茯神化學(xué)成分的研究

王軍民， 劉思遠(yuǎn)， 楊 瑩， 王 濤， 張紅霞

(1.西南林業(yè)大學(xué)，西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224；2.中國科學(xué)院昆明植物研究所資源植物與生物技術(shù)重點實驗室，云南省野生資源植物研發(fā)重點實驗室，云南 昆明 650223)

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核，是我國傳統(tǒng)常用中藥材[1],自生在松樹森林植物群落中，靠吸收松樹根部營養(yǎng)而生長發(fā)育[2]。茯神為茯苓塊中穿有堅實細(xì)松根者，長寬4～5 cm，厚4～6 mm，松根直徑不超過1.5 cm，邊緣苓塊可不成方形；茯苓中間生長的松木如為彎曲的松根，似朽木狀，質(zhì)松體輕，每根直徑不超過2.5 cm，周圍帶有三分之二的茯苓肉則稱之為茯神木[3]。茯苓和茯神具有較好的生物活性[4]，前者味甘淡，性平，具有利水滲濕、健脾等功效；后者載于《名醫(yī)別錄》，味甘淡，性平，功能寧心、安神、利水，治心虛驚悸、健忘、失眠、驚癇、小便不利。為探究茯神寧心、安神活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步開發(fā)和利用傳統(tǒng)藥用資源，本實驗對其化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離鑒定出12個化合物，其中化合物1～2為木質(zhì)素類，3～12為三萜類，1～8為首次從茯苓和茯神中分離得到。

1 材料

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司); Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×9.4 mm, 5 μm，美國Agilent公司);電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS) Bruker HTC/Esquire spectrometer 液相-離子阱色譜聯(lián)用儀測定、Bruker AM-400 MHz 超導(dǎo)核磁共振儀測定(德國Bruker公司)。柱色譜硅膠G(100～200、200～300目)、薄層色譜硅膠G板(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20凝膠 (瑞典Amersham Pharmacia公司)。常用分離試劑工業(yè)級氯仿、乙酸乙酯、甲醇等重蒸后使用。

樣品采自云南省臨滄市雙江拉祜族佤族布朗族傣族自治縣茯苓種植基地，經(jīng)西南林業(yè)大學(xué)胡勇副教授鑒定為茯神，標(biāo)本(T20191012-2) 保存于西南林業(yè)大學(xué)標(biāo)本館，切片后去除外部茯苓菌絲，保留內(nèi)部松根而得到茯神松根(下文通稱茯神)，上述材料粉碎后過20目篩備用，茯苓母種為中國科學(xué)院5.78原種，栽培樹樁為思茅松砍伐半年后樹樁。標(biāo)本保存在西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院植物資源利用系藥用植物教研室。

2 提取與分離

取干燥茯神約2.2 kg，粉碎至20目，用75%乙醇加熱回流提取3次，每次25 L，分別提取3、2、2 h后過濾，合并濾液并減壓濃縮得到浸膏約420 g，加入適量水超聲懸浮后得混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取后得不同部分萃取物。取乙酸乙酯部分 (98 g)進(jìn)行硅膠 (100～200目)柱層析，用石油醚-丙酮 (50∶1～ 0∶1) 梯度洗脫，合并后得到7個部分Fr.1～ Fr.7。Fr.1 (5.1 g) 經(jīng)硅膠 (200～300目)柱層析，石油醚-乙酸乙酯 (30∶1～ 0∶1) 洗脫，薄層色譜展開檢測后合并得到6個組分Fr.1.1～ Fr.1.6。組分Fr.1.3經(jīng)過硅膠(200～ 300目)柱層析，石油醚-丙酮 (30∶1～ 1∶1)以及Sephadex LH-20凝膠氯仿-甲醇(6∶4)反復(fù)洗脫，得化合物11(42.6 mg)、12(61.8 mg)；組分Fr.1.5經(jīng)過反復(fù)硅膠 (200～ 300目)柱層析，石油醚-丙酮 (15∶1～ 3∶1)柱層析，得化合物9(42.1 mg)、10(24.9 mg)。Fr.3 (12.3 g) 經(jīng)硅膠 (200～ 300目)柱層析，用石油醚-乙酸乙酯 (25∶1～ 0∶1) 洗脫，薄層色譜展開檢測后合并得到8個組分Fr.3.1～ Fr.3.8。組分Fr.3.2經(jīng)結(jié)晶和重結(jié)晶得化合物8(136.5 mg)；Fr.3.3經(jīng)過反復(fù)硅膠(200～ 300目)柱層析，石油醚-丙酮(25∶1～ 3∶1)、氯仿-甲醇(50∶1～5∶1)以及Sephadex LH-20凝膠氯仿-甲醇(6∶4)洗脫純化，最終得化合物3(15.1 mg)。組分Fr.3.4經(jīng)過反復(fù)硅膠 (200～ 300目)柱層析，石油醚-丙酮 (20∶1～ 3∶1)、氯仿-甲醇(30∶1～ 5∶1) 和半制備型HPLC分離，以乙腈-水(70∶30、60∶40)洗脫得化合物4(4.2 mg)、5(9.2 mg)、6(5.2 mg)；Fr.3.5經(jīng)過反復(fù)硅膠(200～ 300目)柱，石油醚-丙酮 (20∶1～1∶1)、氯仿-甲醇(30∶1～4∶1) 和半制備型HPLC分離，乙腈-水(60∶40)洗脫得化合物7(4.2 mg)；Fr.4 (16.5 g) 經(jīng)過反復(fù)硅膠 (200～ 300目)柱，石油醚-丙酮(20∶1～1∶1)、氯仿-甲醇(30∶1～ 2∶1) 以及Sephadex LH-20凝膠純化氯仿-甲醇(1∶1)，最后采用半制備型HPLC分離，以乙腈-水(60∶40)洗脫得化合物1(6.5 mg)、2(3.2 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:褐色油狀物 (CHCl3), 分子式C20H22O7，ESI-MSm/z: 374.1[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.89 (1H, s, H-2), 6.87 (1H, s, H-2′), 6.85 (1H, d,J=8.0 Hz, H-5), 6.76～6.82 (3H, m, H-5′, 6, 6′), 4.72 (1H, d,J=5.0 Hz, H-7′), 4.71 (1H, s, H-7), 4.43 (1H, dd,J=8.6,7.5 Hz, H-9′), 4.02 (1H, d,J=9.0 Hz, H-9), 3.85 (3H, s,3-OCH3), 3.83 (3H, s, 3′-OCH3)，3.05 (1H, m, H-8′);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 127.1 (C-1), 133.2 (C-1′), 109.6 (C-2), 109.2 (C-2′), 146.8 (C-3), 146.1 (C-3′), 146.0 (C-4), 158.2 (C-4′), 114.8 (C-5), 114.2 (C-5′), 119.8(C-6、6′), 88.2 (C-7), 86.1 (C-7′), 92.1 (C-8), 60.0 (C-8′), 75.0 (C-9), 71.5 (C-9′), 56.0 (3-OCH3, 3′-OCH3)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報道基本一致，故鑒定為8-羥基松脂醇。

化合物2：棕色油狀物(CHCl3), 分子式C20H22O6，ESI-MSm/z: 358.1[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.94 (2H, d,J=1.6 Hz, H-2, 2′), 6.90 (2H, d,J=8.2 Hz, H-5, 5′), 6.84 (2H, dd,J=8.2, 1.6 Hz, H-6, 6′), 4.78 (2H, d,J=4.3 Hz,H-7, 7′), 4.28 (2H, dd,J=7.0, 9.0 Hz,H-9, 9′), 3.94 (6H, s, 3, 3′-OCH3), 3.12 (2H, m, H-8, 8′)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 133.6 (C-1, 1′), 109.3 (C-2, 2′), 147.3 (C-3,3′), 145.7 (C-4, 4′), 115.1 (C-5, 5′), 119.6 (C-6, 6′), 86.4 (C-7, 7′), 55.9 (C-8, 8′), 72.3(C-9, 9′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報道基本一致，故鑒定為松脂醇。

化合物3:白色粉末(CHCl3), 分子式C30H50O2，ESI-MSm/z: 442.4[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 4.72(1H, brs, H-29a), 4.61 (1H, brs, H-29b), 3.55 (2H, d,J=10.7 Hz,H-28), 3.16 (1H, t,J=7.3 Hz, H-3), 2.39 (1H, d,J=10.7 Hz, H-19), 1.40 (2H, t, H-11), 0.94～1.34 (各3H, m, -CH3×5, H-23, 24, 25, 26, 27);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 40.9 (C-1), 27.6 (C-2), 79.3 (C-3), 39.8 (C-4), 55.8 (C-5), 69.3 (C-6), 42.5 (C-7), 40.6 (C-8), 51.4 (C-9), 36.9 (C-10), 21.5 (C-11), 25.8 (C-12), 36.8 (C-13), 43.3 (C-14), 27.7 (C-15), 33.7 (C-16), 47.9 (C-17), 48.9 (C-18), 47.7 (C-19), 150.5 (C-20), 29.9 (C-21), 29.9 (C-22), 27.9 (C-23), 17.9 (C-24), 18.2 (C-25), 17.3 (C-26), 15.8(C-27), 60.7 (C-28), 109.9 (C-29), 19.7(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報道基本一致，故鑒定為白樺脂醇。

化合物4: 白色粉末(CHCl3), 分子式C30H48O3，ESI-MSm/z: 456.4[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 4.96 (1H, d,J=3.2 Hz, Ha-29), 4.78 (1H, s, Hb-29), 3.47 (1H, t,J=8.2 Hz, H-3), 0.83～1.82 (各3H, s, -CH3×6, H-23, 24, 25, 26, 27, 30);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 39.4 (C-1), 28.4 (C-2), 78.2 (C-3), 39.6 (C-4), 56.1(C-5), 18.8 (C-6), 34.9 (C-7), 41.2 (C-8), 51.1 (C-9), 37.7 (C-10), 21.3 (C-11), 26.2 (C-12), 38.7 (C-13), 42.9 (C-14), 30.7 (C-15), 33.2 (C-16), 56.7 (C-17), 49.8 (C-18), 47.8 (C-19), 151.5 (C-20), 31.4 (C-21), 37.8 (C-22), 28.8 (C-23), 16.5 (C-24), 16.8 (C-25), 16.6 (C-26), 14.9 (C-27), 178.8 (C-28), 110.1 (C-29), 19.4 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報道基本一致，故鑒定為白樺脂酸。

化合物5: 白色粉末(CHCl3), 分子式C30H46O3，ESI-MSm/z: 454.3[H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 5.26 (1H, brs, H-12), 2.86 (1H, dd,J=4.0,13.5 Hz, H-18), 0.75～1.18 (各3H, s, -CH3×7, H-23, 24, 25, 26, 27, 29, 30)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 39.5 (C-1), 34.3 (C-2), 217.9 (C-3), 47.4 (C-4), 55.5 (C-5), 19.6 (C-6), 32.3 (C-7), 39.3 (C-8), 47.0 (C-9), 37.0 (C-10), 23.0 (C-11), 122.4 (C-12), 143.8 (C-13), 42.0 (C-14), 27.9 (C-15), 23.6 (C-16), 46.7 (C-17), 41.3 (C-18), 46.0 (C-19), 30.7 (C-20), 34.0 (C-21), 32.4 (C-22), 26.5 (C-23), 21.5 (C-24), 15.0 (C-25), 16.9 (C-26), 25.9 (C-27), 182.9 (C-28), 33.2 (C-29), 23.5 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報道基本一致，故鑒定為3-羰基齊墩果酸。

化合物6: 白色粉末(CHCl3), 分子式C30H46O4，ESI-MSm/z: 470.3[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.47 (1H, dd,J=3.2, 10.4 Hz, H-11), 5.61(1H, dd,J=1.8, 10.4 Hz, H-12), 3.67 (1H, t, H-2), 2.92 (1H, d,J=9.5 Hz, H-3), 0.78～1.03 (各3H, s, -CH3×6, H-23, 24, 25, 26, 27, 29, 30);13C-NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 47.7 (C-1), 69.5 (C-2), 84.5 (C-3), 38.9 (C-4), 56.3 (C-5), 19.5 (C-6), 34.2 (C-7), 40.5 (C-8), 55.7 (C-9), 37.2 (C-10), 127.0 (C-11), 126.3 (C-12), 136.6 (C-13), 41.8 (C-14), 26.3 (C-15), 41.5 (C-16), 51.4 (C-17), 135.6 (C-18), 38.3 (C-19), 43.3 (C-20), 33.6 (C-21), 30.7 (C-22), 28.9 (C-23), 17.4 (C-24), 19.6 (C-25), 16.9 (C-26), 24.6 (C-27), 178.9 (C-28), 23.8 (C-29), 32.8 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道基本一致, 故鑒定為脫氫山楂酸。

化合物7：白色粉末(CH3OH); 分子式C32H48O6，ESI-MSm/z: 528.4[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 4.52 (1H,m, H-23), 3.85 (1H, m, H-11), 2.83 (1H, d,J=8.4 Hz, H-24), 1.22 (3H, d,J=7.0 Hz, H-21), 0.92-1.43 (各3H, s, -CH3×7, H-18, 19, 26, 27, 28, 29, 30);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 31.5 (C-1), 33.9 (C-2), 218.9 (C-3), 47.4 (C-4), 48.7 (C-5), 20.5 (C-6), 35.1 (C-7), 40.4 (C-8), 49.4 (C-9), 37.5 (C-10), 70.1 (C-11), 36.2 (C-12), 176.5 (C-13), 49.8 (C-14), 46.1 (C-15), 207.5 (C-16), 138.5 (C-17), 23.5 (C-18), 25.9 (C-19), 27.0 (C-20), 20.5 (C-21), 35.7 (C-22), 72.3 (C-23), 65.1 (C-24), 58.9 (C-25), 20.2 (C-26), 24.8 (C-27), 29.9 (C-28), 19.7 (C-29), 23.4 (C-30), 169.8、21.7 (-COCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道基本一致, 故鑒定為澤瀉醇C-23-醋酸酯。

化合物8：白色針晶(CH3OH); 分子式C30H48O5，ESI-MSm/z: 488.3[M]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 5.12 (1H, s, H-12), 3.72 (1H, m,H-2), 2.68 (1H, dd,J=10, 4.2 Hz, H-3), 2.32 (1H, s, H-18), 0.84 (3H, d,J=4.2 Hz, H-30), 0.78 (3H, d,J=6.4 Hz, H-29), 0.64～1.26 (各3H, s, -CH3×7, H-23, 24, 25, 26, 27);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 46.9 (C-1), 67.3 (C-2), 82.6 (C-3), 39.2 (C-4), 55.0 (C-5), 18.4 (C-6), 32.9 (C-7), 40.6 (C-8), 47.2 (C-9), 38.0 (C-10), 23.6 (C-11), 126.9 (C-12), 138.8 (C-13), 41.7 (C-14), 28.3 (C-15), 25.4 (C-16), 47.2 (C-17), 53.4 (C-18), 71.9 (C-19), 41.4 (C-20), 26.2 (C-21), 37.5 (C-22), 29.3 (C-23), 16.5 (C-24), 16.8 (C-25), 17.4 (C-26), 24.2 (C-27), 177.9 (C-28), 26.8 (C-29), 16.2(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道基本一致。故鑒定為2α,19α-二羥基熊果酸。

化合物9：白色粉末(CHCl3); 分子式C30H50O2，ESI-MSm/z: 454.3[M]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 5.28 (1H, t,J=3.2 Hz，H-12), 0.88 (3H, d,J=6.9 Hz, H-30), 0.98 (3H, d,J=6.9 Hz, H-29), 0.91～1.14 (各3H, s, -CH3×5, H-23, 24, 25, 26, 27);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 39.7 (C-1), 34.3 (C-2), 217.8 (C-3), 47.6 (C-4), 55.3 (C-5), 19.8 (C-6), 32.9 (C-7), 39.6 (C-8), 46.9 (C-9), 36.9 (C-10), 23.6 (C-11), 125.8 (C-12), 138.3 (C-13), 42.6 (C-14), 28.2 (C-15), 24.3 (C-16), 48.2 (C-17), 52.9 (C-18), 39.4 (C-19), 38.9 (C-20), 30.9 (C-21),36.8 (C-22), 26.6 (C-23), 21.7 (C-24), 15.7 (C-25),17.2 (C-26), 23.6 (C-27), 181.9 (C-28), 17.2(C-29), 21.3 (C-30)。與文獻(xiàn)[12]報道的化合物數(shù)據(jù)一致, 故鑒定為烏索酸。

化合物10：白色粉末(CHCl3); 分子式C30H48O3，ESI-MSm/z: 456.4[M]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 12.08 (1H, s, -COOH), 5.21 (1H, t,J=3.2 Hz，H-12), 4.77 (1H,d,J=4.7 Hz, 3-OH), 3.34 (1H, m, H-3), 0.83 (3H, d,J=7.0 Hz, H-30), 0.94 (3H, d,J=7.0 Hz, H-29)，0.60～1.12 (各3H, s, -CH3×5, H-23, 24, 25, 26, 27);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 38.3 (C-1), 27.0 (C-2), 78.8 (C-3), 39.0 (C-4), 55.7 (C-5), 18.0 (C-6), 32.7 (C-7), 40.6 (C-8),47.7 (C-9), 36.3 (C-10), 22.9 (C-11), 124.5 (C-12), 138.8 (C-13), 42.6 (C-14), 27.5 (C-15), 23.8 (C-16), 47.9 (C-17), 52.8 (C-18), 38.9 (C-19), 38.4 (C-20), 30.2 (C-21), 36.5 (C-22), 28.3 (C-23), 15.3 (C-24), 16.1 (C-25), 17.1 (C-26), 23.3 (C-27), 181.3 (C-28), 16.9 (C-29), 21.1 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致,故鑒定為熊果酸。

化合物11：白色粉末(CHCl3); 分子式C31H50O4，ESI-MSm/z: 486.4[M]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 4.96 (1H, s, Ha-31), 4.82 (1H, s, Hb-31), 3.61 (1H, dd,J=6.0, 8.0 Hz, H-16), 3.43 (1H, dd,J=7.5, 8.5 Hz, H-3), 2.95 (1H, m, H-20), 0.95 (3H, d,J=7.0 Hz, CH3-26), 0.97(3H, d,J=7.0 Hz, CH3-27),1.02～1.43 (各3H, s, -CH3×5, H-18, 19, 28, 29, 30);13C-NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 36.0 (C-1), 28.9(C-2), 78.4 (C-3), 39.8 (C-4), 51.3 (C-5), 18.9 (C-6), 27.4 (C-7), 135.1 (C-8),135.4 (C-9), 37.7 (C-10), 21.0 (C-11), 29.7 (C-12), 46.7 (C-13),49.3 (C-14), 43.9 (C-15), 76.9 (C-16), 57.5 (C-17), 17.9 (C-18), 19.4 (C-19), 48.9(C-20), 178.9 (C-21), 31.7 (C-22), 33.6 (C-23), 156.2 (C-24), 34.4 (C-25), 22.1 (C-26), 21.8 (C-27), 28.8 (C-28), 16.5 (C-29), 25.7 (C-30), 107.3 (C-31)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道基本一致, 故鑒定為土莫酸。

化合物12:白色粉末(CHCl3); 分子式C33H52O5，ESI-MSm/z: 528.4[M]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 4.81 (1H, s, Ha-31), 4.79(1H, s, Hb-31), 4.45 (1H, dd,J=7.5, 8.5 Hz, H-3), 3.98 (1H, dd,J=6.0, 8.0 Hz, H-16), 2.33 (1H, m, H-20), 2.06 (3H, s, -COCH3), 0.98 (3H, d,J=6.4 Hz, H-27), 0.97 (3H, d,J=6.4 Hz, H-26), 0.76～1.13 (各3H, s, -CH3×5, H-18, 19, 28, 29, 30);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 35.5 (C-1), 24.8 (C-2), 80.6 (C-3), 38.3 (C-4), 51.7 (C-5), 18.7 (C-6), 26.9 (C-7), 135.6 (C-8), 135.9 (C-9), 37.4 (C-10), 21.2 (C-11), 29.9 (C-12), 46.8 (C-13),48.8 (C-14), 43.9 (C-15), 77.4 (C-16), 58.2 (C-17), 18.1 (C-18), 19.4 (C-19), 48.7 (C-20), 179.2 (C-21), 32.0 (C-22), 33.5 (C-23), 156.3 (C-24), 34.3(C-25), 22.4 (C-26), 22.1 (C-27), 28.2 (C-28), 17.1 (C-29), 25.9 (C-30), 107.6 (C-31), 21.5 (-COCH3), 170.6 (-COCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道基本一致, 故鑒定為茯苓酸。

4 討論

本研究從茯神所抱松根中分離得到12個化合物，木質(zhì)素類2個和三萜類8個。木質(zhì)素化合物1～2可能直接來源于松樹本身[16]，化合物3～12均為三萜類，其中9～12可能來源于在松根內(nèi)生長和殘留茯苓菌絲[15, 17]，化合物3～8具體來源有待進(jìn)一步研究。茯苓主要含有的化學(xué)成分是多糖類、三萜類、甾醇類等, 在茯神所抱松根內(nèi)三萜的含量遠(yuǎn)高于白茯苓的三萜，三萜類成分可能為茯神功效區(qū)別于茯苓的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，茯神三萜類物質(zhì)類型和功效有待于進(jìn)一步開發(fā)。