生物酶法提取中草藥活性成分研究進(jìn)展

張 艷，黃寶銀，劉雪松，尹珺伊，唐 偉，郝敬友，史同瑞*

(1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005；2. 哈爾濱綠達(dá)生動物藥業(yè)有限公司，哈爾濱 150039)

中草藥不僅具有良好的藥效作用，而且還具有毒副作用小，毒害物質(zhì)殘留低等優(yōu)點(diǎn)，在飼料“禁抗”的大背景下中草藥應(yīng)用前景尤為廣闊。中草藥的有效活性成分較為復(fù)雜，而且大多包裹在中草藥植物細(xì)胞內(nèi)，為了提高療效，減小使用劑量，便于臨床的應(yīng)用，常需要對中草藥的活性成分進(jìn)行提取純化。中藥活性成分提取有著久遠(yuǎn)的歷史，傳統(tǒng)的提取方法包括冷浸漬法、煎煮法、溶劑分離法、沉淀法、鹽析法、溶劑萃取法、透析法及結(jié)晶法等[1]。然而這些提取方法不同程度地存在著中藥提取時間長，溶劑消耗大，提取效率低，工藝流程繁雜，提取成本高等缺點(diǎn)，為此，人們一直在探求更為理想的中藥提取方法。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些新興的現(xiàn)代中藥提取方法不斷涌現(xiàn)，并逐步克服了傳統(tǒng)提取方法的缺點(diǎn)。新興的現(xiàn)代中藥提取方法包括：半仿生提取法、酶提取法、超臨界流體萃取法、微波萃取法、超聲波提取法、常溫超高壓提取法、組織破碎提取法及超聲波提取法等[2]。酶提取法是相伴酶工程技術(shù)的發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生的，也是一項(xiàng)中草藥有效成分提取的生物工程技術(shù)。酶提取法起始于20世紀(jì)90年代中期，經(jīng)過多年發(fā)展現(xiàn)已取得了較好的試驗(yàn)效果[3-4]。酶提取法是根據(jù)提取中藥的類別、藥用部位及提取成分，選用適宜的生物酶，通過溫和的酶解反應(yīng)，將中草藥細(xì)胞壁破裂降解，從而促進(jìn)有效成分的游離釋放的方法[5]。該方法提取率高，工藝簡便易行，是一種較有發(fā)展?jié)摿Φ闹兴幪崛》椒ā?/p>

1 酶提取方法概述

1.1 酶提取法的基本原理 中草藥的有效活性成分大多存在于中草藥植物細(xì)胞的胞質(zhì)中，如若提取分離中草藥的有效成分，就要將有效成分從細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)中釋放到提取的溶劑中，這就要求應(yīng)將中草藥細(xì)胞壁破裂降解，去除活性成分釋放阻礙。由于中草藥的細(xì)胞壁多是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、木質(zhì)素等物質(zhì)構(gòu)成的致密結(jié)構(gòu)，在提取中草藥的有效成分過程中，有效成分?jǐn)U散至提取介質(zhì)中就必須克服細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的雙重阻力。一些生物酶，如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等，具有相應(yīng)的生物降解作用，能夠作用于中草藥的細(xì)胞壁，使細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)降解，從而破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞壁、細(xì)胞間質(zhì)等屏障的通透性，促進(jìn)有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)中擴(kuò)散，從而實(shí)現(xiàn)最大限度地從中草藥中提取有效活性成分。

1.2 酶類選擇依據(jù) 生物酶的反應(yīng)具有高度的專一性，不同酶類只能降解相應(yīng)的物質(zhì)成分，因此，酶類選擇直接影響著中草藥的提取效果。不同類別的中草藥其藥用部位也有較大差異，根據(jù)有效成分的含量，可選用中草藥的根、莖、葉、花或果實(shí)等部位，中草藥藥用部位的不同，其構(gòu)成、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和有效成分也存在較大差異，因此，酶類選擇要依據(jù)中草藥種類、藥用部位，以及藥用成分進(jìn)行綜合考量。

由于多數(shù)中草藥一般選用其根、莖部分，而根莖細(xì)胞主要是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)構(gòu)成，因此，在酶提方法中現(xiàn)在采用的酶類主要是纖維素酶和果膠酶，其次是蛋白酶。纖維素酶、果膠酶，以及各種蛋白酶可以選擇性地破壞植物細(xì)胞壁，有利于多糖、生物堿、皂苷、黃酮、萜類、揮發(fā)油、蛋白質(zhì)及有機(jī)酸等多種生物活性成分的提取[6]。為最大限度的提取中草藥有效成分，降低生產(chǎn)成本，依據(jù)藥用部位的構(gòu)成，可選用復(fù)合酶進(jìn)行提取[7]。如用纖維素酶提取側(cè)柏葉中的總黃酮；用葡萄糖苷酶或轉(zhuǎn)糖苷酶提取銀杏葉總黃酮；用纖維素酶、果膠酶復(fù)合酶提取姜黃中的姜黃素；用纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶組成的復(fù)合酶提取藥用菌多糖[8]。

1.3 酶提法的優(yōu)缺點(diǎn) 與中草藥其他提取方法比較，酶提法具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用酶提法可以降解包裹中草藥活性成分的纖維素、膠質(zhì)等物質(zhì)，破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，使有效成分充分暴露，有利于有效成分的釋放，最大限度提取有效成分，所以該方法具有提取率高的優(yōu)點(diǎn)[9]；由于酶反應(yīng)具有專一性高、作用條件溫和、催化活性強(qiáng)等特點(diǎn)[10]，因此，應(yīng)用生物酶法提取中藥其提取條件較為溫和，工藝簡便，無毒物殘留等特點(diǎn)，這些優(yōu)勢造就了該方法的應(yīng)用潛力。

生物酶提取中藥方法也存在一定的局限性。酶的主要成分是蛋白質(zhì)，對熱、酸堿值等因素較為敏感，易變性失去活性。此外，酶促反應(yīng)與反應(yīng)溫度、介質(zhì)pH值、底物成分等因素密切相關(guān)，且最適范圍條件苛刻，因此，在應(yīng)用酶提法提取中藥成分時，篩選優(yōu)化酶解提取工藝尤為重要，并且需要嚴(yán)控提取條件，只有這樣才能充分發(fā)揮酶的活性。酶解法提取中藥過程中，有可能改變中藥的某些活性成分，并產(chǎn)生新的化學(xué)物質(zhì)，因此，應(yīng)對提取成分進(jìn)行分析，研判對中藥成分的影響，以確保提取效果。有報道證實(shí)，在利用纖維素酶提取中藥黃芩時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)纖維素酶酶解后，黃芩苷提取率下降，究其原因可能是纖維素酶在提取過程中水解了黃芩苷，致使黃芩苷提取率降低[11]。

2 酶法提取中藥工藝

酶活性的發(fā)揮與酸堿度、反應(yīng)介質(zhì)溫度、酶的濃度及酶解作用時間等因素有關(guān)。在應(yīng)用酶法提取中藥成分時，應(yīng)根據(jù)中草藥藥用部位、提取的中藥成分、酶類等條件，篩選反應(yīng)介質(zhì)的pH值、反應(yīng)溫度、酶濃度及酶解作用時間，優(yōu)化制定中草藥酶提取工藝。

依據(jù)研究報道，在一般條件下纖維素酶水解纖維素的適宜反應(yīng)條件為：溫度50 ℃、pH 值4.5；果膠酶反應(yīng)的最適溫度為45～50 ℃，最適酸堿度為3.5～5.5。在應(yīng)用復(fù)合酶提取中藥時，因酶的性質(zhì)存在差異，其提取工藝就更為復(fù)雜。如用纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶提取姜黃中姜黃素時，最佳酶提工藝為：纖維素酶與果膠酶等量配比，酶的濃度為0.35 mg/mL，反應(yīng)溫度50 ℃，pH值4.5，作用時間2 h，此條件下姜黃素收率提高了8.1%；應(yīng)用復(fù)合酶提取山楂葉總黃酮時，纖維素酶與果膠酶的最佳酶配比為2∶1，最適酶解溫度為50 ℃，pH值4.5，酶解時間90 min；應(yīng)用纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶提取金銀花時，纖維素酶和果膠酶最佳配比為2∶1，最適反應(yīng)溫度為40～50 ℃，最適作用時間為3.5 h[12]。

3 酶提法應(yīng)用進(jìn)展

3.1 纖維素酶的應(yīng)用 中草藥細(xì)胞壁的主要成分多是由纖維素、半纖維素等組成的，利用纖維素酶水解中草藥細(xì)胞壁，有利于胞內(nèi)成分的溶出，提升活性成分收率。在利用酶提法提取中草藥，尤其是中草藥的根、莖藥用部分時，一般均使用纖維素酶進(jìn)行降解提取。

3.1.1 纖維素酶對不同類別活性成分提取的應(yīng)用研究進(jìn)展 鄭立穎等將黃芪分別用0.3%、0.4%和0.5%的纖維素酶預(yù)處理后，再用常規(guī)水提法提取活性成分。結(jié)果表明，在黃芪有效成分的提取過程中加入不同濃度的纖維素酶，能夠顯著提高黃芪甲苷和黃芪多糖的收率，其中，黃芪多糖的收率較對照組分別增加了314.8%、392.6%、342.6%，黃芪甲苷的收率分別增加了83.4%、61.8%、56.8%[13]。薛天樂等優(yōu)選了纖維素酶法提取響鈴草總黃酮的最佳工藝，應(yīng)用此方法響鈴草總黃酮提取率可達(dá)2.18%，比水煎法和乙醇回流法分別提高了87.9%和33.7%[14]。

3.1.2 纖維素酶對中藥復(fù)方制劑提取應(yīng)用研究的進(jìn)展 紀(jì)學(xué)慧等應(yīng)用纖維素酶提取法和超聲提取法提取補(bǔ)氣升血方藥中有效成分，利用小鼠酚紅排泌實(shí)驗(yàn)、炭粒廓清法實(shí)驗(yàn)計(jì)算炭粒廓清指數(shù)K值、吞噬指數(shù)α值，二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)比較試驗(yàn)小鼠的耳腫脹度，從而比較兩種方法提取中藥的藥效學(xué)差異。結(jié)果表明，應(yīng)用纖維素酶提取法提取的補(bǔ)氣升血方藥藥效優(yōu)于超聲提取法[15]。譚婷等研究紫葉小檗果小檗堿的提取條件影響的抑菌環(huán)境，研究表明纖維素酶提取工藝提取的小檗堿具有較強(qiáng)的抑菌活性，可用于食品防腐、農(nóng)業(yè)生物防治等領(lǐng)域[16]。涂明鋒[17]等的研究也說明纖維素酶提取法的提取效果更為理想。

3.2 果膠酶的應(yīng)用 果膠酶是一類能夠分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱。果膠質(zhì)廣泛存在于中草藥的初生壁和細(xì)胞中，當(dāng)果膠質(zhì)降解時會導(dǎo)致中草藥細(xì)胞的分離破解。在中草藥成分提取過程中，加入果膠酶能夠降解果膠成分，破除中草藥細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性，使細(xì)胞內(nèi)的活性物質(zhì)充分釋放，有效地提高有效成分的提取率[18]。

3.2.1 果膠酶對不同類別活性成分提取的應(yīng)用研究進(jìn)展 藍(lán)峻峰等以蒸餾水為提取溶媒，以黃酮提取率為考核指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)考察提取溫度、反應(yīng)介質(zhì)pH值、料液比、果膠酶濃度和提取時間對葉下珠黃酮提取率的影響，結(jié)果最佳提取工藝為：以pH值5的蒸餾水為提取溶媒，料液比1∶30(W/V)，果膠酶濃度為2.0 g/L，酶解溫度55 ℃，酶解時間150 min的提取工藝條件下，黃酮提取率較高，達(dá)到1.469%[19]。鄭虎哲等研究發(fā)現(xiàn)，果膠酶釋放總多酚類物質(zhì)的最佳反應(yīng)條件是溫度為37 ℃。pH 3.6，酶/基質(zhì)比例為12 %，反應(yīng)時間為11 h。在此條件下，總多酚類物質(zhì)和總黃酮類物質(zhì)含量分別達(dá)到9.08 g/kg和1.38 g/kg，比對照組分別 提高1.3倍和1.5倍。

3.2.2 果膠酶對中藥復(fù)方制劑提取應(yīng)用研究的進(jìn)展 Fu等采用果膠酶等酶制劑水解木豆葉的細(xì)胞壁促使木犀草素和芹菜苷配基從中釋放出來，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果膠酶提取木犀草素和芹菜苷配基的產(chǎn)率明顯高于纖維素和β-葡萄糖苷[20]。

3.3 復(fù)合酶的應(yīng)用 中草藥細(xì)胞壁多由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)等不同成分構(gòu)成，為充分提取中藥有效成分，可使用不同類別的酶類分別降解相應(yīng)的中草藥細(xì)胞成分。使用纖維素酶可降解纖維素、半纖維素，促使中草藥細(xì)胞破裂，果膠酶可將果膠質(zhì)進(jìn)行有效水解，兩種酶相互作用，能夠有效提高中草藥有效成分的提取率。目前，應(yīng)用復(fù)合酶提取中草藥一般采用分步降解或一步降解方式進(jìn)行提取。

3.3.1 復(fù)合酶對不同類別活性成分提取的應(yīng)用研究進(jìn)展 藍(lán)峻峰等以水為提取溶劑，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，采用一步法提取中藥成分。最終優(yōu)化的最佳提取工藝為：提取時間2 h，料液比1∶25(g∶mL)，提取溫度40 ℃，復(fù)合酶濃度分別為纖維素酶1.4 g/L，果膠酶2.0 g/L，在此提取工藝條件下黃酮的提取率為1.589%[21]。香菇細(xì)胞壁由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和纖維素等構(gòu)成。使用纖維素酶和蛋白酶水解，能夠提高了香菇多糖等有效成分的提取率，同時使大部分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成更易吸收的肽。王志民等采用二次酶解方法，應(yīng)用0.15%纖維素酶在45 ℃、pH 4.4條件下處理香菇4 h，可溶性固形物和多糖的提取率分別為水煮法的3.61倍和2.37倍。應(yīng)用蛋白酶水解最適條件：溫度50 ℃，pH值7.0，酶濃度0.25%，水解時間5 h，香菇蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成可溶性肽，蛋白質(zhì)回收率達(dá)89.6%[22]。丁霄霄等采用復(fù)合酶法提取靈芝多糖，最佳工藝提取條件下靈芝多糖的提取率可達(dá)3.73%[23]。王小艷等采用復(fù)合酶法提取余甘子多酚類化合物，總多酚提取率為13.68%，可以看出酶法提取操作簡單可行，優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑提取法[24]。段紅梅等研究纖維素酶-果膠酶復(fù)合酶法提取長白楤木根中總黃酮的最佳工藝，此方法下提取出的總黃酮提取率高，并且所提取的總黃酮具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力[25]。

3.3.2 復(fù)合酶對中藥復(fù)方制劑提取應(yīng)用研究的進(jìn)展 張謙等以可產(chǎn)生木聚糖酶、纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶、淀粉酶及脂肪酶的益生枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，對加味白頭翁散進(jìn)行發(fā)酵，并檢測其發(fā)酵前后有效成分的差異,檢測發(fā)酵產(chǎn)物的體外抑菌效果，結(jié)果顯示，發(fā)酵后加味白頭翁散原有成分及含量發(fā)生了變化，一些原有成分消失，同時也產(chǎn)生了新的分子物質(zhì)并且對大腸桿菌有明顯的的體外抑制效果[26]。張彩云等研究了纖維素酶對催乳復(fù)方中藥有效成分總黃酮和總皂苷提取率的影響，結(jié)果表明，纖維素酶可顯著提高總黃酮和總皂苷的提取量[27]。

4 展 望

縱觀中草藥提取方法，酶解提取方法具有酶用量少，無毒無害，無污染等優(yōu)點(diǎn)，是一種綠色提取生產(chǎn)工藝。然而，作為中藥提取的一種新途徑，在一些技術(shù)方面，諸如提取藥液中殘留酶的分離去除方法以及酶具有不穩(wěn)定性，在提取過程中某些物質(zhì)能夠使酶的活性降低，成為酶的抑制劑，阻礙酶的催化作用，影響中藥提取。未來，生物酶提取技術(shù)廣泛應(yīng)用于中藥以及復(fù)方制劑還需要加強(qiáng)其基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，篩選更多的產(chǎn)酶微生物品種，建立中藥提取過程中酶功能的快速評價體系，制訂針對適合不同中藥的專屬酶類依據(jù)，建立中藥提取液中藥物殘留酶檢測標(biāo)準(zhǔn)等。隨著酶提中藥研究的深入與完善，酶提方法必將成為具有廣闊應(yīng)用前景的中藥提取方法。