QuEChERS-dSPE-UPLC-MS/MS篩查中藥材地龍中41種獸藥殘留

許曉輝，王小喬*，黨子龍，朱仁愿，張虹艷，李晨曦，潘秀麗，李 赟

(1.蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，蘭州 730050; 2. 蘭州大學第一醫(yī)院藥劑科，蘭州 730000)

中藥材分為植物源性中藥材和動物源性中藥材，動物源性中藥材是指動物整體、器官、生理或病理產物等供藥用的部分?！吨袊幍洹?020年版收載了55種動物源性中藥材，常見的有麝香、牛黃、地龍、海螵蛸、鹿角等[1-3]。然而，多數(shù)動物源性中藥材大多數(shù)是以農戶為單位人工養(yǎng)殖，在養(yǎng)殖過程中，缺乏對中藥材外源性風險因子的認識，使用抗菌劑、抗生素和激素等獸藥用于動物疾病防治、促進生長發(fā)育和提高飼料轉化率。不合理使用獸藥使藥物在動物體內難以排泄，逐漸積累，患者通過服用中藥材致使獸藥轉移到體內，對人體器官造成危害，嚴重威脅到身體健康和生命安全。目前，動物源性產品獸藥殘留已成為全球關注的焦點，為保護公眾健康，大多數(shù)國家和地區(qū)對動物源性產品中獸藥殘留進行監(jiān)管，并發(fā)布了相關法規(guī)制度。我國農業(yè)農村部、國家衛(wèi)生健康委員會和國家市場監(jiān)督管理總局在2019年聯(lián)合發(fā)布了《GB 31650-2019 食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》[4]，該標準規(guī)定了動物源性食品中獸藥殘留的最大限值，但不涉及動物源性中藥材；US FDA于2015年6月通過獸藥飼料指令頒布了管控微生物藥物使用的法規(guī)[5]；歐盟頒布了法規(guī)2014/0247(COD)，旨在達成影響評估所確定的目標，并解決抗生素耐藥性帶來的公共健康風險問題[6]。從國家監(jiān)管部門對動物源性食品中獸藥殘留的市場監(jiān)督抽檢結果來看，獸藥殘留仍是影響動物源性食品質量安全的重要風險因子[7]，因此，對于與動物源性食品來源相似的動物源性中藥材，同樣存在獸藥殘留問題。近年來，多類別多殘留分析方法因為可以擴大檢測范圍并提高實驗室效率而在檢測中越來越受青睞[8-10]，因此，本文建立了一種超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質譜法測定地龍中多類別多組分獸藥殘留的方法，根據化合物質譜響應、峰型以及加標回收率，淘汰不出峰、響應低及加標回收率不理想的獸藥，最終篩選出適合本方法良好測定的7大類41種獸藥，測定項目涉及到磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類、抗病毒類、糖皮質激素類、非甾體抗炎類和鎮(zhèn)靜安眠類。

1 材料與方法

1.1 儀器 1290-6460超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源(美國安捷倫有限公司)；分析天平：感量0.1 mg和0.01 g(梅特勒)；真空泵(天津市津騰實驗設備有限公司)；移液器：20 μL、100 μL、1 mL(德國Eppendorf公司)；渦旋混合器(美國Scientific)；離心機(德國Eppendorf公司)；超聲波清洗器(寧波新芝有限公司)；容量瓶(天玻儀器有限公司)。

1.2 試劑 超純水(美國Millipore公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)，甲酸、乙酸銨(色譜純，東京化成工業(yè)株式會社)；dSPE EMR-Lipid凈化管(美國安捷倫公司)；氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司); 硫酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸氫二鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；檸檬酸(國藥集團化學試劑有限公司)。對照品，恩諾沙星、地美硝唑、磺胺甲惡唑、磺胺氯噠嗪、磺胺喹沙啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、金剛烷胺均購于Dr.Ehrenstorfer GmbH，環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、地塞米松、可的松、曲安奈德、氟米松、甲硝唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧芐啶、保泰松、吲哚美辛、吡羅昔康、氨基比林、三唑侖、硝西泮、勞拉西泮、馬來酸咪達唑侖、阿普唑侖、氯硝西泮、艾司唑侖、奧沙西泮、地西泮均購自中國食品藥品檢定研究院，洛硝噠唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑購自WITEGA，沙拉沙星、磺胺間甲氧嘧啶均購自Bepure，金剛乙胺購自TRC，具體信息見表1。供試樣品購買于中藥材市場和藥店。

表1 對照品信息

1.3 溶液制備

1.3.1 EDTA緩沖液制備 檸檬酸8.4 g，磷酸氫二鈉7.1 g，乙二胺四乙酸二鈉 19.5 g，溶于650 mL水中，超聲溶解，即得。

1.3.2 對照溶液制備 標準儲備溶液：精密稱取41種獸藥殘留對照品10.0 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解，并定容至刻度，配制成濃度為 1 mg/mL的儲備液，置 4 ℃冷藏備用?；旌蠘藴手虚g溶液：分別準確吸取上述標準儲備溶液0.025 mL至25 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋，并定容至刻度，配制成濃度為 1 μg/mL的混合標準中間液，置 4 ℃冷藏備用。混合標準使用溶液：準確移取上述混合標準中間溶液1.00 mL置于10 mL棕色容量瓶，用乙腈稀釋，并定容至刻度，配制成濃度為 100 ng/mL的混合標準使用溶液。

1.3.3 陰性樣品溶液的制備 取空白樣品按照“1.4.1供試樣品前處理方法”步驟同法制成空白基質樣品溶液。

1.4 實驗方法

1.4.1 供試樣品前處理方法 提?。簻蚀_稱取干燥的供試樣品1.00 g于50 mL離心管中，加入3 mL EDTA緩沖液和陶瓷均質子，渦旋1 min，準確加入10 mL乙腈，渦旋1 min，超聲提取5 min，加入1 g 氯化鈉和4 g 硫酸鈉，充分渦旋2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液待凈化。凈化：準確吸取提取步驟所得上清液2.00 mL于 dSPE EMR-Lipid凈化管中，渦旋1 min，5 000 r/min離心10 min，取上層清液過0.22 μm濾膜至進樣瓶中，上液質聯(lián)用儀測定。

1.4.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITY BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流動相：A為含0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨的水溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

1.4.3 質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，動態(tài)多反應監(jiān)測(d-MRM)，霧化氣N2，干燥氣流速8 L/min，噴霧電壓500 V，氣流溫度325 ℃，毛細管電壓4000V，鞘氣流速12 L/min，鞘氣溫度350 ℃；質譜條件見表3。

表3 41種獸藥的質譜參數(shù)

1.5 數(shù)據處理 采用 Agilent MassHunter 工作站軟件進行數(shù)據采集和分析，采用Excel進行數(shù)據統(tǒng)計與計算。

2 結果與分析

2.1 前處理條件選擇 本實驗考察的獸藥包括親水性和疏水性藥物，酸性、中性和堿性藥物，這些藥物在適宜的濃度大部分能夠在甲醇和乙腈中溶解，另一方面，流動相的有機相一般都是甲醇和乙腈，考慮到乙腈為中等極性溶劑，與大多數(shù)被測化合物極性接近，且乙腈能使蛋白質變性沉淀，因此選擇乙腈作為提取溶劑。QuEChERS萃取鹽包，內含 4 g 硫酸鈉和1 g 氯化鈉，通過鹽析使樣品中蛋白質沉淀并能去除極性干擾物。dSPE EMR-Lipid 選擇性去除高脂肪基質中主要脂類組分，能夠降低基質效應以增強質譜響應，同時有助于延長色譜柱使用壽命，同時無需活化、清洗和洗脫等傳統(tǒng)SPE步驟，簡化了凈化流程，節(jié)約了時間和成本。因此本實驗選擇使用QuEChERS萃取鹽包提取，dSPE EMR-Lipid 凈化。

2.2 色譜質譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜條件優(yōu)化 本實驗被分析的獸藥之間化學性質各異、極性不一，因此，選擇了適用于各種分析物通用的ACQUITY BEH C18超高效色譜柱。正離子模式下，在流動相中添加甲酸能夠提高目標化合物的離子化效率，添加乙酸銨能夠穩(wěn)定水相和改善峰型，因此試驗將乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨、水溶液進行組合，考察分離效果和靈敏度，選擇最佳流動相體系。結果表明，在水相中加入0.1%甲酸和2 mmol/L乙酸銨可以顯著改善峰型、提高靈敏度，在有機相中加入0.1%甲酸可以穩(wěn)定保留時間，提高重復性。最終本實驗采用含0.1%甲酸-2 mmol乙酸銨的水溶液與含0.1%甲酸的乙腈溶液作為流動相。

2.2.2 質譜條件優(yōu)化 由于被分析獸藥種類眾多，采用MRM采集模式，受循環(huán)時間限，有些獸藥響應低，因此，本研究選擇將檢測獸藥分別配制成單個標準溶液，直接注入質譜儀，在正離子模式下，進行Scan掃描，確定母離子，后進行SIM掃描，選取豐度比最高且相對穩(wěn)定的2個碎片離子分別作為定性離子和定量離子，然后利用MassHunter采集軟件，以手動和自動兩種方式同時優(yōu)化定性和定量離子的碰撞能量、裂解電壓等參數(shù)，建立MRM方法，為了建立d-MRM方法，首先在MRM方法下分析混合標樣，得到混合標樣數(shù)據文件，將該采集數(shù)據文件從安捷倫的MassHunter質譜采集工作站軟件導入自動生成d-MRM方法，生成的d-MRM方法包含化合物名稱、MRM離子對、碎裂電壓、碰撞能量、動態(tài)MRM的保留時間和保留時間增量窗口，對于軟件不能自動識別保留時間及保留時間增量窗口的化合物，在安捷倫定性軟件通過提取化合物的離子對手動識別。

2.3 基質效應 基質效應是基質中除目標物以外的其他成分對目標物分析的影響。由于其成分與目標組分在離子化過程中存在競爭，改變了目標物的電離效率，使目標物的離子響應強度降低或增強，從而影響分析結果的準確性。本文通過考察空白樣品基質中標準溶液的信號強度與純溶劑中相同濃度標準溶液信號強度的比值來評價基質效應。結果顯示，大部分獸藥存在不同程度的基質效應，其中氨基比林、保泰松、羥基甲硝唑、氯硝西泮、諾氟沙星、洛美沙星、硝西泮存在較強的基質抑制效應，檢測響應信號比較弱，而濃度為200 ng/mL的四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素樣品基質溶液在質譜上幾乎沒有響應。

2.4 41種獸藥的總離子流圖 以d-MRM 模式測定41種獸藥的定性和定量離子對色譜圖，共有82個離子監(jiān)測通道。圖1是濃度為30 ng/mL的混合標準品的總離子流圖，各個化合物峰形對稱，響應良好，定量準確可靠。

圖1 41種獸藥標準品MRM總離子流圖

2.5 線性關系、檢出限、定量限 取混合標準使用溶液用空白樣品基質溶液稀釋配制成標準曲線點溶液，外標法定量，以X軸為濃度，Y軸為峰面積的響應值，得到各個獸藥的線性回歸方程，用于計算實際樣品中待測物的濃度。取陰性樣品，混合標準使用溶液通過最小添加量，按“1.4.1”項下供試樣品前處理方法同法處理后上機進樣測試，以3 倍信噪比計算各個被分析獸藥的檢出限(LOD)，以10倍信噪比計算各個被分析獸藥的定量限(LOQ)。41種獸藥的線性關系、檢出限、定量限見表4。結果顯示，41種獸藥在各自范圍內線性關系良好(R2>0.9917)，檢出限范圍為0.1000～3.105 μg/kg，定量限范圍為0.3148～7.532 μg/kg。

表4 41種獸藥的線性關系、檢出限、定量限、回收率及精密度(n=3)

2.6 回收率及精密度考察 在空白地龍樣品中分別添加混合標準中間溶液，低、中、高3個加標量分別為30.0、80.0、200.0 μg/kg，每個添加水平平行制備3份樣，每份樣重復測定3次，經提取凈化后進行測定，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。結果顯示，41種獸藥的回收率為62.8% ～ 112.3%，精密度為1.1% ～ 8.9%。結果表明，該方法的準確度良好，符合定量檢測要求。

2.7 樣品的測定 為驗證方法的可行性，將市售的10批地龍樣品作為測試樣品，應用該方法測定樣品中7大類41種獸藥殘留，均未檢出上述被分析目標化合物。

3 討論與結論

動物源性中藥材富含蛋白質和脂肪，測定獸藥殘留時，蛋白質和脂肪去除不干凈或不徹底會產生基質效應，甚至會堵塞色譜柱，因此，前處理方法的選擇是此類樣品測試的關鍵。同時，動物在養(yǎng)殖整個生命周期中，不僅是動物出現(xiàn)病患違規(guī)使用獸藥，而是將獸藥作為動物產品違法獲取經濟利益的促進劑，使用獸藥時多是一種藥物產生耐藥性后，便換成另一種，甚至多種藥物同時使用，因此，獸藥殘留檢測只測定一類藥物有可能漏檢，達不到全面評價動物源性中藥質量安全的目的。目前， 一針進樣同時測定多獸藥殘留是當前一個研究熱點，這樣可以節(jié)約成本、提高效率。本文采用QuEChERS、dSPE相結合的提取凈化方法，建立了超高效液相色譜串聯(lián)質譜法同時測定中藥材地龍中7大類41種獸藥殘留的方法。以儀器方法為基礎，結合地龍樣品基質的特點，從提取方法、凈化技術、色譜質譜條件等多個方面進行研究和優(yōu)化，對建立的方法進行了方法學考察，結果表明，該方法各項指標均能滿足分析檢測的要求，與目前報道的文獻和國家標準方法相比，該方法簡化了復雜的前處理，實現(xiàn)了多類別多組分獸藥殘留同時測定，提高了檢測效率，對動物源性中藥材中多類別多組分獸藥殘留分析監(jiān)測、快速篩查具有參考意義。