節(jié)肢動物外泌體的研究進(jìn)展

黃雅斌，周勇志，周金林

（1.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

1983年，Pan等[1-2]在綿羊紅細(xì)胞的上清液中發(fā)現(xiàn)一種由細(xì)胞主動分泌的囊泡樣小體。該囊泡樣小體大小均一，直徑為40～100 nm。Villa-Diaz等[2]將其命名為“exosomes”。外泌體是大多數(shù)細(xì)胞通過內(nèi)吞產(chǎn)生并且分泌的小膜囊泡[3]，是細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的磷脂納米載體，起著信號載體的作用[4]。外泌體能將一定數(shù)量的生物活性分子傳遞給特定的受體細(xì)胞，從而進(jìn)行細(xì)胞間的通訊[4]。外泌體最初被認(rèn)為是細(xì)胞碎片，因此不被人重視?，F(xiàn)在，外泌體越來越多地被認(rèn)為是調(diào)節(jié)多細(xì)胞生物生物學(xué)行為的納米載體[5]，不僅在干細(xì)胞再生[6]、組織修復(fù)[7]和免疫調(diào)節(jié)[8]等正 常生理過程中發(fā)揮重要作用，而且在幾種疾病的病理學(xué)中也發(fā)揮重要作用[9]。本文對節(jié)肢動物外泌體及其功能研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 外泌體的生物學(xué)特征

1.1 外泌體的形成細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞主動釋放的多種納米級膜囊泡的通稱[10]。細(xì)胞外囊泡（extracelluar vesicles，EVs）分成了三個廣泛的生物亞群：外泌體、微小囊泡和凋亡小體。微小囊泡和凋亡小體是通過細(xì)胞膜向外出芽和裂變產(chǎn)生的[9]。外泌體的形成過程比微小囊泡和凋亡小體更復(fù)雜。早期內(nèi)涵體在高爾基體的幫助下，首先積聚形成腔內(nèi)囊泡（intra luminal vesicle，ILVs），最后形成微小囊泡（multivesi-cularbodies，MVB）。MVB與細(xì)胞的質(zhì)膜融合，使囊泡以胞吐方式釋放到細(xì)胞外空間，形成大小均一、直徑為40～100 nm的外泌體。外泌體形成過程中伴隨著貨物分選過程，其中胞質(zhì)蛋白和RNA被募集到ILV中。這種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)過程有兩種機(jī)制：一種是涉及轉(zhuǎn)運(yùn)所需的內(nèi)體分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）依賴機(jī)制，另一種是非ESCRT依賴性機(jī)制[11]。這兩種機(jī)制的作用分為兩方面：ILV的形成和最終分泌的外泌體的分子組分。

1.2 外泌體的成分

1.2.1 蛋白質(zhì) 不同來源的外泌體雖然在內(nèi)部成分上有所不同，但它們在囊泡表面有共同的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，這些物質(zhì)使它們能夠被識別。幾乎所有細(xì)胞類型的外泌體都是來源于內(nèi)涵體，所以它們都含有Flotillin（參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合的蛋白質(zhì)）、Alix和TSG101（微小囊泡產(chǎn)生的相關(guān)蛋白）、HSP70和90（熱休克蛋白家族）、integrin（整合素）和CD63、CD9、CD81和CD82（四跨膜蛋白家族）。我們在許多外泌體囊泡表面的蛋白質(zhì)組中發(fā)現(xiàn)，雖然一些蛋白質(zhì)可能只反映細(xì)胞中蛋白質(zhì)的豐度，但是有些特異的蛋白質(zhì)可以被定義為外泌體標(biāo)記蛋白（如Alix、Flotillin、TSG101、CD63）[12-13]。蛋白質(zhì)進(jìn)入外泌體是通過胞內(nèi)體轉(zhuǎn)ESCRT依賴途徑和非依賴ESCRT兩種途徑，而Alix和TSG101的功能是輔助蛋白質(zhì)利用ESCRT途徑進(jìn)入外泌體[14-15]。有一些蛋白進(jìn)入外泌體的途徑并不是ESCRT依賴途徑，而是取決于四跨膜蛋白與胞質(zhì)蛋白，及其他的跨膜蛋白和脂類的相互作用。例如：金屬蛋白酶CD10進(jìn)入外泌體內(nèi)取決于CD9分子[16]。此外，四跨膜蛋白家族參與各種細(xì)胞的融合過程。CD9和CD81對精子和卵子與肌肉細(xì)胞之間的融合有著精準(zhǔn)的調(diào)控。CD63對單核細(xì)胞合成多核巨噬細(xì)胞這一過程有著正向調(diào)控作用，而CD9和CD81起負(fù)向調(diào)控作用[11]，從而說明四跨膜蛋白在細(xì)胞融合過程中發(fā)生的調(diào)節(jié)控制與細(xì)胞類型密切相關(guān)。熱休克蛋白HSP70和HSP90與抗原多肽可以形成復(fù)合物，進(jìn)而將抗原呈遞給主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC），讓抗原能夠發(fā)揮抗原呈遞作用[17]。

1.2.2 脂質(zhì) 外泌體脂質(zhì)的主要成分是鞘磷脂、卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些脂質(zhì)是維持外泌體形態(tài)的主要成分，也可作為信號分子參與各種細(xì)胞間的通訊[14]，調(diào)控外泌體的形成等[17]。

1.2.3 核酸 Va ladi等[12]發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞分泌的外泌體含有mRNA和miRNA，并首次證明外泌體中有核酸的存在。外泌體保護(hù)核酸，使RNA可以不被降解，這樣RNA在細(xì)胞間才能發(fā)揮通訊的作用。尿液的外泌體中的長鏈非編碼RNA可以成為診斷膀胱癌的標(biāo)志物[18]；miR-155通過外泌體從腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生促血管生成表型[19]。在最 新報道中，Bernard等[20]進(jìn)行了一項前瞻性的研究，發(fā)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的DNA（circulating tumor cells DNA，ctDNA）和外泌體里的DNA（exosome，exoDNA）在胰腺癌中的臨床應(yīng)用，得出外泌體中的DNA可用于預(yù)后分析。

2 外泌體的功能

外泌體因為自身體積小可以穿過機(jī)體的各種屏障，同時又因為缺乏免疫原性、克服天然屏障的能力和固有的細(xì)胞靶向性質(zhì)，所以與全細(xì)胞相比，EVs具有更好的體內(nèi)穩(wěn)定性，并且更易于加工和修改以用于特定應(yīng)用。同時EVs包裹的核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)都發(fā)揮著不同的功能。

3 節(jié)肢動物外泌體研究

節(jié)肢動物屬節(jié)肢動物門，該門類是動物界中最大的一類。節(jié)肢動物包括人們熟知的蝦、蠶、蚊、蠅、蜱、蜘蛛、蜈蚣以及千足蟲等。全世界約有120萬現(xiàn)存種，占整個現(xiàn)有動物種數(shù)的80%。節(jié)肢動物生活環(huán)境極其廣泛，無論是海水、淡水、土壤、空中都有它們的蹤跡。有些種類還寄生在其他動物的體內(nèi)或體外。因為節(jié)肢動物傳播的疾病是人類主要關(guān)注的傳染病之一，所以研究蚊子和蜱蟲這兩種生物是如何傳播疾病一直是研究的熱點(diǎn)。除了以上兩種生物以外，作為最早的生物模型—果蠅，一直是人們研究的最熱門的節(jié)肢動物。在遺傳、演化、病毒傳播等研究中都是常見的生物模型。

3.1 果蠅Corrigan等[21]發(fā)現(xiàn)雄性黑腹果蠅的生殖腺SC細(xì)胞（雄性果蠅成對的輔助腺體（AGs）中的一種上皮細(xì)胞類型，二級細(xì)胞）分泌的外泌體可以對骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號有選擇性地生長。BMP信號可以阻止雌性在交配結(jié)束后的快速再發(fā)情。但果蠅某些組織尺寸較小使得外泌體難以收集，AG體內(nèi)僅含有納升體積的分泌物，因此使用標(biāo)準(zhǔn)外泌體分離和分析技術(shù)是不切實際的，例如超速離心和納米深度跟蹤分析[25]。Gross等[22-24]通過使用遺傳和成像方法來測試SCs中特異性CD63的陽性斑點(diǎn)來研究外泌體的發(fā)生、分泌和提取。研究發(fā)現(xiàn)，SCs分泌的外泌體是在微小囊泡（multivesicular bodies，MVBs）中產(chǎn)生的。果蠅交配后，外泌體與精子融合并與雌性生殖道上皮細(xì)胞相互作用。外泌體的釋放是為了抑制雌性的再發(fā)情行為，這表明SCs分泌的外泌體是BMP信號的下游效應(yīng)物。事實上，當(dāng)SCs中BMP信號減弱時，MVBs中仍然會形成囊泡，但不會分泌為外泌體。這些結(jié)果證明了生殖系統(tǒng)中MVB-exosome通路有了新的功能，并且這個功能在整個進(jìn)化過程中似乎是保守的。外泌體可以裝載許多細(xì)胞成分，該研究結(jié)果為包括果蠅在內(nèi)的幾種昆蟲的AGs分泌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)提供了可能的解釋[26-27]。

Mamolen等[28]在果蠅外泌體結(jié)構(gòu)方面驗證了黑腹果蠅Dis3（dDis3）核糖核酸酶與外泌體復(fù)合物存在離子和疏水相互作用。Dziembowski等[29]在對ScDis3的觀察中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。有趣的是，該團(tuán)隊的數(shù)據(jù)還顯示Dis3通過其N末端與Rrp6（外泌體核酸酶亞基Rrp6）和核心外泌體蛋白相互作用[30]。Shibata等[31]證實了外泌體參與果蠅體內(nèi)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminases，TGs）的同種型TG-A的分泌途徑。在果蠅中TG基因通過可變剪接產(chǎn)生兩種mRNA變體：即TG-A和TG-B。該研究明確了TG-A被包含在血細(xì)胞的囊泡樣結(jié)構(gòu)中，同時表達(dá)TG-A的S2細(xì)胞也含有TG-A的囊泡樣結(jié)構(gòu)。研究提出當(dāng)細(xì)菌感染果蠅時，外泌體分泌的TG-A參與了細(xì)菌感染后的血淋巴凝固和病原體包繞。因此，TG-A可能通過交聯(lián)結(jié)晶素（果蠅TG的一種胞外底物）參與了包晶基質(zhì)的形成，以維持包晶基質(zhì)的通透性[31]。

3.2 蚊子Vora等[32]證實了蚊子細(xì)胞分泌的外泌體是病毒傳染給宿主的重要傳播媒介。登革病毒（Dengue virus，DENV）是一種通過蚊子傳播的黃病毒，在全球范圍內(nèi)引起人類登革熱，研究利用DENV2/DENV3病毒感染白紋伊蚊和埃及伊蚊（DENV的主要載體）的體外細(xì)胞系，使細(xì)胞分泌的胞外囊泡（EVs）含有感染性病毒的RNA和蛋白質(zhì)。低溫電子顯微鏡顯示，蚊子的EVs為30～250 nm。Vora等[32]通過實驗證實了被DENV2型病毒感染的白紋伊蚊和埃及伊蚊細(xì)胞分泌的EVs體內(nèi)有完整的DENV2基因。他們在蚊子細(xì)胞的外泌體中鑒定出了含有四跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域的糖蛋白—Tsp29Fb，并且發(fā)現(xiàn)Tsp29Fb與人的CD63（哺乳動物EV標(biāo)記物）是直系同源物。同時通過對蚊子基因組中Tsp29Fb的鑒定表明，Tsp29Fb可以作為節(jié)肢動物EV標(biāo)記蛋白。此外，qRT-PCR和免疫印跡結(jié)果顯示，感染性EVs中Tsp29Fb的表達(dá)上調(diào)了。免疫共沉淀和共聚焦結(jié)果都顯示了Tsp29Fb可以直接與DENV2型病毒的包膜蛋白（E蛋白）相互作用。該團(tuán)隊通過RNAi介導(dǎo)Tsp29Fb的沉默和抗體阻斷，發(fā)現(xiàn)可以減少蚊蟲細(xì)胞和細(xì)胞分泌的EVs中DENV2型病毒的含量。此外，在被DENV2型病毒感染的蚊子細(xì)胞中添加GW4869（外泌體釋放抑制劑），并用該細(xì)胞分泌的外泌體孵育人的幼稚C6/36細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，GW4869可以影響病毒的含量，進(jìn)而證明了Tsp29Fb與E蛋白的直接相互作用不僅是DENV2感染節(jié)肢動物所必需的，也是感染性EVs向人類宿主傳播所必需的。

3.3 蜱Zhou等[33]首次表明蜱的細(xì)胞系可以分泌細(xì)胞外囊泡（EVs）。該研究通過密度梯度離心技術(shù)[34]和差異超速離心技術(shù)分別離心出外泌體，在冷凍電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)了直徑為30～200 nm的囊泡，形態(tài)類似于從哺乳動物細(xì)胞中分離的外泌體[35]，并在蜱細(xì)胞分泌的外泌體中發(fā)現(xiàn)了HSP70蛋白。因為HSP70被認(rèn)為是哺乳動物外泌體的標(biāo)記蛋白，所以HSP70蛋白可以成為一種新的節(jié)肢動物外泌體標(biāo)記蛋白。研究使用Langat病毒（一種與蜱傳腦炎病毒密切相關(guān)的模型病原體）感染蜱蟲細(xì)胞，再收集被病毒感染后蜱蟲細(xì)胞分泌的外泌體。在感染性E Vs里發(fā)現(xiàn)E蛋白大量富集，證明了外泌體中病毒E蛋白的存在。作者認(rèn)為這些蛋白質(zhì)被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，然后通過與質(zhì)膜融合再循環(huán)回來。如果整個病毒顆粒是通過外泌體輸出，那么可以認(rèn)為蜱細(xì)胞分泌的外泌體中的直徑為40～60 nm的顆?？赡苁荓GTV病毒。研究證實了外泌體內(nèi)病毒的存在方式可能是以dsRNA的形式而不是LGTV的單鏈正鏈或負(fù)鏈。他們發(fā)現(xiàn)感染性EVs依賴網(wǎng)格蛋白的傳播，進(jìn)一步表明外泌體在病毒傳播方面起著重要的作用。值得注意的是，該團(tuán)隊在培養(yǎng)含有LGTV感染性RNA和蛋白質(zhì)的蜱細(xì)胞和宿主細(xì)胞時加入了GW4869抑制劑二鹽酸鹽水合物（抑制外泌體體內(nèi)中性鞘磷脂酶），然后收集細(xì)胞分泌的外泌體進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)該抑制劑可以顯著（P＜0．05）降低來自蜱和宿主神經(jīng)元細(xì)胞的外泌體中的LGTV。該抑制劑對本研究中使用的節(jié)肢動物和哺乳動物細(xì)胞的影響表明，在這些細(xì)胞中存在中性鞘磷脂酶，表明LGTV或其他蜱傳黃病毒是使用中性鞘磷脂酶或其相關(guān)途徑包裝到外泌體中?？傮w而言，這些研究揭示了黃病毒通過節(jié)肢動物外泌體從節(jié)肢動物載體傳播到宿主的新模式，可以將其設(shè)想為傳播阻斷策略。

3.4 其他節(jié)肢動物Nardi等[36]在對千足蟲的腸上皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，腸上皮細(xì)胞通過分泌的外泌體與肝細(xì)胞進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)的交換。在千足蟲中，來自中腸上皮的糖直接轉(zhuǎn)移到鄰近的肝細(xì)胞中儲存而不是通過血淋巴。營養(yǎng)源（中腸上皮）和營養(yǎng)儲存細(xì)胞（肝細(xì)胞）的這種緊密聯(lián)系是千足蟲的一個新特征。該團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)千足蟲的肝細(xì)胞和中腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜間的空間被大量小囊泡所占據(jù)，大小為30±50 nm。該測量結(jié)果與已發(fā)表的外泌體報告相匹配。說明是這些細(xì)胞外囊泡將來自中腸上的糖運(yùn)輸?shù)礁渭?xì)胞。這可能是千足蟲長壽的一個原因。

4 節(jié)肢動物外泌體研究的展望

在哺乳動物和人方面，外泌體的研究進(jìn)行的如火如荼，而在節(jié)肢動物方面對外泌體的研究剛剛起步。目前，從節(jié)肢動物外泌體研究的報道來看，外泌體在節(jié)肢動物生殖、傳播疾病、信號通路等方面具有重要功能，這為節(jié)肢動物基礎(chǔ)生物學(xué)和節(jié)肢動物傳播疾病的研究提供了新思路。

最近研究新發(fā)現(xiàn)了節(jié)肢動物外泌體標(biāo)記蛋白Tsp29Fb，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白可以介導(dǎo)病毒RNA和蛋白質(zhì)傳遞給宿主。

蜱是吸血的節(jié)肢動物外寄生蟲，可傳播眾多的病原體。外泌體的研究，特別是蜱的唾液腺中外泌體的研究可為了解蜱-病原-宿主三者的復(fù)雜關(guān)系提供新的途徑。