抗傳染性支氣管炎病毒S1蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

李佳楠，杜 林，周景明，祁艷華，馬 強，張改平，王愛萍*

(1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450001；2. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)是嚴重危害家禽業(yè)的一種高度傳染性病原體，易感染呼吸道，也可引起禽類腎臟和生殖道疾病[1]。IBV是一種單股正鏈RNA病毒，基因組全長約27 kb，主要編碼參與病毒復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白、3種主要的結(jié)構(gòu)蛋白(S糖蛋白，E蛋白，M蛋白)和參與基因組包裝的N蛋白[2]。S糖蛋白由S1和S2亞基組成，S1亞基含有受體結(jié)合域，負責(zé)病毒附著宿主細胞并能刺激宿主產(chǎn)生中和抗體，因此S1蛋白被認為是最為重要的結(jié)構(gòu)蛋白[3]。由于病毒重組和宿主選擇壓力使S1蛋白突變較高率[4]，導(dǎo)致IBV不斷產(chǎn)生變異從而出現(xiàn)新的血清型和基因型[5-6]，給雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis,IB)的診斷和預(yù)防帶來困難。

S1蛋白結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜，為研究S1蛋白帶來一定阻礙，利用基因工程技術(shù)獲得S1蛋白相對容易。目前，國內(nèi)外許多學(xué)者以桿狀病毒、腺病毒和哺乳動物細胞系等真核表達系統(tǒng)成功表達獲得了S1蛋白[7-8]，但由于表達量低和糖基化不完全等原因不利于S1蛋白的大量獲得。鄒年莉等[9]截取S1蛋白一段抗原區(qū)(81-422aa)進行原核表達，并制備了抗IBV S1蛋白的單克隆抗體。本研究通過分析S1蛋白的結(jié)構(gòu)，選擇抗原性高、親水性好且包含潛在受體結(jié)合位點的一段抗原區(qū)(241-414aa)進行表達，獲得重組S1蛋白并制備針對IBV S1蛋白的單克隆抗體，以期為IB的診斷、IBV快速檢測方法的建立和S1蛋白結(jié)構(gòu)功能的研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、質(zhì)粒和細胞 IBV M41毒株購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，質(zhì)粒pET-28a，宿主菌BL21(DE3)、DH5α和SP2/0細胞為鄭州大學(xué)分子免疫學(xué)實驗室保存。

1.1.2 主要試劑BamHⅠ、XholⅠ限制性內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶等為Takara公司產(chǎn)品；Goat Anti-mouse IgG/HRP、Goat Anti-Chiken IgG/HRP為北京博奧森生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(C1000TM)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；分析天平(TP-214)為美國Denver公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(imarkTM)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；分光光度計(NanoDrop 2000c)為美國 Thermo 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上公布的IBV M41毒株(登錄號：AY561711.1)S1基因序列(241-414aa)設(shè)計引物S1-F和S1-R，分別在上游引物和下游引物5′端引入BamHⅠ和XholⅠ限制性酶切位點(下劃線部分)，S1-F序列：5′-CGCGGATCCAAAGGTGTTTATTCAGGTG-3′，S1-R序列：5′-CCGCTCGAGTTATCTAAAACGACGTGTT-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 RT-PCR擴增S1基因 無菌提取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行目的基因S1的擴增，PCR擴增程序為：98℃ 10 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s；共30個循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進行鑒定并純化回收。

1.2.3 重組原核表達載體的構(gòu)建 將S1基因與pET-28a載體分別用BamHⅠ和XholⅠ進行雙酶切并純化回收，連接后轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單菌落擴大培養(yǎng)后進行菌液PCR驗證，并送公司測序。

1.2.4 重組S1蛋白的誘導(dǎo)表達 用測序結(jié)果正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，并采用菌液PCR和雙酶切方法進行鑒定。將鑒定正確的菌液在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600nm值達0.6～0.8時，加入1 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)表達。

1.2.5 重組S1蛋白表達形式分析 將誘導(dǎo)表達的菌液4℃、6 000 r/min離心10 min，去掉培養(yǎng)基，用 1×PBS溶液重懸菌體。超聲破碎15 min，4℃、12 000 r/min離心20 min，分離上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組S1蛋白純化 將超聲破碎離心后沉淀用0.1倍體積的含有100 mmol/L EDTA和100 ml/L TritonX-100、pH 7.5的Tris-HCl重懸。離心棄上清，沉淀用20 g/L十二烷基肌氨酸鈉溶解，室溫孵育15 min，用pH 8.5的1 mol/L Tris-HCl進行透析復(fù)性。

1.2.7 重組S1蛋白Western blot鑒定 將純化的重組S1蛋白進行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用50 g/L脫脂奶粉37℃封閉2 h，PBS'T洗膜3次，加入抗IBV M41毒株雞陽性血清室溫孵育1 h，PBS'T洗膜3次，加入1∶5 000稀釋的羊抗雞IgG/HRP，室溫孵育1 h，PBS'T洗膜5次，AEC顯色液進行顯色觀察。

1.2.8 小鼠免疫 用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定重組S1蛋白濃度，每只小鼠免疫30 μg重組蛋白，每2周免疫1次，共免疫3次，細胞融合前3 d天進行加強免疫。

1.2.9 細胞融合與單克隆抗體的篩選 取血清效價高的小鼠脾細胞進行融合，并采用有限稀釋法進行3～4輪亞克隆，通過間接ELISA方法對雜交瘤細胞進行篩選，小鼠體內(nèi)誘生腹水并用辛酸-硫酸銨方法進行腹水純化。

1.2.10 單克隆抗效價及親和力測定 以重組S1蛋白為包被原，采用間接ELISA方法測定純化后腹水單抗效價，并根據(jù)以下方法計算單抗親和力：Kaff=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)，其中，n=[Ag]t/[Ag′]t，[Ag]t、[Ag′]t分別代表2個不同包被濃度，[Ab′]t、[Ab]t分別代表各包被濃度下50% OD450nm值所對應(yīng)的摩爾濃度。

1.2.11 免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA) 將原代雞胚腎細胞培養(yǎng)至80%～90%融合度，接種IBV M41毒株，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將細胞進行固定，加入單克隆抗體或者陽性雞血清于37℃孵育1 h，PBS洗3次，再加入羊抗鼠-HRP或羊抗雞-HRP室溫孵育1 h，PBS洗5次，AEC顯色液進行顯色并在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 S1基因的擴增

以IBV M41毒株的cDNA為模板，S1-F、S1-R為引物，對目的基因S1進行PCR擴增，擴增出大小為519 bp的單一條帶(圖1)，該條帶符合預(yù)期目的基因S1條帶大小。

1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 2.S1基因; 3.NC1.DNA Marker DL 2 000; 2.S1 gene; 3.NC

2.2 pET-28a-S1重組載體的鑒定

提取重組質(zhì)粒并用作模板，用T7通用型引物進行菌液PCR，擴增出大小為750 bp的條帶(圖2)，與預(yù)期條帶大小一致。

1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 2～4.重組載體; 5.NC1.DNA Marker DL 2 000; 2-4.Recombinant plasmid; 5.NC

2.3 重組S1蛋白的表達和表達形式分析

對超聲破碎后的上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，與空載菌相比較，重組菌誘導(dǎo)后在約20 ku位置出現(xiàn)重組S1蛋白，與預(yù)期大小一致；重組S1蛋白主要以包涵體形式表達(圖3)。

1.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 2.誘導(dǎo)前；3.誘導(dǎo)后；4.超聲上清；5.超聲沉淀；

2.4 重組S1蛋白的純化及Western blot鑒定

S1蛋白經(jīng)變性-復(fù)性過程后，以可溶形式存在(圖4)，經(jīng)Western blot鑒定，可見表達的S1蛋白可與陽性血清反應(yīng)(圖5)。

1.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 2～3.復(fù)性后S1蛋白1.Protein molecular weight Marker; 2-3.S1 protein

1.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 2.重組S1蛋白1.Protein molecular weight Marker; 2.Recombinant S1 protein

2.5 單克隆抗體的鑒定

經(jīng)3次亞克隆后，篩選出能穩(wěn)定分泌抗IBV S1蛋白單克隆抗體的3D9細胞株，通過小鼠體內(nèi)誘生腹水并純化單克隆抗體，用間接ELISA方法測得純化腹水中單克隆抗體效價可達1∶2.56×105(圖6)，計算單克隆抗體的親和力為2.01×109L/mol。

圖6 單克隆抗體效價圖

2.6 免疫過氧化物酶單層細胞試驗

IPMA結(jié)果顯示，陽性雞血清和單克隆抗體3D9均可以與IBV M41毒株反應(yīng)(圖7)，表明單抗3D9可以用來檢測IBV。

3 討論

S1蛋白位于IBV粒子的表面，是所有結(jié)構(gòu)蛋白中最重要的抗原蛋白[10]，不僅能誘導(dǎo)血凝抑制抗體和中和抗體的產(chǎn)生，還可以引起細胞毒性T細胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)[11-12]。用原核表達系統(tǒng)將S1基因分為A(N端)、B(C端)兩段分別進行表達，結(jié)果表明C末端的免疫原性高于N端。S1蛋白上有6個抗原決定簇(S1A-S1F)，其中一個為291-398aa(S1ABC)，其可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和性抗體。將S1蛋白分為N端(S1-NTD:21-237aa)和C端(S1-CTD:269-414aa)分別進行研究，結(jié)果表明S1 C端上存在受體結(jié)合位點[13]。本研究根據(jù)S1蛋白的抗原性、親水性、抗原決定簇以及文獻報道，確定將S1蛋白C端的抗原區(qū)進行表達，表達量較高并且重組S1蛋白不含較大標(biāo)簽。融合蛋白以包涵體形式存在，這可能與S1基因內(nèi)含有許多大腸埃希氏菌的稀有密碼子有關(guān)，也與S1蛋白本身存在許多疏水區(qū)有關(guān)。純化S1蛋白用N-十二烷基肌氨酸鈉進行溶解后再復(fù)性，重組S1蛋白損失較少且復(fù)性完全從而獲得重組S1蛋白，此方法簡單易操作、耗時短且節(jié)約成本。純化S1蛋白先選用尿素進行變復(fù)性，但蛋白損失嚴重且復(fù)性不完全，用N-十二烷基肌氨酸鈉進行溶解從而獲得重組S1蛋白，此方法簡單易操作、耗時短且節(jié)約成本。在篩選單抗時，采用間接ELISA方法確定陽性雜交瘤細胞，重組S1蛋白為包被原并用其他無關(guān)蛋白做陰性對照，既方便快捷又盡可能排除非特異性反應(yīng)。

圖7 抗IBV單克隆抗體的IPMA檢測結(jié)果(100×)

本研究成功獲得了重組IBV S1蛋白并制備了抗IBV M41 S1蛋白的單克隆抗體，IPMA結(jié)果表明，制備的單抗可與IBV結(jié)合，為IB的診斷和IBV快速檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。