大黃對(duì)小鼠水通道蛋白3、4及血管活性腸肽的影響

包佳鷺，趙 偉，路一璇，何 欣,3，劉海隆

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001； 2.淶水縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局， 河北淶水 074119；3.河北省中獸藥工程技術(shù)中心，河北清苑 071100；4.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，海南?？?571100)

大黃(RheumpalmatumL.)是蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根和根莖，性寒,味苦，歸大腸經(jīng)，是我國傳統(tǒng)四大中藥之一，具有瀉下攻積、清熱解毒、活血化淤的功效[1]，常用于治療大便秘結(jié)、牙齦腫痛、口舌生瘡等各種常見病。大黃的主要作用部位在大腸，其重要活性成分結(jié)合蒽醌在大腸內(nèi)細(xì)菌酶的作用下還原為游離蒽醌苷，刺激腸道導(dǎo)致腹瀉[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃具有瀉下、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、消炎、利膽保肝、活血等多種作用[3]。大黃因其強(qiáng)大的瀉下功能，不僅在便秘治療上具有良好的療效，同時(shí)也被廣泛用于腹瀉模型建立中。本試驗(yàn)通過檢測(cè)血清及結(jié)腸組織中水通道蛋白3、水通道蛋白4和血管活性腸肽的表達(dá)情況，探究大黃致腹瀉的主要機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 昆明小鼠[SCXK(京)2016-0002]40只，雌雄各半，購于斯貝福 (北京) 生物技術(shù)有限公司；大黃，購自河北安國中藥材市場(chǎng)。

1.1.2 試劑與儀器 AQP3抗體、AQP4抗體、VIP抗體、多聚體抗兔/小鼠IgG-HRP、DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品；AQP3、AQP4 ELISA試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司產(chǎn)品；Mark 酶標(biāo)儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；KD-BM Ⅲ 組織包埋機(jī)，KEDEE公司產(chǎn)品；KD-2508切片機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；CK X41倒置生物顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；SOP分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大黃混懸液的制備 將大黃粉碎，過200目篩，臨用前用60℃溫水配制成所需濃度的混懸液。

1.2.2 給藥方法 將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。空白對(duì)照組(A組)和大黃混懸液組(B、C、D組)，大黃組分別灌胃給予不同濃度的大黃混懸液(B組1 g/kg、C組2 g/kg、D組4 g/kg)，空白對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃5 d，給藥前和給藥后分別記錄小鼠體重，每天記錄采食量和腹瀉情況。給藥結(jié)束后眼眶靜脈采血，脫頸椎處死小鼠，摘取結(jié)腸組織，一部分用40 mL/L多聚甲醛固定，一部分于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取部分固定結(jié)腸組織常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，常規(guī)HE染色，再經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 ELISA檢測(cè)AQP3、AQP4含量 小鼠眼眶靜脈采血，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中AQP3、AQP4含量。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸中AQP3、AQP4、VIP表達(dá)量 取部分固定結(jié)腸組織常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，30 mL/L過氧化氫孵育，山羊血清封閉，滴加一抗，4℃過夜，次日滴加二抗，DAB顯色后滴加終止液，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。用Image-Pro Plus軟件對(duì)AQP3、AQP4、VIP的表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.2.6 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸中AQP3、AQP4和VIP表達(dá)量 取-80℃保存的結(jié)腸組織勻漿，進(jìn)行總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR采用兩步法，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序?yàn)椋?5℃ 10 s,65℃ 60 s，以0.2℃/s的速度升溫至97℃，最后37℃ 30 s冷卻(表1)。

表1 熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 大黃給藥前后小鼠體重變化

給藥前各組小鼠體重?zé)o明顯差異，給藥后C組和D組小鼠體重顯著低于A組 (P<0.05)。小鼠采食量隨給藥劑量的增加而不斷減少。給藥2.5 h后小鼠開始陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉癥狀，隨給藥劑量的增加，腹瀉程度逐漸加劇，腹瀉率增加。其中B組腹瀉率為90%，C組和D組腹瀉率均為100%(圖1)。

2.2 ELISA檢測(cè)大黃致瀉小鼠血清中AQP3和AQP4變化

灌服不同劑量的大黃混懸液后，小鼠血清中AQP3和AQP4含量逐漸降低。C組和D組血清中AQP3和AQP4含量與A組相比顯著降低(P<0.05)，B組與A組、C組和D組無顯著差異(P>0.05)(表2)。

“*”代表與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05) "*" Represents significant difference from the blank control group(P<0.05)

2.3 大黃致瀉小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察

各組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，黏膜完整，未見增生，萎縮，壞死等病理變化，杯狀細(xì)胞，隱窩，腺體結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，均未見明顯變化(圖3)。

2.4 大黃腹瀉模型小鼠結(jié)腸免疫組化結(jié)果

灌服不同劑量的大黃混懸液后，小鼠結(jié)腸中AQP3、AQP4和VIP的表達(dá)量均有所下降，且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì)。C組和D組結(jié)腸中AQP3表達(dá)量顯著低于A組，A、B組間無顯著差異(P>0.05)。C組和D組結(jié)腸中AQP4表達(dá)量顯著低于A組，且D組AQP4表達(dá)量與C組相比顯著降低(P<0.05)，A、B組間無顯著差異(P>0.05)。C、D組結(jié)腸中VIP表達(dá)量顯著低于A、B組，A組和B組、C組和D組間差異不顯著(P>0.05)。

2.5 大黃腹瀉模型小鼠結(jié)腸AQP3、AQP4和VIP的RT-qPCR結(jié)果

小鼠灌服不同劑量的大黃混懸液后，AQP3、AQP4和VIP的mRNA表達(dá)量均有所減少。大黃組結(jié)腸AQP3 mRNA與空白對(duì)照組相比表達(dá)量下調(diào)，其中2 g/kg組、4 g/kg組AQP3 mRNA顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，且2個(gè)試驗(yàn)組之間無顯著差異(P>0.05)，1 g/kg組與空白對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。各大黃組結(jié)腸AQP4 mRNA與空白對(duì)照組相比均顯著下調(diào)，且各組之間差異顯著(P<0.05)。各大黃組結(jié)腸VIP mRNA與空白對(duì)照組相比均顯著下調(diào)，其中2 g/kg組、4 g/kg組VIP mRNA顯著低于1g/kg組(P<0.05)，4 g/kg組與2 g/kg組無顯著差異(P>0.05)。

表2 大黃腹瀉小鼠AQP3、AQP4變化結(jié)果

表3 大黃致瀉小鼠結(jié)腸AQP3、AQP4和VIP表達(dá)量

A.空白對(duì)照組;B.1 g/kg組;C.2 g/kg組;D.4 g/kg組(HE×400)A.Blank control group;B.1 g/kg group;C.2 g/kg group;D.4 g/kg group(HE×400)

A.空白對(duì)照組;B.1 g/kg組;C.2 g/kg組;D.4 g/kg組,箭頭為AQP3陽性表達(dá)A.Blank control group;B.1 g/kg group;C.2 g/kg group;D.4 g/kg group,arrow indicates AQP3 positive expression

3 討論

大黃性味苦寒，歸于大腸經(jīng)，能夠清熱瀉火，除煩止渴[4]，主要用于實(shí)熱便秘，積滯腹痛，瀉痢不爽[5]，大黃瀉下的主要作用部位在結(jié)腸[6]。結(jié)腸在維持機(jī)體體液和電解質(zhì)平衡中起著重要的作用，正常情況下結(jié)腸上皮每天吸收1.5 L～2 L水產(chǎn)生脫水糞便[7]，結(jié)腸上皮水運(yùn)輸是通過細(xì)胞旁路和跨細(xì)胞通路來完成的，跨細(xì)胞通路又包括自由擴(kuò)散和協(xié)助擴(kuò)散(即水通道擴(kuò)散)兩種方式[8]。

A.空白對(duì)照組;B.1 g/kg組;C.2 g/kg組;D.4 g/kg組,箭頭為AQP4陽性表達(dá)A.Blank control group;B.1 g/kg group;C.2 g/kg group;D.4 g/kg group,arrow indicates AQP4 positive expression

A.空白對(duì)照組;B.1 g/kg組;C.2 g/kg組;D.4 g/kg組,箭頭為VIP陽性表達(dá)A.Blank control group;B.1 g/kg group;C.2 g/kg group;D.4 g/kg group,arrow indicates VIP positive expression

“*”代表與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)

水通道蛋白(AQPs)是幾乎所有物種(包括病毒)中存在的跨膜蛋白家族,可選擇性地將水或其他小分子物質(zhì)運(yùn)輸?shù)缴锬ど蟍9]。研究證實(shí)AQPs廣泛分布于腸道中[10]，在腸道通透性和液體的分泌與吸收中發(fā)揮重要作用，在腸道水液代謝中有著重要意義[11]。AQP3 是結(jié)腸吸收水分的重要通道，有研究表明AQP3在結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞質(zhì)膜上高度表達(dá)[12]，其表達(dá)量水平與結(jié)腸對(duì)水的吸收功能密切相關(guān)，AQP3可控制水從腸道向血液傳送，以此來調(diào)節(jié)糞便的含水量[13]。AQP3的低表達(dá)會(huì)影響水分從腸腔到腸壁的轉(zhuǎn)運(yùn)，使結(jié)腸對(duì)水的重吸收障礙，因此導(dǎo)致腹瀉[14]。除AQP3外，AQP4是在結(jié)腸黏膜表達(dá)較高的水通道蛋白，可促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞對(duì)水的重吸收[15]。研究顯示，5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的腹瀉小鼠結(jié)腸中AQP4的基因表達(dá)水平顯著下降，從而導(dǎo)致小鼠體重減輕和腹瀉[16]。研究表明，輪狀病毒腹瀉小鼠結(jié)腸AQP4表達(dá)量顯著降低，證實(shí)AQP4在腹瀉中起重要作用[17]。本試驗(yàn)研究顯示,大黃會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸中AQP3和AQP4表達(dá)量下調(diào)，從而使結(jié)腸對(duì)水的吸收減少，使糞便含水量增加，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉。

VIP是腸道肌間神經(jīng)從中的抑制性神經(jīng)元遞質(zhì),主要集中在結(jié)腸壁的平滑肌層[18]，在腸道蠕動(dòng)時(shí)參與下行性松弛，主要起調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)的作用。研究表明，VIP與受體結(jié)合后可活化蛋白激酶A，引起平滑肌超極化，使結(jié)腸運(yùn)動(dòng)減慢[19]。VIP表達(dá)量的降低可使腸道動(dòng)力和分泌功能紊亂，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生腹瀉。研究發(fā)現(xiàn)脾虛大鼠結(jié)腸VIP含量顯著下降，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致[20]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),大黃可降低結(jié)腸組織中 VIP 的含量，通過降低VIP的含量對(duì)結(jié)腸平滑肌的蠕動(dòng)產(chǎn)生影響，增強(qiáng)腸蠕動(dòng)力，促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,大黃可導(dǎo)致血清和結(jié)腸中AQP3和AQP4表達(dá)量下降，使腸道內(nèi)水分增多，同時(shí)結(jié)腸中VIP表達(dá)量下降，腸蠕動(dòng)加快，從而導(dǎo)致排便增加，引起腹瀉 。