植物類型Ⅲ聚酮合酶基因工程的研究進(jìn)展 *

羅在柒 陸 俊 田 凡 顏鳳霞 黃安香

(貴州省林業(yè)科學(xué)研究院 ，貴州 貴陽(yáng) 550005)

隨著人們對(duì)生活質(zhì)量的不斷追求，以及對(duì)中藥活性成分研究的不斷深入，許多天然活性成分的實(shí)際應(yīng)用需求不斷增加。然而，受藥用植物資源的貧乏和中藥活性成分含量偏低的限制，常規(guī)的種植方法已難以實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量植物次生代謝產(chǎn)物的需求?，F(xiàn)代生物技術(shù)能夠從分子水平實(shí)現(xiàn)對(duì)中草藥有效成分合成代謝的人工調(diào)控，并且可以借助轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因的異源表達(dá)，從而提高有效藥用成分的產(chǎn)量和質(zhì)量，其中聚酮類化合物研究得比較系統(tǒng)和深入，現(xiàn)已開辟了一條藥用資源開發(fā)利用的新路徑[1]。

1 聚酮化合物與聚酮合酶

聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)是調(diào)控植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物為聚酮類化合物酶的復(fù)合體，藥用方面具重要工業(yè)價(jià)值，目前上市的醫(yī)藥用或農(nóng)用抗生素藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)中，聚酮類化合物的位于各類天然產(chǎn)物前列，通常常見的聚酮類抗生素有紅霉素(erythromycin)、兩性霉素(amphotericin)、螺旋霉素(spiramycin)、四環(huán)素類(tetracycline)等[2]。因?yàn)榫弁衔锝Y(jié)構(gòu)的多樣性導(dǎo)致了代謝過(guò)程中產(chǎn)生多樣性的活性，行使多種重要生物學(xué)功能活性。

1.1 聚酮合酶的類型劃分

豈止目前，通常將PKS分為3類，PKSI型也稱為模塊類，由多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域通過(guò)共價(jià)連接后形成模塊，再由多個(gè)模塊組成多功能酶的復(fù)合體，這類物質(zhì)主要合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，如紅霉素、利福霉素、西羅莫司等；PKSII型也稱為重復(fù)型、疊代或芳香類，含有的各個(gè)催化結(jié)構(gòu)域?yàn)楠?dú)立的蛋白，具有2個(gè)不同的酮類酶連接縮合后形成的酮縮合酶，如KSα和KSβ，其中的KSα與PKS I中的KS功能相似，而KSβ控制的是聚酮鏈的長(zhǎng)度。通常PKS II型酶主要控制合成芳香族的物質(zhì)，譬如蒽環(huán)類及四環(huán)化合物等； PKSⅢ型又稱查兒酮型PKS，和其他兩種PKS不同， PKS Ⅲ型直接作用于?；鵆oA活化的簡(jiǎn)單羧酸，然而，Ⅰ型和Ⅱ型PKS是通過(guò)ACP活化?；?CoA的底物[3]。

1.2 植物類型Ⅲ聚酮化合物合酶超家族產(chǎn)物多樣性及催化原理

植物Ⅲ型PKS，由40-45 kD的二聚體多肽組成，編碼基因通常由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，在所發(fā)現(xiàn)的Ⅲ型PKSs中完全相同，可完成重復(fù)縮合反應(yīng)，其具有高度保守的催化活性中心，即Cys-His-Asn的組合結(jié)構(gòu)，被命名為查爾酮合酶(chalcone synthse，CHS)。這類酶主要出現(xiàn)在植物界的植物體代謝，但在枯草芽孢桿菌、鏈霉菌和米曲霉等少數(shù)細(xì)菌及真菌中也存在[4]。

目前，中藥黃酮類化合物有效成分的合成路徑已經(jīng)很明晰[5]。在已發(fā)現(xiàn)的4000余種的黃酮類化合物種，主要有黃酮(flavones)、異黃酮(isoflavones)、黃酮醇(flavonols)花色素苷(anthocyanins)等類別。植物次生代謝基因工程方面已有近 30 種不同功能的植物PKSs 基因堿基序列被相繼挖掘和功能驗(yàn)證。其中包括了：芪合酶(Stilbene synthase, STS)、CHS、2-吡喃酮合酶(2-Pyrone Synthase,2-PS)、苯亞甲基丙酮合酶、吖啶酮合酶(Acridone synthase,ACS、戊烯酮-色酮合酶(Pentaketide chromone synthase, PCS)、4-香豆酰甘油酸合酶(p-Coumaroyl triacetic acid synthase,CTAS)、辛烯酮合酶(Octaketides synthase, OKS)、聯(lián)芐合酶(Bibenzyl synthase,BBS)、二苯甲酮合酶(Benzophenone synthase,BPS)、聯(lián)苯合酶(Biphenyl synthase,BIS)、芪-羧酸酯合酶(Stilbenecarboxylate synthase,STCS)、蘆薈松合酶(Aloesone synthase,ALS)、苯戊酮合酶(Valerophenone synthase,VPS)、姜黃素合酶(Curcuminoid synthase, CUS；Curcumin synthase 1-3, CURS1-3)等，大量研究證明：植物類型Ⅲ聚酮化合物合酶(PKS) 決定該類化合物基本分子骨架建成和代謝途徑碳硫走向，在該類化合物生物合成起始反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，是合成途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。

目前，已經(jīng)成功分離得到 14 種植物類別的PKS Ⅲ型基因，像虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc[6-7])、小立碗蘚(Physcomitrellapatens)、金魚草(AntirrhinummajusCHS AMCHS)、八仙花(Hydrangeamacrophyllavar.thunbergii)、紫花苜蓿(MedicagosativaCHS)、掌葉大黃(RheumpalmatumBAS)、花生(ArachishypogaeaSTS)和野葛(PuerarialobataCHScDNA)等，這些基因都既具有保守性和獨(dú)特的個(gè)性這些同祖同源基因及其表達(dá)產(chǎn)物既有共性也表現(xiàn)出許多獨(dú)特個(gè)性，這些個(gè)性賦予此類次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)上的多樣性[10]。其中，虎杖根中分離得到的PcPKS 5表現(xiàn)出高效率的催化效率[8-9]，并成功遺傳轉(zhuǎn)化到壺瓶棗表現(xiàn)出較好的抗真菌能力[11-12]。以上超家族內(nèi)其他成員酶(CHS-Like) 功能的多樣性均來(lái)自其原型酶-CHS 活性位點(diǎn)的小的修飾影響了該類酶活性中心空間構(gòu)象，空間變化極大改變了酶分子的起始底物選擇性、鏈延伸長(zhǎng)度和環(huán)化反應(yīng)機(jī)制[13-14]。

為更多了解功能酶活性差異可能產(chǎn)生的機(jī)制，以確定其高效 BAS 活性的分子機(jī)理，開展了酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)比較。蛋白晶體學(xué)研究以PKSs 家族不同成員的功能多樣性來(lái)自于酶催化位點(diǎn)的非常微小的構(gòu)象變化[15]。類式的Austin和Noel研究認(rèn)為紫花苜蓿“門衛(wèi)”Phe215 和 Phe265是調(diào)節(jié)PKSⅢ類型 活性位點(diǎn)與輔酶 A(Co A)結(jié)合通道之間的空間結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位點(diǎn)[16]。掌葉大黃 的相關(guān)研究得到了一個(gè)顯著特點(diǎn)是 Phe215(Ms CHS2 順序)被 Leu 取代，而取代對(duì)于該酶的 BAS 功能活性具有自身的獨(dú)特性。試驗(yàn)得到Rp BAS 的Phe265(Ms CHS2 順序)與 CHS2 的區(qū)別是其側(cè)鏈構(gòu)象更加靠近 Leu215 ，并形成相互疏水作用，這兩個(gè)氨基酸基團(tuán)構(gòu)象變化致使 BAS 活性擴(kuò)大兩倍，且還限定了其底物專一性[17]。相類似的Pc PKS1 是一個(gè)同時(shí)擁有 CHS 和 BAS 活性的雙功能酶，且 Pc PKS1 的 BAS催化活性效率(Kcat/Km) 是 Pc PKS2 的70 倍[7]。然而，在 Pc PKS1 序列中，Phe215 和 Phe265也存在保守性，我們也推測(cè)出Pc PKS1區(qū)別于Pc PKS2特異的重要氨基酸序列，是決定 BAS 活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。以上研究再次證明了以查爾酮合酶為原型酶的植物類型Ⅲ PKS 超家族是研究系統(tǒng)進(jìn)化和蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的模式分子家族。

1.3 PKS功能與機(jī)制多樣性

植物聚酮類化合物(Polyketide)主要包含酚類、芪類及類黃酮化合物等三大類物質(zhì)，這些物質(zhì)在調(diào)控植物花色、防止紫外線傷害、預(yù)防病原菌及昆蟲危害，以及作為植物與環(huán)境互作信號(hào)分子方面扮演重要的生物學(xué)功能，況且這類化合物具有豐富多樣的生物學(xué)活性，在人體保健及疾病防控方面被廣泛應(yīng)用[18]。

植物類型Ⅲ PKS 超家族其他成員酶(CHS-Like) 功能的多樣性來(lái)自原型酶——CHS 活性位點(diǎn)的小的修飾，這樣極小的變動(dòng)改變了起始底物的選擇性、鏈延伸的長(zhǎng)度和環(huán)化反應(yīng)機(jī)制。因此，揭示植物類型Ⅲ PKS超家族結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)聯(lián)作用，對(duì)于利用該類酶進(jìn)行基因工程、代謝工程遺傳操作是必不可缺的重要資源[19]。

2 存在問(wèn)題與展望

有關(guān)聚酮合酶基因的最新研究表明，藥用植物具有聚酮合酶基因，并實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)[20]。一些聚酮合酶參與螺萊素的生物合成[21]，煙草植物中也相繼克隆得到查爾酮合酶基因[22]，近期研究從樹莓中獲得具有查爾酮和苯亞酮合酶的雙功能聚酮合酶基因[23]。另外，在姜科、非洲菊、余甘子等植物聚酮合酶基因研究也取得明顯進(jìn)展[24-26]，相關(guān)酶基因在腸道菌群中產(chǎn)生活性毒素具有抑制直腸癌等疾病的防控[27]。因此，植物III型聚酮合成酶(PKSs)產(chǎn)生多種次生代謝物，呈現(xiàn)一個(gè)基因的復(fù)制和功能的復(fù)雜性，植物與微生物系統(tǒng)PKS研究也得到深入[28]。在一些傳統(tǒng)中草藥內(nèi)生真菌中也鑒定出Ⅲ型聚酮合成酶基因[29],一種Ⅲ型聚酮合酶可以催化螺旋藻毒素的生物合成[30]，成功表達(dá)了一種用于改進(jìn)異源代碼的自動(dòng)化數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)管道酶基因，目前該類基因挖掘勢(shì)頭呈平穩(wěn)態(tài)勢(shì)在發(fā)展[31]。

相關(guān)植物聚酮合酶的研究顯示，在分離和克隆CHS 基因的近30 年中，已經(jīng)報(bào)道了200多個(gè)基因。目前，藥物來(lái)源于聚酮化合物的每年銷售額已超過(guò) 100 億美元。然而，仍然存在許多藥用植物中的聚酮類化合物PKS基因始終沒(méi)有得到分離和克隆，基于PKS功能與機(jī)制多樣性，有其在苯亞甲基丙酮的生物合成究竟由BAS或者CHS/BAS，或其它類型酶等的路徑選擇等諸多問(wèn)題仍然未知。

綜上所述，今后需大量開展聚酮合酶基因的克隆以及蛋白酶的生物學(xué)活性的研究，不但可以補(bǔ)充聚酮合酶超家族基因的成員，還有助于深入認(rèn)識(shí)植物聚酮化合物藥用成分合成的分子機(jī)理。同時(shí)，對(duì)植物Ⅲ型聚酮合酶及整個(gè)超基因家族的深入研究為尋找新型藥物，以及對(duì)提升植物本身藥用成分和促進(jìn)作物的遺傳改良等提供新的途徑，以及對(duì)基因工程獲取聚酮化合物開發(fā)新藥具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。