng)鵝業(yè)重要的病毒性傳染病病原之一[1]，主要感染3周齡以內(nèi)的雛鵝[2]。感染后鵝群發(fā)生高度致死性內(nèi)臟痛風(fēng)病，病死率可高達(dá)30%，該病的病原是由星狀病毒引起的(Astrovirus，AstV)，臨床病變主要以腎臟及腿部肌肉、關(guān)節(jié)覆蓋大量尿酸鹽沉積物為特征[3]。AstV屬于星狀病毒科，1975年被首次發(fā)現(xiàn)[4]，是一種無囊膜20面體的單股正鏈RNA病毒，廣泛存在于動(dòng)物群體中[5]。AstV的基因組全長(zhǎng)約6.1～7.9 kb，不同種星狀病毒之間序列變異較大，包括5′端未翻譯區(qū)(untranslation region，UTR)、3個(gè)開放性閱讀框(ORF1a、ORF1b和ORF2)、3′UTR及多聚腺苷酸(PolyA)尾[6]；不同種AstV之間存在基因重組現(xiàn)象，同源重組多發(fā)生于基因組ORF1b/ORF2交界區(qū)，該區(qū)域包含一個(gè)穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，是AstV同源重組的高發(fā)部位，但ORF1b區(qū)域同樣可以發(fā)生基因重組[7]。AstV基因組的高度變異使其對(duì)環(huán)境和宿主具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，甚至可跨種傳播，是威脅人類健康和動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病病原之一[8]。自2017年以來，我國部分地區(qū)養(yǎng)鵝場(chǎng)陸續(xù)有GoAstV感染的病例報(bào)道[9]，對(duì)鵝內(nèi)臟痛風(fēng)病致病原有重新的認(rèn)識(shí)并加強(qiáng)對(duì)GoAstV的重視。本試驗(yàn)從2019年山東某養(yǎng)鵝場(chǎng)雛鵝臨床上疑似由AstV引起鵝內(nèi)臟痛風(fēng)病的病料分離到1株病毒，通過鵝胚病變觀察、血凝性試驗(yàn)、病毒半數(shù)致死量測(cè)定、RT-PCR 檢測(cè)和基因組序列分析，以期了解該病毒的變異情況，為該病的防控及分子流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 為2019年山東某養(yǎng)鵝場(chǎng)雛鵝出現(xiàn)嚴(yán)重尿酸鹽沉積癥狀的肝臟、腎臟、腿肌等部位；100枚9日齡健康鵝胚、40只1日齡健康雛鵝購廣東清遠(yuǎn)市某鵝場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 核酸提取試劑盒，TIANLONG公司產(chǎn)品；2×EasyPfu PCR SuperMix (-dye)，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pMD19-T載體、DNA Marker DL 2 000，TaKaRa公司產(chǎn)品；核酸染料和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均，TIANGEN公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 全自動(dòng)樣品快速研磨儀，QIAGEN公司產(chǎn)品；小型高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR( C1000)儀 和電泳儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；核酸自動(dòng)提取儀和凝膠成像系統(tǒng)，Tanon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 將病料剪碎，與磷酸鹽緩沖液(PBS)按1∶1用全自動(dòng)樣品快速研磨儀進(jìn)行研磨成勻漿，將勻漿液置于冰箱-20℃反復(fù)凍融3次，離心后取上清液加入雙抗后除菌、分裝，于-70℃及以下保存。

1.2.2 病原傳代培養(yǎng) 除菌后病料上清液經(jīng)尿囊膜接種9日齡～11日齡鵝胚，0.2 mL/胚，每日觀察胚 死亡情況；收集接種后72 h～168 h死亡鵝胚，收獲胚液，繼續(xù)傳代至鵝胚規(guī)律性死亡為止，對(duì)收集的鵝胚尿囊液進(jìn)行血凝性檢測(cè)。病毒純化后增殖的病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋接種10日齡鵝胚各6枚，按Reed-Muench法計(jì)算ELD50。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè) 病料勻漿和傳代收獲的病毒液離心后取上清液，用核酸提取試劑盒提取病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別用以下6對(duì)病毒引物對(duì)病料上清液及收獲的胚液體進(jìn)行PCR檢測(cè)。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的基因序列，用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 PCR檢測(cè)引物

1.2.4 組織切片病理觀察 收取患鵝肝臟和腎臟固定于100 mL/L的多聚甲醛溶液浸泡48 h，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，觀察病理變化。

1.2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將40只1日齡健康雛鵝，隨機(jī)分為2組，攻毒組30只經(jīng)皮下接種病毒液，接種劑量0.2 mL/只；對(duì)照組10只以同樣的方式和劑量接種PBS。每日觀察雛鵝的臨床癥狀和死亡情況，死亡雛鵝立即剖檢觀察病變，觀察15日后處死剖檢2組雛鵝。

1.2.6 病毒基因組的擴(kuò)增及序列分析 參照文獻(xiàn)[10]新型GoAstV全部編碼區(qū)的特異性引物，將獲得的cDNA為模板，對(duì)分離毒株的基因組進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物送至金唯智有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果拼接后用Blast進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)用DNAStar與其他不同種屬星狀病毒進(jìn)行同源性分析，并用MGEA7.0構(gòu)建遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離

病料經(jīng)除菌處理后接種鵝胚并進(jìn)行傳代，接種鵝胚第1代未出現(xiàn)死亡，剖檢胚體可見鵝胚全身皮膚呈點(diǎn)狀出血(圖1)。傳至第3代，鵝胚出現(xiàn)死亡，死亡胚體充血明顯，剖檢胚體可見腹膜、腎臟、腿肌有尿酸鹽沉積。病毒不能凝集10 mL/L的雞紅細(xì)胞，ELD50為10-4.0/0.2 mL。

A.(1～3)胚體全身皮膚呈點(diǎn)狀出血；B.(1～3)胚體可見腹膜、腎臟、肝臟及腿肌有尿酸鹽沉積

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

用鵝星狀病毒特異性檢測(cè)引物對(duì)病料上清液和接種鵝胚后分離的胚液進(jìn)行RT-PCR鑒定，均能擴(kuò)增到大小約438 bp目的片段(圖2)，應(yīng)用其他5種病毒基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果為陰性,分離到的毒株命名為AstV/Goose/SD776/2019。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.陽性對(duì)照; 2.陰性對(duì)照; 3.胚液; 4.病料

2.3 組織切片病理觀察

組織病理學(xué)結(jié)果顯示,肝細(xì)胞腫脹、破裂，空泡變性；腎臟腎小管上皮細(xì)胞脫落，管腔內(nèi)充滿藍(lán)色尿酸鹽顆粒(圖3)。

C1.肝細(xì)胞腫脹、破裂；C2.肝細(xì)胞空泡變性；D1.腎臟腎小管上皮細(xì)胞脫落，D2.腎臟管腔內(nèi)充滿藍(lán)色尿酸鹽顆粒

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

攻毒組鵝在接毒的第5天開始出現(xiàn)精神萎靡，食欲減退等癥狀，攻毒后7 d～10 d出現(xiàn)部分鵝死亡，之后鵝群死亡率逐漸減低。剖檢死亡雛鵝，可復(fù)制出與臨床發(fā)病病例痛風(fēng)相似的癥狀，腎臟腫大，有尿酸鹽樣沉積物(圖4E1～E3)，部分感染雛鵝未死亡或未出現(xiàn)內(nèi)臟痛風(fēng)，但腎臟均表現(xiàn)發(fā)黃、腫脹(圖4F1～F3)。

E1～E3.腎臟腫大、充血，有尿酸鹽樣沉積物；F1～F3.腎臟發(fā)黃、腫脹

2.5 基因組序列分析

將該分離株AstV/Goose/SD776/2019各ORF基因序列與GenBank上已發(fā)表禽源星狀病毒和哺乳動(dòng)物星狀病毒基因序列進(jìn)行比對(duì)析，結(jié)果顯示，分離株的3個(gè)ORF和與近年報(bào)道的引起痛風(fēng)的新型GoAstV毒株(JSHA 、SD01、SDPY、GD)的核苷酸同源性和氨基酸同源性為99.2%以上；與能導(dǎo)致雛鵝腸炎的鵝星狀病毒(FLX)及其他種屬禽源星狀病毒同源性相對(duì)較低，全基因組序列同源性不高于70%，ORF1a、ORF1b、ORF2核苷酸序列同源性分別為44.9%～63.2%、57.2%～67.4%和41.0%～59.0% ，氨基酸序列同源性分別為26.8%～59.6%、52.1%～68.8%和26.5% ～57.3%，與哺乳動(dòng)物星狀病毒比對(duì)同源性最低，ORF1a、ORF1b、ORF2核苷酸序列同源性分別為34.5%～37.2%、46.5%～49.8%和33.3%～36.2%，氨基酸序列同源性分別為14.4%～16.9%、37.0%～38.4%和16.8%～19.6%。

全基因組核苷酸序列遺傳系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，分離株AstV/Goose/SD776/2019與近年報(bào)道的引起痛風(fēng)的GoAstV毒株(JSHA、SD01、SDPY、GD)聚成一個(gè)分支，遺傳距離較近；與其他禽星狀病毒形成了獨(dú)立的進(jìn)化支遺傳距離較遠(yuǎn)就(圖5)；表明分離毒株屬于新型鵝星狀病毒。

▲本試驗(yàn)分離毒 ▲The virus strain isolated in this experiment

3 討論

GoAstV主要攻擊腎臟上皮細(xì)胞，致使腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷，進(jìn)而影響尿酸的排泄，導(dǎo)致尿酸鹽沉積造成痛風(fēng)[11-12]。造成鵝痛風(fēng)的原因較多，各種內(nèi)、外源性因素均會(huì)導(dǎo)致血液中尿酸水平升高[13]，比如高蛋白飼料引發(fā)的蛋白質(zhì)代謝障礙和腎臟損傷，磺胺類藥物引起的中毒和腎臟損傷等[14]，都會(huì)極易造成誤診，因此需要注意與新型鵝星狀病毒引起的痛風(fēng)病鑒別診斷。

本試驗(yàn)通過PCR分段擴(kuò)增獲得了分離株編碼區(qū)3個(gè)ORF的基因序列，結(jié)果顯示ORF1a與ORF1b之間含有19 nt核苷酸的重疊區(qū)域，該區(qū)域參與核糖體移位信號(hào)的形成，這與其他星狀病毒一致，與已報(bào)道的SD01株高度同源，未出現(xiàn)核苷酸的缺失或插入及基因重組現(xiàn)象?；蛐蛄斜葘?duì)分析結(jié)果表明，分離株AstV/Goose/SD776/2019與近年報(bào)道的引起痛風(fēng)的新型GoAStv毒株(JSHA、SD01、SDPY、GD) 的核苷酸和氨基酸同源性較高，遺傳進(jìn)化分析結(jié)果同樣顯示其與4株新型鵝星狀病毒同屬于一個(gè)分支。新型GoAStv國內(nèi)毒株(JSHA 、SD01、SDPY、GD) 的全基因組序列先后被測(cè)定，對(duì)其進(jìn)行分子水平上的流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的依據(jù)，也為疫苗的研制與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。相關(guān)研究表明，基因組序列的差異可能會(huì)影響RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而改變病毒與宿主的親和力，從而影響病毒的致病性和毒力[15]?；谶@些研究可以推測(cè)，基因組序列的差異可能是導(dǎo)新型星狀病毒的致病性與其他禽類星狀病毒致病性存在顯著差異的原因之一。