植物病原真菌尖孢鐮刀菌檢測與定量研究進(jìn)展

董 超， 方香玲

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室， 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院， 甘肅 蘭州 730020)

尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是一種土傳病原真菌，能引起植物枯萎病和根腐病[1]。該菌能侵染芭蕉科植物如香蕉(Musanana)、薔薇科植物如草莓(Fragariaananassa)、葫蘆科植物如西瓜(Citrulluslanatus)、十字花科植物如甘藍(lán)(Brassicaoleracea)、茄科植物如番茄(Lycopersiconesculentum)和豆科植物如苜蓿(Medicagosativa)等100多種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的作物[2-3]。尖孢鐮刀菌在植株根部維管束中定殖，導(dǎo)致導(dǎo)管堵塞，地上部分枯萎，根表皮產(chǎn)生褐色壞死斑，后期根部腐爛甚至整株植株死亡，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量以及品質(zhì)[4-8]。尖孢鐮刀菌侵染后會造成作物大面積的減產(chǎn)，如會引起西瓜減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重田塊可達(dá)50%～60%，甚至絕產(chǎn)；發(fā)病香蕉園病株率10%～40%，嚴(yán)重可達(dá)90%以上以至香蕉園荒棄；苜蓿被感染后產(chǎn)量下降20%～40%，嚴(yán)重地塊下降60%以上[9-12]。

目前關(guān)于尖孢鐮刀菌的研究主要集中在其對植物生長的影響、致病性相關(guān)基因表達(dá)、防治方法以及不同植物對尖孢鐮刀菌的抗病性和抗病機(jī)制等方面[13-16]，對尖孢鐮刀菌的定性檢測和定量分析是進(jìn)行這些研究的基礎(chǔ)。由于尖孢鐮刀菌是土傳病原菌，土壤中的尖孢鐮刀菌含量與病害的發(fā)生和嚴(yán)重程度相關(guān)。根際土壤是植物根周圍土壤的微域環(huán)境，是在理化性質(zhì)、生物特性上不同于原土體的特殊區(qū)域，根際土中尖孢鐮刀菌含量更直接關(guān)系到病害的發(fā)生和嚴(yán)重程度[17]。植物組織內(nèi)的尖孢鐮刀菌含量，與尖孢鐮刀菌的侵染程度相關(guān)。對植物根組織和土壤中的尖孢鐮刀菌進(jìn)行檢測和定量，有助于監(jiān)測田間病害的發(fā)生，從而減小經(jīng)濟(jì)損失。本文對培養(yǎng)基菌落平板稀釋法、常規(guī)PCR以及實時熒光定量PCR等檢測和定量尖孢鐮刀菌的方法及應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中尖孢鐮刀菌檢測和定量提供理論依據(jù)。

1 培養(yǎng)基菌落平板稀釋法

尖孢鐮刀菌研究初期是采用培養(yǎng)基菌落平板稀釋法進(jìn)行定性和定量分析的。根據(jù)尖孢鐮刀菌對營養(yǎng)元素的需求，使用添加抗生素的天然培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)分離，分離出尖孢鐮刀菌后進(jìn)行培養(yǎng)，純培養(yǎng)后觀察其形態(tài)特征生長習(xí)性以及顯微結(jié)構(gòu)，使用稀釋平板法對其進(jìn)行定量。常用的尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基有馬鈴薯酒精瓊脂培養(yǎng)基(Potato ethanol agar medium,PEA)[18-19]和Komada培養(yǎng)基[20-22]等。PEA培養(yǎng)基是韓寶坤等結(jié)合馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato sucrose agar medium,PSA)和酒精瓊脂培養(yǎng)基(Ethanol agar medium,EA)，通過降低碳源，尋找新的抑菌物質(zhì)研制出的尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基，其優(yōu)點是制作材料便宜，接種時無需無菌操作[18]。而Komada培養(yǎng)基是使用較為廣泛的尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基，在香蕉、西瓜、蘆葦和三七等多種作物枯萎病的研究中均有使用[20-22]。

稀釋平板法是定量尖孢鐮刀菌十分常用的方法，其優(yōu)點是能夠檢測出活菌的數(shù)量，培養(yǎng)基成本低且操作簡單，已應(yīng)用于多種植物以及土壤中尖孢鐮刀菌的檢測[23]。目前已有研究者對尖孢鐮刀菌西瓜?；驮诟H土和非根際土中的含量進(jìn)行了稀釋平板定量分析，發(fā)現(xiàn)單作西瓜根際土中尖孢鐮刀菌含量高于根圍土[24]。何欣等通過對香蕉枯萎病植株根際土和非根際土中尖孢鐮刀菌進(jìn)行稀釋平板定量分析，發(fā)現(xiàn)根際土中的尖孢鐮刀菌含量與根圍土中尖孢鐮刀菌含量的比值越大，香蕉枯萎病發(fā)病越嚴(yán)重[11]。但由于培養(yǎng)基菌落平板稀釋法實驗周期較長，效率和靈敏度較低，現(xiàn)多與分子方法結(jié)合進(jìn)行驗證實驗，例如盛茹媛結(jié)合傳統(tǒng)方法與分子方法定量檢測了草莓根中的尖孢鐮刀菌[25]。

2 分子檢測定量方法

2.1 常規(guī)PCR

自PCR技術(shù)問世以來，就因其靈敏、快速和準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于植物病原真菌的檢測[26-27]。來自同一物種的分離物序列相同，而物種發(fā)育越多樣化，序列差異也越大[28-29]，由于核糖體DNA的編碼區(qū)序列具有保守性，因此分析真菌核糖體DNA的編碼區(qū)序列是真菌分類鑒定的有效方法[30]。

PCR檢測技術(shù)多樣，根據(jù)不同引物的PCR檢測技術(shù)有ITS-PCR和SCAR-PCR，而在PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的技術(shù)有PCR-ELISA、巢式PCR和多重PCR等[31]。Amutha等在檢測引起洋蔥枯萎病病原物時，利用ITS通用引物ITS1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物顯示與尖孢鐮刀菌100%同源，同時根據(jù)其形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，鑒定其為尖孢鐮刀菌[32]。除根據(jù)ITS序列進(jìn)行PCR測定，還可以使用特定序列擴(kuò)增。限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)就是通過擴(kuò)增特定序列來檢測尖孢鐮刀菌的方法，此方法在短時間內(nèi)即可檢測出植物組織和土壤中的尖孢鐮刀菌[33]。而莫賤友等使用兩種引物檢測發(fā)生枯萎病的香蕉根組織，對于分離出的6株菌株，使用ITS特異引物(對尖孢鐮刀菌不同?；途陻U(kuò)增出547 bp的片段)和SCAR特異引物(對尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種擴(kuò)增出252 bp的片段，對尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種擴(kuò)增出205 bp的片段)進(jìn)行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)1株為尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種，其余均為尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種，說明常規(guī)PCR可以根據(jù)不同引物檢測出不同病原菌[34]。而PCR-RFLP和巢氏PCR可以在侵染初期和潛育期檢測出尖孢鐮刀菌，對早期診斷具有較大幫助[35]，研究表明PCR-RFLP可以在感病品種接種后3天檢測到病原菌，巢式PCR可在接種后5天檢測到尖孢鐮刀菌[36]。除PCR-RFLP之外，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，還開發(fā)了多重PCR檢測技術(shù)，可在一次PCR反應(yīng)中同時檢測多種目標(biāo)病原體?，F(xiàn)已有研究者設(shè)計了針對黃瓜枯萎病病原體的新穎和簡化引物對，并開發(fā)了可同時檢測5個目標(biāo)病原體的多重PCR分析法，從而能夠快速準(zhǔn)確地診斷相應(yīng)的病害[37]；Hyun等開發(fā)的PCR檢測方法可以鑒定四種隔離的真菌病原體[38]。

常規(guī)PCR已經(jīng)成為診斷和研究尖孢鐮刀菌的主要工具。PCR技術(shù)較傳統(tǒng)的研究方法具備許多優(yōu)勢，例如：無需進(jìn)行尖孢鐮刀菌的培養(yǎng)，可以在復(fù)雜混合物中檢測單個目標(biāo)微生物，具有快速、靈敏、特異等特性，但常規(guī)PCR不能進(jìn)行尖孢鐮刀菌的定量分析[39]。

2.2 實時熒光定量PCR法

由于目前對病原菌的研究不僅需要定性分析，更需要對其精確定量，實時熒光定量PCR(簡稱實時PCR)開始應(yīng)用于植物病原菌的檢測和定量中。常規(guī)PCR檢測方法為終點檢測法，因為這種檢測方法PCR擴(kuò)增過了對數(shù)期，所以重復(fù)性較差[40]。而實時PCR在熒光能量傳遞的基礎(chǔ)上，通過一種可以嵌入雙鏈核酸2層堿基之間的熒光染料，在紫外光的激發(fā)下，通過測定PCR反應(yīng)退火或延伸階段所摻入熒光染料的熒光強(qiáng)度，實現(xiàn)對整個PCR循環(huán)進(jìn)程的實時監(jiān)控，可以根據(jù)循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度的對應(yīng)關(guān)系對待測物進(jìn)行精確定量，從而可以準(zhǔn)確可靠地定量根組織和土壤中的尖孢鐮刀菌[39]。

通過實時PCR分別對天然感染的植物組織和土壤以及人工感染土壤中尖孢鐮刀菌進(jìn)行定量分析[40]發(fā)現(xiàn)，人工接種的濃度與檢測到的尖孢鐮刀菌DNA濃度具有線性關(guān)系。此外，由于此試驗在多種樣品(大豆、西瓜和鷹嘴豆的根和自然感染的土壤等)中仍完成了尖孢鐮刀菌的準(zhǔn)確定量，說明其改進(jìn)的實時PCR方法的敏感性不受樣品的影響。在使用實時PCR檢測和定量黃瓜中尖孢鐮刀菌黃瓜?；偷倪^程中，發(fā)現(xiàn)了實時PCR分析的擴(kuò)增效率、靈敏度和可重復(fù)性不受樣品中其他微生物DNA的影響[41]。使用實時PCR對人工感染的尖孢鐮刀菌土壤和自然發(fā)病地塊的土壤進(jìn)行了尖孢鐮刀菌定量，檢測出田間收集的番茄地土壤中的尖孢鐮刀菌含量范圍為35～182 pg·g-1干土，并且與田間枯萎病的病情指數(shù)呈正相關(guān)[42]。

土壤中的生物環(huán)境和生化環(huán)境的改變都會對尖孢鐮刀菌含量產(chǎn)生一定程度的影響。使用實時PCR對連續(xù)種植香草超過20年但枯萎病的發(fā)病率相差7倍的果園中的尖孢鐮刀菌進(jìn)行定量，結(jié)果表明在細(xì)菌及真菌豐富的土壤環(huán)境中依舊可以準(zhǔn)確定量尖孢鐮刀菌，發(fā)病率高的地塊尖孢鐮刀菌量是發(fā)病率低的地塊的1.9倍，說明實時PCR可以在微生物類別復(fù)雜的土壤環(huán)境中準(zhǔn)確地定量尖孢鐮刀菌[43]。而Li等人的研究則表明實時PCR可以在AM真菌豐富的土壤環(huán)境中對尖孢鐮刀菌進(jìn)行準(zhǔn)確地定量，發(fā)現(xiàn)根際土中尖孢鐮刀菌數(shù)量受AM真菌的影響較小，但根中尖孢鐮刀菌在接種AM真菌后顯著降低且與草莓的病情指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系[44]。除此之外，還有研究者使用實時PCR分析土壤理化性質(zhì)對尖孢鐮刀菌含量的影響，例如使用實時PCR來分析草莓枯萎病樣地的土壤中的尖孢鐮刀菌含量的過程中發(fā)現(xiàn)，使用土壤改良劑后尖孢鐮刀菌含量由2 000 CFU·g-1干燥土壤降低到0[45]。使用實時PCR對氮含量不同的西瓜根際土和土體土中的尖孢鐮刀菌進(jìn)行定量分析時，發(fā)現(xiàn)了氮素的添加能有效地抑制西瓜根際土中尖孢鐮刀菌，使每克土壤尖孢鐮刀菌的拷貝數(shù)由8.9×105降低到6.6×103個[46]。

對植物組織中的尖孢鐮刀菌定量有助于對尖孢鐮刀菌在植物體內(nèi)的作用部位進(jìn)行研究，并以此來探索其作用機(jī)理。有研究者使用優(yōu)化的實時PCR對香蕉假莖、球莖和根組織中的尖孢鐮刀菌進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)他們優(yōu)化的體系的檢測限為0.001 ng DNA[47]。使用實時PCR對不同品種菜豆根系中尖孢鐮刀菌進(jìn)行定量以篩選抗病的菜豆品種，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)對根、莖組織中的尖孢鐮刀菌DNA最低檢測量為1pg[48]。

常規(guī)PCR中，反應(yīng)結(jié)果常受反應(yīng)物中的一些化合物抑制，因為它們會影響PCR產(chǎn)物的積累，但實時PCR的試驗結(jié)果并不依賴于產(chǎn)物積累，而是通過早期階段熒光信號的產(chǎn)生來實現(xiàn)的，因此實時PCR可以在復(fù)雜的樣品中進(jìn)行尖孢鐮刀菌的定量[49]。

3 其他檢測定量方法

3.1 免疫學(xué)檢測

免疫學(xué)檢測法主要研究抗原和抗體的特異性反應(yīng)，是一種出現(xiàn)較早應(yīng)用廣泛的實驗技術(shù)。先是在醫(yī)學(xué)和動物醫(yī)學(xué)方面廣泛應(yīng)用，而后也被應(yīng)用于植物病害檢測[25]。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是根據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)將待測物與酶連接，通過酶的高效催化作用與底物發(fā)生顯色反應(yīng)，從而對受檢測物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，是最早應(yīng)用的免疫學(xué)檢測手段[50]。有研究使用ELISA法定量香蕉根系中的尖孢鐮刀菌，證實了使用生物防治劑后香蕉根組織中的尖孢鐮刀菌的含量減少[51]。并且，使用ELIST和常規(guī)PCR方法鑒定鐮刀菌，發(fā)現(xiàn)ELISA得出的結(jié)果與ITS測序鑒定結(jié)果100%一致，說明ELISA檢測菌種是一種可靠的方式[52]。但ELISA法需提取血清純化，不同寄主抗原抗體不同，不能標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)致其在檢測尖孢鐮刀菌方面使用受限。

3.2 基因宏陣列

基因宏陣列，是一種運(yùn)用于醫(yī)學(xué)上檢測基因病變的分子生物學(xué)方法，經(jīng)過改進(jìn)已有效地運(yùn)用于人、動物以及植物病原菌的檢測?；蚝觋嚵惺菍o數(shù)個核酸序列探針固定在尼龍纖維膜上，通過與標(biāo)記了發(fā)光物質(zhì)的產(chǎn)物雜交產(chǎn)生信號的一種檢測方法[53]，是目前最適合在一次檢測中檢測多種病原體的技術(shù)[26]?；蚝觋嚵信c實時熒光定量PCR對同樣處理的樣品進(jìn)行檢測，雖然未能定量出尖孢鐮刀菌，但代表雜交信號強(qiáng)弱的灰度值與實時熒光定量PCR的結(jié)果正相關(guān)，尖孢鐮刀菌含量越高，雜交信號越強(qiáng)[46]。因此在分析尖孢鐮刀菌變化趨勢及病害的嚴(yán)重程度時，基因宏陣列也是一個選擇。

4 不同方法的綜合運(yùn)用及其比較

目前關(guān)于尖孢鐮刀菌的檢測和定量多是結(jié)合傳統(tǒng)和分子生物技術(shù)進(jìn)行的。劉芮池等使用多重PCR對菜地土壤的尖孢鐮刀菌進(jìn)行檢測，同時也使用形態(tài)學(xué)方法對菜地土壤病原菌進(jìn)行鑒定[54]。除此之外由于香蕉枯萎病病原菌的生理小種較難鑒定，對其尖孢鐮刀菌的檢測也采用形態(tài)學(xué)鑒定與PCR相輔相成的方式[55-56]。兩種方法結(jié)合也用于苜蓿、甘藍(lán)、仙人掌以及它們的種植土壤的尖孢鐮刀菌檢測[38,58]。形態(tài)學(xué)鑒定雖耗時費(fèi)力，但其結(jié)果直觀，可以與PCR結(jié)果相互印證，提高說服力。ELISA和PCR技術(shù)結(jié)合可以提高檢測的靈敏度[52,59]。。常規(guī)PCR定性分析，實時熒光定量PCR定量分析被使用在香蕉枯萎病的研究中[47]，常規(guī)PCR可以簡便地檢測出尖孢鐮刀菌的存在，得出結(jié)果后再使用實時PCR定量可以減少繁雜的操作，節(jié)約成本。在研究菠菜枯萎病時，使用實時熒光定量PCR對其尖孢鐮刀菌的定量與使用稀釋平板法對尖孢鐮刀菌定量結(jié)果呈顯著正相關(guān)[60]。采用多種方法檢測可以對結(jié)果進(jìn)行驗證，得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

培養(yǎng)基菌落平板稀釋法是經(jīng)典的檢測方法，經(jīng)過長時間的摸索具有完整的工作方法和普遍性，并且能夠檢測出活菌的數(shù)量，培養(yǎng)基準(zhǔn)備成本低，過程簡單。但此方法經(jīng)驗性較強(qiáng)，實驗周期長，需要進(jìn)行一定程度的摸索后才能提高效率。但隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)彌補(bǔ)了其缺點，常規(guī)PCR技術(shù)檢測快速靈敏、準(zhǔn)確性高、效率高，盡管不能進(jìn)行定量分析，但仍然是定性分析的良好選擇。而實時熒光定量PCR則可以進(jìn)行準(zhǔn)確地定量分析，具有高效準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，是目前進(jìn)行尖孢鐮刀菌檢測和定量的最佳選擇。并且隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，成本降低后實時PCR將成為大規(guī)模檢測和定量尖孢鐮刀菌的方法。目前已有多種檢測技術(shù)用于檢測尖孢鐮刀菌，我們在使用時，可以根據(jù)我們的實際需求進(jìn)行選擇。

5 結(jié)語與展望

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，新的檢測技術(shù)如生物芯片、全基因組測序等方法在真菌檢測領(lǐng)域也有所應(yīng)用。通過綜合運(yùn)用培養(yǎng)基菌落平板稀釋法、常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR、以及新的技術(shù)方法，可對不同植物組織和不同生境土壤中尖孢鐮刀菌進(jìn)行有效地檢測和定量，從而為預(yù)防病害的發(fā)生、流行及其有效防治提供前期依據(jù)。