蜘蛛香單帖環(huán)烯醚類成分及其抗乳腺癌活性

胡萍萍， 胡靜娜

(1.寧波市中醫(yī)院，浙江 寧波 315000；2.寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院，浙江 寧波 315000)

蜘蛛香，又名馬蹄香、土細(xì)辛、心葉纈草、養(yǎng)心蓮、養(yǎng)血蓮、臭藥、烏參、貓兒屎、老虎七、香草等，是敗醬科纈草屬植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones.的干燥根莖。其藥性辛、微苦，溫，主產(chǎn)于中國和印度，藥用歷史悠久，始載于《本草綱目》，2015年版《中國藥典》(一部)也加以收載，具有理氣和中、鎮(zhèn)靜止痛、散寒除濕、活血消腫等功效，可用于脘腹脹痛、嘔吐泄瀉、小兒疳積、風(fēng)寒濕痹、腳氣水腫、月經(jīng)不調(diào)等疾病的治療[1-2]。研究表明，蜘蛛香中含有木脂素、揮發(fā)油、倍半萜以及環(huán)烯醚萜類成分[3-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明蜘蛛香具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗腫瘤等作用[7-10]。為進(jìn)一步研究蜘蛛香的藥效物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其二氯甲烷提取物的成分進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，運(yùn)用硅膠柱、中壓柱、制備型HPLC、反相HPLC等方法分離、純化得到9個(gè)化合物，其中，化合物4首次從該屬植物中分離得到，化合物1為首次從該植物中分離得到。

1 材料

Thermo ScientificExactiv 高分辨質(zhì)譜儀(美國賽默飛科技有限公司)；Bruker Avance DPX600核磁共振儀(德國Bruker公司)；中壓色譜儀 C-605-615-635(瑞士BUCHI公司)；半制備型高效液相色譜儀600-2487(美國Waters公司)；Amethyst C18-H制備柱(250 mm×21.2 mm，10 μm，美國賽分科技有限公司)；DAISGEL SP-120-40/60-ODS-RPS中壓色譜柱填料(日本DAISO公司)；柱層析及薄層層析用硅膠GF254(青島海洋化工廠)。其余試劑均為分析純。

蜘蛛香藥材購自貴州省江口縣，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳錫林教授鑒定為敗醬科纈草屬植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones.的干燥根莖。

2 提取與分離

蜘蛛香干燥根莖粗粉2 kg，以95%乙醇浸泡48 h后，在室溫下進(jìn)行滲漉提取，滲漉液減壓濃縮至無醇味，加水混懸至約1.5 L，再加等體積二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷萃取液，減壓回收二氯甲烷，得到深褐色油狀二氯甲烷萃取物。將二氯甲烷萃取物進(jìn)行硅膠柱層析分離，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得到11個(gè)流分 Fr.1～11。取Fr.3進(jìn)行中壓柱層析分離，以90%甲醇洗脫，所得流分蒸干，9號(hào)流分薄層制備分離，20 cm×20 cm制備薄層板，以石油醚-乙酸乙酯(6∶1)上行展開，置254 nm紫外燈下，刮取主條帶，以乙酸乙酯洗脫，得化合物1(102 mg)，10號(hào)流分以與制備化合物1相同的色譜條件，經(jīng)薄層制備分離，得化合物2(15 mg)，11～13號(hào)共3個(gè)流分合并，經(jīng)薄層制備分離，以石油醚-乙酸乙酯(5∶1)上行展開，得化合物3(46 mg)、4(11.4 mg)；取Fr.4進(jìn)行中壓柱層析分離，以60%甲醇洗脫，19號(hào)流分蒸干后，得化合物5(13.8 mg)；取Fr.8進(jìn)行中壓柱層析分離，以75%甲醇洗脫，所得13號(hào)流分蒸干，得化合物6(72.7 mg)，所得19號(hào)流分蒸干，進(jìn)行制備型HPLC分離，75%甲醇洗脫得化合物7(111.5 mg)；取Fr.5～6合并進(jìn)行中壓柱層析分離，以50%、70%、90%甲醇洗脫，經(jīng)HPLC分析，合并相似流分，所得流分蒸干，進(jìn)行制備型HPLC分離得化合物8(27.1 mg)；以90%甲醇洗脫，所得流分蒸干，9號(hào)樣品進(jìn)行制備型HPLC分離，73%甲醇洗脫得化合物9(24.2 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色油狀。ESI-MSm/z：423.2[M+H]+，445.2[M + Na]+；C22H30O8。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.72(1H, s, H-3), 6.00(1H, d, 12.0, H-1), 5.89(1H, t, H-7), 5.39(1H, d, H-6), 4.75(1H, d, 12.0, H-11a), 4.69(1H, d, 12.0, H-11b), 3.45(1H, d, 12.0, H-9), 3.04(1H, d, 6.0, H-10a), 2.93(1H, d, 6.0, H-10b), 2.25(2H, m, H-2′), 2.19(2H, d, 6.0, H-2″), 2.14(1H, m, H-3′), 2.10(1H, m, H-3″), 1.27(3H, s, 2?-CH3), 1.00(6H, d, 6.0, 4′,5′-CH3), 0.97(6H, d, 6.0, 4″,5″-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 172.4(C-1″), 170.8(C-1?), 170.3(C-1′), 148.5(C-3), 140.9(C-5), 118.6(C-6), 108.4(C-4), 92.6(C-1), 83.0(C-7), 64.1(C-8), 60.8(C-11), 47.8(C-10), 43.4(C-2″), 43.0(C-9), 43.0(C-2′), 25.8(C-3″), 25.6(C-3′), 22.3(4″-CH3), 22.3(5″-CH3),22.2(4′-CH3), 22.0(5′-CH3), 20.9(2?-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定為valtrate。

化合物2：黃色油狀。ESI-MSm/z：409.2[M+H]+，431.2[M + Na]+；C22H32O7。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.45(1H, s, H-3), 5.92(1H, d, 6, H-1), 5.54(1H, t, H-7), 5.47(1H, s, H-10a), 5.38(1H, s, H-10b), 4.65(1H, d, 12.0, H-11a), 4.45(1H, d, 12.0, H-11b), 2.95(1H, s, H-9), 2.29(2H, m, H-2′), 2.22(2H, d, 6.0, H-2?), 2.15(1H, m, H-3′), 2.13(1H, m, H-3?), 2.08(2H, s, H-6), 2.06(1H, t, 6, H-5), 1.27(3H, s, 2″-CH3), 1.00(6H, 4′,5′-CH3), 0.98(6H, d, 6.0, 4?,5?-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 173.0(C-1′), 171.6(C-1?), 170.5(C-1″), 146.9(C-8), 141.9(C-3), 116.1(C-4), 113.3(C-10), 90.2(C-1), 74.8(C-7), 63.5(C-11), 43.4(C-2′), 43.2(C-2?), 43.0(C-9), 36.8(C-6), 33.8(C-5), 25.7(C-3′), 25.6(C-3?), 22.4(4′-CH3), 22.4(5′-CH3), 22.3(4?-CH3), 22.3(5?-CH3), 21.3(2″-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定為desoxidodidrovaltrate。

化合物3：黃色油狀。ESI-MSm/z：437.2[M+H]+，459.2[M + Na]+；C23H32O8。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.69(s, H-3), 5.97(d,J=10.1 Hz, H-1), 5.86(s, H-7), 5.36(d,J=2.3 Hz, H-6), 4.72(d,J=12.4 Hz, H-11a), 4.66(d,J=12.4 Hz, H-11b), 3.42(d,J=10.1 Hz, H-9), 3.01(d,J=4.7 Hz, H-10a), 2.89(d,J=4.9 Hz, H-10b), 2.22(dd,J=7.2, 3.3 Hz, H-2′), 2.21～2.16(m, H-2?), 2.17(d,J=7.3 Hz, H-3?), 2.14～2.08(m, H-4′), 2.10～2.07(m, H-3′), 1.25(s, 2″-CH3), 0.98(s, 5′, 6′-CH3), 0.97(s, 4?, 5?-CH3)；13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 172.7(2″-CH3), 170.8(C-1′), 170.3(5?-CH3), 148.5(C-10), 140.9(C-3), 118.6(C-4), 108.4(C-1), 92.6(C-9), 83.1(C-5), 64.2(C-6), 60.8(C-11), 47.9(C-7), 43.4(4?-CH3), 43.0(C-8), 41.4(C-1″), 32.0(5′-CH3), 29.3(C-4′), 25.6(C-2?), 22.3(C-1?), 22.2(C-3?), 20.9(C-2′), 19.2(C-3′), 11.2(6′-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定為1-homovaltratum。

化合物4：淡黃色油狀。ESI-MSm/z：411.2[M + H]+，433.2[M+Na]+；C22H34O7。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.35(1H, s, H-3), 6.00(1H, d, 6.0, H-1), 5.23(1H, m, H-7), 4.60(1H, d, 12.0, H-11a), 4.40(1H, d, 12.0, H-11b), 2.89(1H, dd, 6.0, 18.0, H-5), 2.24(2H, m, H-2′), 2.21(2H, m, H-2?), 2.13(1H, m, H-3′), 2.12(1H, m, H-3?), 2.11(1H, m, H-9), 2.10(1H, m, H-8), 2.04, 1.95(2H, m, H-6), 1.28(3H, s, H-10), 1.07(3H, s, 2″-CH3), 1.00(6H, d, 4′,5′-CH3), 0.98(6H, d, 6.0, 4?,5?-CH3);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:173.0(C-1?), 171.8(C-1″), 170.6(C-1′), 139.9(C-3), 113.5(C-4), 90.9(C-1), 76.9(C-7), 63.6(C-11), 43.5(C-2?), 43.4(C-2′), 45.7(C-9), 37.1(C-6), 39.0(C-8), 32.0(C-5), 25.7(C-3′), 25.7(C-3?), 22.4(4′-CH3), 22.4(4?-CH3), 22.4(5?-CH3), 22.3(5′-CH3), 21.1(2″-CH3), 12.8(10-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定為nardostachin monoacetate。

化合物5：褐綠色粉末。ESI-MSm/z：205.1[M+H]+，227.1[M+Na]+；C12H12O3。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 9.93(s, H-10), 9.20(s, H-1), 7.88(s, H-3), 7.86(d, H-7), 6.60(d, 6.0, H-6), 4.68(s, H-11), 3.65(q, 12.0, H-1′), 1.30(t, 12.0, 2′-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 184.9(C-10), 150.7(C-3), 146.2(C-1), 141.1(C-7), 134.4(C-8), 124.4(C-5), 121.6(C-4), 122.9(C-9), 109.2(C-6), 66.9(C-1′), 66.6(C-11), 15.1(2′-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定為11-ethoxyviburtinal。

化合物6：無色油狀。ESI-MSm/z: 518.2[M+ H]+，540.2[M + Na]+；C24H33ClO10。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.92(s, H-3), 6.00(d,J=10.1 Hz, H-1), 5.71(t,J=2.7 Hz, H-6), 5.41(d,J=2.8 Hz, H-7), 4.72(d,J=12.2 Hz, H-11a), 4.60(d,J=12.3 Hz, H-11b), 3.93(d,J=11.3 Hz, H-10a), 3.73(d,J=11.3 Hz, H-10b), 2.94(d,J=14.2 Hz, H-2″b), 2.89(dd,J=10.1, 2.5 Hz, H-9), 2.79(d,J=14.2 Hz, H-2″a), 2.32(d,J=7.3 Hz, H-2′), 2.07～2.01(m, H-3′), 1.99(s, 2″″-CH3), 1.89(s, 2?-CH3), 1.46(s, 5″-CH3), 1.44(s, 4″-CH3), 0.96(d,J=1.8 Hz, 5′-CH3), 0.95(d,J=1.8 Hz, 4′-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 170.8(C-1?), 170.8(C-1″″), 170.2(C-1′), 169.1(C-1″), 148.6(C-3), 139.7(C-5), 117.6(C-6), 109.1(C-4), 92.7(C-1), 79.4(C-3″), 82.8(C-7), 80.2(C-8), 60.7(C-11), 44.0(C-2″), 42.7(C-2′), 49.6(C-9), 48.9(C-10), 26.7(5″-CH3), 26.6(4″-CH3), 25.6(C-3′), 22.5(2?-CH3), 22.4(4′-CH3), 22.4(5′-CH3), 21.1(2″″-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定為valeriandoid B。

化合物7：無色油狀。ESI-MSm/z: 577.2[M+H]+，599.2[M + Na]+；C21H41ClO11。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.61(s, H-3), 6.57(d,J=1.7 Hz, H-1), 4.98(dd,J=7.8, 6.1 Hz, H-7), 4.91(d,J=12.4 Hz, H-11b), 4.78(d,J=4.8 Hz, H-2?), 4.68(d,J=12.4 Hz, H-11a), 3.74(d,J=11.5 Hz, H-10b), 3.68(d,J=11.5 Hz, H-10a), 2.72(d,J=1.6 Hz, H-9), 2.61(dd,J=13.6, 6.1 Hz, H-6b), 2.27(d,J=2.1 Hz, H-2″″b), 2.26(d,J=1.7 Hz, H-2″″a), 2.23(dd,J=7.2, 2.4 Hz, H-2′), 2.09(dd,J=7.2, 2.3 Hz, H-6a), 2.08～2.06(m, H-3′), 2.23(d,J=2.1 Hz, H-3?), 2.11(s, 2″-CH3), 2.09～2.07(m, H-3″″), 1.00(d,J=3.1 Hz, 4′-CH3), 0.98(d,J=1.1 Hz, 5′-CH3), 0.97(d,J=0.6 Hz, 4?-CH3), 0.97(d,J=1.1 Hz, 5?-CH3), 0.97(d,J=1.1 Hz, 5″″-CH3), 0.96(d,J=0.6 Hz, 4″″-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 173.3(C-1″″), 170.8(C-1′), 170.7(C-1″), 170.0(C-1?), 144.8(C-3), 112.8(C-4), 89.4(C-1), 80.2(C-8), 79.8(C-7), 77.1(C-2?), 70.2(C-5), 61.9(C-11), 54.1(C-9), 49.8(C-10), 43.1(C-2′), 43.0(C-2″″), 40.7(C-6), 29.9(C-3?), 25.7(C-3′), 25.6(C-3″″), 22.4(5′-CH3), 22.3(4″″-CH3), 22.3(4′-CH3), 22.3(5″″-CH3), 20.9(2″-CH3), 18.7(4?-CH3), 17.4(5?-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定為volvaltrate B。

化合物8：淡黃色粉末。ESI-MSm/z: 219.1[M+H]+，241.1[M+Na]+；C12H10O4。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 9.96(s, H-10), 9.21(s, H-1), 7.91(s, H-3), 7.90(d,J=3.3 Hz, H-7), 6.64(d,J=3.3 Hz, H-6), 5.29(s, H-11), 2.15(s, 13-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 185.0(C-10), 170.6(C-12), 150.7(C-3), 146.29(C-1), 142.1(C-7), 133.8(C-8), 124.9(C-5), 123.0(C-9), 119.3(C-4), 109.4(C-6), 60.4(C-11), 20.8(13-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定為baldrinal。

化合物9：無色油狀。ESI-MSm/z: 425.2[M+H]+，447.2[M+Na]+；C22H32O8。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.53(d,J=1.5 Hz, H-3), 5.86(d,J=5.4 Hz, H-1), 4.97(t,J=5.7 Hz, H-7), 4.70(d,J=12.3 Hz, H-13a), 4.48(d,J=12.3 Hz, H-13b), 3.08(d,J=5.0 Hz, H-10a), 3.04～2.93(m, H-5), 2.84(d,J=5.0 Hz, H-10b), 2.73(dd,J=8.4, 5.4 Hz, H-9), 2.24(d,J=7.0 Hz, H-16), 2.24(d,J=7.0 Hz, H-22), 2.23～2.21(m, H-17), 2.22～2.20(m, H-23), 2.21(dd,J=7.1, 5.4 Hz, H-6), 2.07(s, 12-CH3), 0.99(s, 18-CH3), 0.99(s, 24-CH3), 0.98(s, 19-CH3), 0.98(s, 25-CH3)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:173.0(C-15),171.1(C-21),169.8(C-11),142.2(C-3),110.8(C-4), 88.4(C-1), 76.8(C-7), 64.2(C-8), 63.3(C-13), 48.8(C-10), 43.4(C-16), 43.2(C-22), 39.4(C-9), 35.1(C-6), 32.6(C-5), 25.7(C-23), 25.6(C-17), 22.4(25-CH3), 22.4(19-CH3),22.3(24-CH3), 22.3(18-CH3), 21.0(12-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定為isodidrovaltratum。

4 細(xì)胞毒性篩選

采用MTT法對(duì)分離得到化合物進(jìn)行體外抗人源乳腺癌活性的篩選，以Adriamycin為陽性對(duì)照。測(cè)試細(xì)胞株為人源乳腺癌細(xì)胞MCF-7及MDA-MB-231。平行測(cè)定3次，測(cè)試吸光度值，根據(jù)抑制率計(jì)算化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果顯示，化合物1～4、6對(duì)人源三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231有一定的抑制作用，IC50分別為(19.02±0.23)、(23.49±0.19)、(24.76±0.37)、(21.03±0.09)、(26.35±0.24)μmol/L；化合物6、8對(duì)人源乳腺癌細(xì)胞MCF-7有一定的抑制作用，IC50分別為(35.4±0.42)、(37.39±0.16)μmol/L。

5 討論

敗醬科纈草屬植物在北歐等國家一般用于鎮(zhèn)靜、催眠，亦有粗制劑用于臨床，單帖環(huán)烯醚類成分被認(rèn)為是其藥效物質(zhì)。據(jù)2020癌癥報(bào)告統(tǒng)計(jì)，全球范圍，女性癌癥發(fā)病率最高的為乳腺癌[18]。本研究表明，纈草屬植物蜘蛛香中含有的單帖環(huán)烯醚類成分亦具有抗乳腺癌活性，其體內(nèi)抑制活性及分子作用機(jī)制需進(jìn)一步研究，這將為蜘蛛香藥材的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。單帖環(huán)烯醚類成分，具有鎮(zhèn)靜、催眠活性，其脂溶性較強(qiáng)，應(yīng)易穿過血腦屏障，本研究表明該類成分具有較顯著的腫瘤細(xì)胞毒活性，其對(duì)人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制活性研究應(yīng)是較好的研究方向，課題組后續(xù)擬進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。