豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型二重熒光LAMP檢測方法的建立

謝志勤，張民秀，謝芝勛，范 晴，羅思思，謝麗基，黃嬌玲，王 盛，曾婷婷，張艷芳，李 孟，李 丹，鄧顯文，劉加波

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西南寧 530001)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起豬的一種急性和高度接觸傳染性疾病，以稽留高熱、皮下出血、脾梗死等為特征，病死率高。 我國對CSF采取了很多嚴格的防疫措施,有效地控制了豬瘟的廣泛流行,但是該病在我國以及世界許多養(yǎng)豬國家依然存在[1]。豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)是由豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)引起的豬一種傳染病，以早期淋巴結(jié)腫大，食欲不振，呼吸困難，腹瀉，早產(chǎn)及死胎等為特征，發(fā)病率和病死率較高[2-4]。

近年由CSFV和PCV2共同感染引發(fā)豬病的報道較多[5-7]。原因是PCV2感染率高，導致一些豬場出現(xiàn)CSF免疫失敗，從而引發(fā)PCV2感染的同時感染CSFV，臨床表現(xiàn)為體溫升高、急性死亡、懷孕母豬流產(chǎn)或死胎等，根據(jù)臨床癥狀很難做出判斷，需要借助實驗室手段進行確診。常用的實驗室方法很多[8-14]。本研究分別在CSFV和PCV2特異性引物上標記不同的熒光基團和淬滅基團，經(jīng)LAMP反應后，標識在CSFV和PCV2序列上的不同熒光基團斷裂而游離，在特定的熒光通道下，游離的不同熒光基團發(fā)出不同的顏色，根據(jù)不同顏色一次反應能同時鑒別CSFV和PCV2。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 LAMP試劑盒(批號8Y007)，榮研生物科技(中國)有限公司產(chǎn)品；Bst3.0 DNA/RNA聚合酶，NEB公司產(chǎn)品；RNA/DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；全血RNA提取試劑盒(貨號：51025)，百代生物公司產(chǎn)品；premixTaqPCR試劑盒、PMD-20T載體，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 Loopamp實時濁度儀，日本榮研公司產(chǎn)品；核酸測定儀，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；多色熒光成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗用毒株 豬瘟病毒石門株(F114)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，本實驗室保存；豬瘟兔化弱毒株(C株)，廣西麗原生物股份有限公司提供；豬瘟病毒地方分離株：N 株/1986、B 株/1987、L 株/1988、 GXH-2/2000，廣西獸醫(yī)研究所分離鑒定并保存；豬圓環(huán)病毒2型BH5株，廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所保存；豬口蹄疫O型滅活疫苗毒株，購自中國農(nóng)業(yè)科學院自蘭州獸醫(yī)研究所；牛病毒性腹瀉病毒Orevgon C24V株(BVDV Orevgon C24V)，購自中國獸藥監(jiān)察所；豬呼吸與繁殖綜合征病毒( CH-1R株，美洲型)，購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；豬細小病毒 (PPV)、日本腦炎病毒(JEV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬布魯氏菌2號(BS2)、豬鏈球菌2型(SS2)，廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針設計 根據(jù)GenBank中收錄的豬瘟病毒毒株E2基因(登錄號：MK124646.1)和豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因(登錄號：KY947578.1)序列保守區(qū)域，通過MEGA 5.0在線比對分析，然后用Primer premier 5.0和Primer explore V4軟件分別設計了2套用于LAMP特異性擴增的引物及探針。特異性引物包括外引物F3和B3，內(nèi)引物FIP(FIP=F1c+F2)和BIP(BIP=B1c+B2)，探針1條。設計的探針序列介于F1c和B1c之間，在探針的兩端分別標記熒光基團和淬滅基團。CSFV-Probe探針的5′端標記熒光基團FAM，3′端標記了淬滅基團BHQ1，該基團在520 nm波長下發(fā)綠色光。PCV-Probe 5′端標記熒光基團Cy5.5，3′端標記淬滅基團BHQ2，該基團在690 nm波長下發(fā)紅色光。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,HPLC級純化(表1)，引物位置示意圖見圖1。

1.2.2 病原核酸提取 按照RNA/DNA提取試劑盒說明書要求步驟進行病原核酸的提取，首先吸取250 μL 病毒液或經(jīng)處理的臨床樣品上清液放到1.5 mL離心管中，加入病毒裂解液200 μL混合，然后按步驟進行病原RNA/DNA提取，最后加TE洗脫緩沖液25 μL離心洗脫RNA/DNA，分裝，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 二重LAMP的引物序列

1.2.3 標準模板的制備 將提取的CSFV C株RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用CSFV外引物(CSFV-B3，CSFV-F3)擴增反轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板，擴增產(chǎn)物片斷大小約為224 bp。同樣，用PCV外引物(PCV-F3，PCV-B3)擴增PCV2 BH5的DNA模板，擴增產(chǎn)物片斷大小約為324 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，與PMD-20T載體連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定重組菌，用質(zhì)粒小量試劑盒提取培養(yǎng)的陽性重組菌中的質(zhì)粒。用Nano drop 2000測定提取質(zhì)粒的濃度。按公式計算換為拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(copies/μL)=6.02×1023/660×3 000×10-9×質(zhì)粒濃度(g/μL)。將等量的2種模板按不同濃度進行配比或按梯度進行稀釋，制備標準模板保存于-70℃?zhèn)溆没蛑苯討谩?/p>

1.2.4 二重熒光LAMP反應的建立 將制備的CSFV C株和PCV2 BH5標準質(zhì)粒，按不同的濃度進行配比混合，然后加入二重熒光LAMP反應體系，并對反應體系中引物濃度、探針濃度及退火延伸溫度范圍進行優(yōu)化，優(yōu)化的引物濃度、探針濃度及溫度范圍如下：內(nèi)引物5 pmoL/μL～60 pmoL/μL，外引物1 pmoL/μL～20 pmoL/μL，探針0.1 pmoL/μL～1 pmoL/μL，退火和延伸溫度范圍60℃～68℃。

1.2.5 LAMP結(jié)果判定 將反應產(chǎn)物取出，置多色熒光成像分析系統(tǒng)中，選擇520 nm和690 nm熒光通道下顯色，在520 nm熒光通道下含有陽性對照的CSFV樣品呈綠色，PCV2樣品和對照樣品為無色，在690 nm熒光通道下含有陽性對照的PCV2樣品呈紅色，CSFV和對照樣品為無色，在520 nm和690 nm共同熒光通道下，有CSFV無PCV的樣品呈綠色，有PCV無CSFV的樣品呈紅色，同時含有CSFV和PCV的樣品呈黃色，對照樣品為無色。在標準陽性和陰性樣品成立的情況下，根據(jù)顏色判斷樣品檢測結(jié)果，結(jié)果直觀準確，容易判斷。

圖1 CSFV和PCV2 引物設計位置示意圖

1.2.6 二重熒光LAMP特異性測試 提取CSFV F114、CSFV C、CSFV N/1986、CSFV B/1987、CSFV L/1988、CSFV GXH-2/2000的RNA和PCV2 BH5 的DNA。同時提取對照毒株P(guān)RRSV CH-1R、FMDV O型、BVDV Orevgon C24V、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的核酸，并測定其濃度，用建立的方法對這些病原核酸進行二重熒光LAMP擴增檢測，驗證本方法的特異性。

1.2.7 二重熒光LAMP敏感性和干擾性測試 將制備的CSFV C毒株和PCV2 BH5毒株的質(zhì)粒標準模板測定濃度，根據(jù)濃度換算為拷貝數(shù)，然后作10倍梯度稀釋，稀釋范圍為1×107～1拷貝/μL，將各梯度相同拷貝濃度的CSFV和PCV核酸等體積混合，利用本試驗建立的二重熒光LAMP方法對CSFV和PCV混合模板進行測試，檢驗本方法的最低檢出的拷貝數(shù)。同樣，將不同拷貝濃度的CSFV和PCV核酸交叉兩兩等體積混合，利用本試驗建立的二重熒光LAMP方法對CSFV和PCV混合模板進行測試，檢驗不同的模板濃度對本方法的干擾性。

1.2.8 臨床樣品檢測驗證 采集廣西不同地區(qū)不同豬場患病豬的樣品112份，包括豬全血59份、肺組織21份和淋巴結(jié)32份。

1.2.8.1 提取肺組織及淋巴結(jié)組織中病毒核酸 取適量的肺組織、淋巴結(jié)分別進行研磨，按1∶5加入滅菌的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)繼續(xù)研磨勻漿，吸取1.5 mL勻漿放入到2 mL EP管中，置-70℃反復凍融 3次，8 000 r/min離心5 min，吸取上清液250 μL按RNA/DNA提取試劑盒提取核酸。

1.2.8.2 提取豬全血中病毒的核酸 取豬全血100 μL，按全血RNA提取試劑盒說明書中步驟提取核酸。將提取的核酸反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用本試驗建立的二重熒光LAMP進行擴增檢測，同時用已建立的CSFV和PCV熒光定量PCR方法作為對比檢測,對擴增陽性的產(chǎn)物送生物公司進行測序，以驗證本方法建立的二重熒光LAMP的準確性。

2 結(jié)果

2.1 二重LAMP方法的建立

將制備的CSFV C和PCV2 BH5標準質(zhì)粒加入到二重熒光LAMP反應，反應體系為25 μL，經(jīng)優(yōu)化后的最佳反應試劑如下：2×LAMP buffer 12.5 μL，Bst3.0 DNA/RNA 聚合酶320 U，40 pmol/μL內(nèi)引物CSFV-FIP、CSFV-BIP、PCV-FIP和PCV-BIP各1 μL(工作終濃度1.6 pmol)，5 pmol外引物CSFV-F3、CSFV-B3、PCV-B3和PCV-F3各1 μL(工作終濃度0.2 pmol)，0.5 pmoL探針CSFV-Probe和PCV-Probe各1 μL(工作終濃度0.02 pmol)，cDNA或DNA模板2 μL，用滅菌超純水補足25 μL。將各試劑輕輕混合，置Loopamp實時濁度儀或恒溫水浴鍋。經(jīng)優(yōu)化后最佳的退火延伸溫度為62℃ 90 min，85℃ 5 min結(jié)束反應，結(jié)果見圖2。 圖2中A中含有CSFV品的1、2、4管呈綠色，含PCV2、 對照水及PRRSV CH1R的3、5、6管無顏色。圖2B中含有PCV2 BH5樣品的3～4管呈紅色，含CSFV、對照水及PRRSV的1、2、5、6管呈無顏色。圖2C中含有CSFV樣品的1～2管呈綠色，含有PCV2 BH5樣品的3管呈紅色，同時含有CSFV C和PCV2 BH5樣品的4管呈黃色，含有對照水及PRRSV CH1R的5管和6管呈無顏色。

A.520 nm；B.690 nm；C.520 nm和690 nm；1.CSFV F114;2.CSFV C株;3.PCV2 BH5;4.CSFV C+PCV2 BH5;5.對照;6.PRRSV CH1R

2.2 特異性測試結(jié)果

用建立的方法對CSFV和PCV2及對照毒株進行擴增。本方法只能擴增CSFV F114、CSFV C、CSFV N/1986、CSFV B/1987、CSFV L/1988、CSFV GXH-2/2000和PCV2 BH5毒株并顯色，對照毒株P(guān)RRSV CH-1R、FMDV O型、BVDV Orevgon C24V、PPV、JEV、PRV、B.sius沒有呈現(xiàn)任何顏色，即對照毒株沒有擴增，毒株間沒有交叉顏色出現(xiàn)，特異性良好，結(jié)果見圖3。圖3A中含CSFV的2、4～8管呈綠色，含PCV2 BH5、水、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的1、3、9～16管呈無顏色。圖3B中含PCV2 BH5樣品的1、4～8管呈紅色，含CSFV、水、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的2、3、9～16管呈無顏色。圖3C中含PCV2 BH5樣品的1呈紅色，含CSFV樣品的2管呈綠色，同時含有CSFV和PCV2 BH5樣品的4～8管呈黃色，水、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的3、9～16管呈無顏色。

2.3 敏感性測試結(jié)果

用本方法對制備的標準模板濃度分別為1×107～100拷貝/L進行檢測，結(jié)果本方法最低檢出100拷貝/L的CSFV和PCV2混合模板，結(jié)果見圖4。圖4中1～8管分別為107～100拷貝/L的CSFV和PCV2混合模板標準品。圖4A中1～6管呈綠色，7～8管呈無色。圖4B中1～6管呈紅色，7～8管呈無色。圖4C中1～6管呈黃色，7～8管呈無色。

A.520 nm；B.690 nm；C.520 nm和690 nm；1.PCV2 BH5;2.CSFV石門株;3.對照;4.CSFV C+PCV2 BH5;5.CSFV N+PCV2 BH5;6.CSFV B+PCV2 BH5;7.CSFV L+PCV2 BH5;8.CSFV GXH-2+PCV2 BH5;9.FMDV O型;10.BVDV Orevgon C24V;11.PPV;12.JEV;13.PRRSV CH1R;14.PRV;15.BS2;16.SS2

2.4 干擾性測試結(jié)果

將CSFV C和PCV2 BH5標準模板按不同濃度進行組合，制備不同模板濃度的混合樣品，用建立的方法進行檢測，不同模板濃度的混合樣品如下：樣品1(107CSFV+100PCV)，樣品2(106CSFV+101PCV)，樣品3(105CSFV+103PCV)樣品4(104CSFV+104PCV)，樣品5(103CSFV+105PCV)，樣品6(101CSFV+106PCV)，樣品7(100CSFV+107PCV)。結(jié)果當兩個模板濃度不同時，尤其是一個模板濃度高，另一個模板濃度低時，本方法仍然可鑒別檢測到不同的兩個模板，即不同的模板濃度對本方法干擾性小，結(jié)果見圖5。圖5A中1～5管呈綠色，6～7管無色。圖5B中3～7管紅色，1～2管無色。圖5C中1～2管綠色，7～8管紅色，3～5管黃色。

A.520 nm；B.690 nm；C.520 nm和690 nm；1～8.107～100拷貝/L CSFV和PCV混合模板標準品

A.520 nm；B.690 nm；C.520 nm、690 nm；1.107CSFV+100PCV；2.106CSFV+101PCV；3.105CSFV+103PCV；4.104CSFV+104PCV；5.103CSFV+105PCV；6.101CSFV+106PCV；7.100CSFV+107PCV

2.5 臨床樣品驗證

用建立的二重熒光LAMP對臨床樣品112份進行檢測，結(jié)果CSFV陽性的樣品41份，檢測陽性率36.6%，PCV2陽性樣品8份，檢測陽性率為7.14%。CSFV和PCV2同時為陽性的樣品5份，混合感染率為4.46%，與熒光定量PCR方法檢測結(jié)果一致。檢測的所有陽性樣品產(chǎn)物送生物公司測序，測序結(jié)果經(jīng)序列比對分析均為對應病毒。

3 討論

LAMP核酸擴增方法是在恒溫下進行擴增，操作比較簡便，成本低廉，被廣泛應用于各種疾病的診斷[15-16]。在LAMP的基礎(chǔ)上已成功開發(fā)出多種顏色的多重LAMP方法，能有效鑒別多種病原體[17]。本研究是在FIP與BIP引物之間設計了一條Taqman 探針，在探針的5′端標記不同的熒光基團，在3′標記有淬滅基因。探針本身并不會發(fā)光，當加入LAMP反應中，探針序列結(jié)合到模板序列上，隨著內(nèi)外引物特異性結(jié)合延伸，迫使與模板結(jié)合的探針斷裂，熒光基團與淬滅基團斷開，熒光基團成為游離基團，這樣游離的熒光基團在沒有淬滅基團淬滅的情況下發(fā)出熒光。本研究采用的FAM熒光基團，在波長520 nm熒光通道下，游離的FAM熒光基團激發(fā)綠色，在波長690 nm熒光通道下，游離的CY5.5熒光基團激發(fā)紅色。本研究通過反應后顏色的不同來區(qū)分不同的病毒，并獲得成功。

為了獲得穩(wěn)定的最佳的擴增效果，本研究對反應中的引物濃度、探針濃度及反應試劑程序進行了優(yōu)化。在引物濃度和探針濃度的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)引物濃度用量最高，其次為外引物濃度，探針濃度用量最低，它們之間的濃度應用比約為80∶10∶1。在反應程序的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)最佳反應程序為：退火延伸溫度62℃ 90 min，85℃ 5 min結(jié)束反應。應用優(yōu)化后的引物濃度、探針濃度及反應試劑程序，獲得了最佳的LAMP擴增效率。

本研究采用Bst3.0 DNA/RNA聚合酶進行二重熒光LAMP擴增，與采用Bst2.0 DNA聚合酶和BstDNA聚合酶大片段的二重熒光LAMP相比，具有更佳的的延伸能力活性、更強的逆轉(zhuǎn)錄活性以及強烈的鏈置換活性。以研究的引物組、Bst3.0 DNA/RNA聚合酶及試劑進行擴增，一次加模板就能完成LAMP擴增，不需要預先對RNA模板單獨進行逆轉(zhuǎn)為cDNA，尤其是對DNA和RNA混合模板，特別是含有二級復雜結(jié)構(gòu)的RNA模板檢測特別方便，而采用Bst2.0 DNA聚合酶或BstDNA聚合酶大片段進行二重熒光LAMP時則無法對有二級復雜結(jié)構(gòu)的RNA模板進行擴增。

本研究建立的熒光方法，反應結(jié)束后直接通過儀器讀取或憑肉眼判定反應結(jié)果，不需要通過電泳或打開反應蓋添加染料，這樣極大地降低了LAMP的污染。有條件的實驗室，建議在超凈工作臺中配制試劑，減少空氣中的氣溶膠對的污染，確保樣品檢測的準確性。

為了進一步驗證建立方法的實用性，用優(yōu)化后建立的方法對保存的臨床樣品的進行檢測，同時采用比較成熟敏感的熒光定量PCR方法進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的結(jié)果與熒光定量PCR方法獲得的結(jié)果一致。為了防止假陽性的出現(xiàn)，陽性樣品產(chǎn)物經(jīng)序列測定，分析比對結(jié)果全為對應病毒，說明本研究建立的方法準確，適合于臨床樣品的檢測。本研究建立的二重LAMP檢測方法，一次反應能同時鑒別CSFV和PCV2，為區(qū)分CSFV或PCV2提供了技術(shù)支撐。