CDK4在骨肉瘤中的研究進(jìn)展*

張 兵 綜述，李大鵬，毛良浩 審校

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱外科，鎮(zhèn)江 212001)

骨肉瘤是未成年人常見的原發(fā)性高度惡性骨腫瘤[1]，是一種極具侵襲性的惡性腫瘤，目前一般認(rèn)為起源于間葉組織。骨肉瘤雖然在臨床診治方法方面已取得了很大的進(jìn)步，包括手術(shù)切除、新輔助或輔助化療和放療，但轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性患者5年生存率僅為20%[2]。骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展可能涉及基因突變、染色體變異和DNA異常甲基化等病理和生理機(jī)制，但依然存在許多盲點(diǎn)。

癌癥的特性之一是細(xì)胞不受節(jié)制地增殖和生長，細(xì)胞周期機(jī)制控制著細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)在腫瘤中常過度表達(dá)和過度活躍，這是由于各種遺傳和表觀遺傳事件影響了它們的調(diào)節(jié)途徑，導(dǎo)致檢查點(diǎn)完整性的喪失，并最終導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化[3-4]。CDK4是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶家族一員，是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的核心因子之一。有研究發(fā)現(xiàn)，CDK4在乳腺癌[5]、肝癌[6]等多種腫瘤的發(fā)生過程中均發(fā)生了改變。此外，CDK4在人骨肉瘤細(xì)胞和組織中也呈高表達(dá)，且與骨肉瘤患者預(yù)后不良相關(guān)[7]。這些發(fā)現(xiàn)提示了CDK4在人骨肉瘤中扮演了重要角色。CDK4的表達(dá)異常有可能涉及調(diào)節(jié)CDK4的因子異常和(或)影響細(xì)胞增殖的活性物質(zhì)表達(dá)的變化。現(xiàn)將CDK4在骨肉瘤的作用機(jī)制及臨床意義的研究進(jìn)展綜述如下。

1 CDK4在調(diào)控細(xì)胞周期中的作用

CDK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與了細(xì)胞周期的進(jìn)程。隨著細(xì)胞周期的進(jìn)行，各種CDK隨著細(xì)胞周期的進(jìn)展而交替發(fā)揮作用。CDK調(diào)節(jié)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，使細(xì)胞周期有序地進(jìn)行。特別是CDK4/6通過控制G1期限制點(diǎn)向S期的過渡，在細(xì)胞增殖中具有重要作用。

CDK4通過與細(xì)胞周期蛋白D(cyclin D)結(jié)合從而調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,Rb)蛋白磷酸化，促進(jìn)了細(xì)胞由G1期向S期推進(jìn)[8]。磷酸化后的Rb蛋白與E2F轉(zhuǎn)錄因子(E2F transcription factor，E2F)解離，釋放出E2F轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，而未磷酸化的Rb蛋白與E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并抑制其功能而抑制細(xì)胞增殖。cyclin D- CDK4/6活性的增加可促進(jìn)Rb蛋白磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖狀態(tài)。p16INK4A基因(p16INK4A gene，p16INK4A)是CDK4的負(fù)調(diào)控因子，p16INK4A缺失上調(diào)了CDK4表達(dá)，使Rb蛋白磷酸化水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程加快[9]。CDK4在調(diào)控細(xì)胞周期中具有重要作用，通過抑制CDK4在骨肉瘤中活性和(或)表達(dá)可以達(dá)到抑制骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移的目的。

2 CDK4在骨肉瘤中的作用機(jī)制研究

2.1 骨肉瘤中染色體和基因變異對(duì)CDK4的作用

有研究表明，CDK4基因改變可導(dǎo)致CDK4表達(dá)的改變，其基因改變涉及染色體和DNA甲基化[10-11]。有學(xué)者指出，在骨肉瘤中出現(xiàn)染色體12q13～15區(qū)域的擴(kuò)增，該區(qū)域包含2個(gè)不同的擴(kuò)增子，一個(gè)在12q15以MDM2為中心；另一個(gè)在12q13～14以CDK4為中心，這2個(gè)區(qū)域在骨肉瘤中經(jīng)常同時(shí)擴(kuò)增，MDM2和CDK4擴(kuò)增與這2個(gè)基因的高表達(dá)水平相關(guān)[10,12]。7q22～q34區(qū)域與人類染色體帶12q13～q15/8q24/22q11～q13同源，包括Mdm2、Cdk4、c-Myc、Pdgf-b基因位點(diǎn)。也有研究表明，CDK4基因是骨肉瘤中染色體7q22～34處頻繁增加的靶基因，染色體7q22～34區(qū)域的增加促進(jìn)了CDK4的表達(dá)[13]。這些染色體的改變通過擴(kuò)增CDK4影響正常細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移，可能有助于進(jìn)一步了解人類骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，然而CDK4基因表達(dá)仍可能受基因組增益以外的機(jī)制調(diào)控。

CpG島常處于基因的啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域，與人類基因組編碼基因相關(guān)，位于基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域CpG的甲基化狀態(tài)影響基因的表達(dá)，對(duì)腫瘤的研究意義重大。在基于骨肉瘤的DNA甲基化和基因表達(dá)譜的CpG甲基化模式研究中，整合分析差異化基因(DEGs)和差異甲基化基因后發(fā)現(xiàn)，MEF2轉(zhuǎn)錄因子水平升高，上調(diào)了下游靶點(diǎn)CDK4表達(dá)[11]。同時(shí)CpG異常甲基化也存在于CDK4的抑制因子p16INK4A中，p16INK4A中的CPG島的甲基化使p16INK4A表達(dá)缺失，導(dǎo)致cyclin D-CDK4/6失調(diào)[9]。也有研究表明，p16INK4A的表達(dá)抑制了Brca1啟動(dòng)子以Rb-E2F依賴方式的CDK4的表達(dá)[14]。CDK4的異常擴(kuò)增也可能是基因突變所致，如Rb基因突變導(dǎo)致CDK4異常擴(kuò)增[15]。p16INK4A的缺失上調(diào)了CDK4表達(dá)，促進(jìn)Rb蛋白磷酸化，加快了G1期到S期細(xì)胞周期的進(jìn)展。這些變化也可能來自包括p16INK4A突變失活、cyclin D過表達(dá)和產(chǎn)生無法與p16INK4A相互作用的CDK4突變體等。這些改變通過促進(jìn)CDK4基因表達(dá)，在促進(jìn)骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移的發(fā)展中可能充當(dāng)著重要角色。染色體和基因變異在CDK4發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

2.2 骨肉瘤中非編碼RNA對(duì)CDK4的作用

在CDK4的表達(dá)過程中，其接受特定RNA的調(diào)控，可能在腫瘤發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中承擔(dān)著不可或缺的作用。這些調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞中CDK4表達(dá)的RNA涉及微小RNA(micro RNA，miRNA)、長非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等。miRNA是一種非編碼單鏈RNA分子，參與了基因的表達(dá)。有研究表明，miRNA-506-3p在骨肉瘤細(xì)胞中具有抑癌作用，miRNA-506-3p在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)降低，導(dǎo)致Rab-3D表達(dá)增加，進(jìn)而導(dǎo)致CDK4和MMP9(matrix metalloprotein 9,MMP9)表達(dá)活性增加，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[16]。也有學(xué)者指出，骨肉瘤細(xì)胞中過表達(dá)miR-590-3p可增加P53和P21表達(dá)，抑制增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、cyclin、CDK4表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[17]。同時(shí)也有研究者證實(shí)，miR-212[18]及miR-505[19]等可抑制骨肉瘤細(xì)胞中CDK4的表達(dá)而抑制骨肉瘤的生物學(xué)行為。而miR-203a可上調(diào)cyclin D1、cyclin B1、CDK1、CDK4的表達(dá)，而lncRNA GAS5負(fù)調(diào)控miR-203a，lncRNA GAS5沉默對(duì)MG-63細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用被miR-203a抑制而逆轉(zhuǎn)[20]。lncRNA FBXL19-AS1通過調(diào)控miR-346影響骨肉瘤細(xì)胞中CDK4的表達(dá)而影響腫瘤的惡性行為能力[21]。miRNA連同其靶基因已被證明是骨肉瘤潛在的治療性生物標(biāo)志物[22]。研究骨肉瘤中miRNA對(duì)CDK4的作用可能有助于更好地理解骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，并為臨床治療骨肉瘤帶來新的線索。

2.3 骨肉瘤中細(xì)胞因子和激素對(duì)CDK4的作用

在骨肉瘤的產(chǎn)生及分化的過程中，細(xì)胞內(nèi)某些蛋白和(或)因子可通過調(diào)節(jié)CDK4參與調(diào)控腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。如絲氨酸蛋白酶抑制劑E2(SerpinE2)，是Serpins家族的成員之一，可抑制絲氨酸蛋白酶，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，尤其是在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中。SerpinE2在骨肉瘤組織中表達(dá)水平升高，特別是在轉(zhuǎn)移期患者的組織中，SerpinE2的高表達(dá)導(dǎo)致了骨肉瘤患者的低生存率，SerpinE2的表達(dá)與CDK4、cyclin D1在骨肉瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出正相關(guān)，且轉(zhuǎn)染SerpinE2后骨肉瘤細(xì)胞對(duì)硼替佐米和阿霉素的耐藥性增加，SerpinE2在骨肉瘤中的高表達(dá)可通過提高CDK4、cyclin D1水平刺激細(xì)胞增殖，促進(jìn)藥物耐藥性，并導(dǎo)致不良生存[23]。而S100A9表達(dá)下調(diào)促進(jìn)p27表達(dá)，進(jìn)而抑制了CDK2、CDK4活性，這種抑制作用導(dǎo)致低磷化Rb蛋白大量積累，通過抑制細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)變抑制U2OS人骨肉瘤細(xì)胞的增殖[24]。蛋白是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，上述蛋白在骨肉瘤中低表達(dá)從而促進(jìn)CDK4的表達(dá)參與了骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移的進(jìn)程，但為何在骨肉瘤中這些蛋白低表達(dá)值得更深層次的研究。

在體內(nèi)有些激素可能參與了骨肉瘤的形成。有學(xué)者指出，褪黑素在肺癌中可發(fā)揮抗腫瘤作用[25]。相似的研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤的發(fā)生和褪黑激素的減少似乎是同時(shí)發(fā)生的，隨后證明褪黑素下調(diào)G1期相關(guān)的cyclin D1和CDK4，與G(2)/M期相關(guān)的cyclin B1和CDK1，增加了細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞比例，同時(shí)降低了S期和G(2)/M期細(xì)胞比例，抑制細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和轉(zhuǎn)移[26]。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展需依賴于腫瘤細(xì)胞獲得維持惡性生長的能力，體內(nèi)激素是否在其中具有重要的作用，其是否在骨肉瘤中有作用值得后續(xù)研究。

3 CDK4在骨肉瘤中的臨床意義

3.1 CDK4在骨肉瘤中的診斷意義

確診和區(qū)分骨肉瘤的類型可為下一步治療提供診療意見，為進(jìn)一步優(yōu)化治療方案提供支持。MDM2、CDK4在低分化骨肉瘤中表達(dá)有助于支持低分化骨肉瘤的診斷[27-29]。低級(jí)別骨肉瘤在放射學(xué)和組織學(xué)上可與纖維和纖維骨性病變(如纖維瘤病和纖維異常增生)混淆，低級(jí)別骨肉瘤中MDM2、CDK4的免疫組織化學(xué)表達(dá)具有特異性，有助于將其與良性纖維性骨組織病變和良性腫瘤區(qū)分開來[27,30]。此外，在低級(jí)別骨肉瘤中一些偶爾會(huì)分化為高級(jí)別骨肉瘤，在組織學(xué)上與傳統(tǒng)骨肉瘤難以區(qū)分，MDM2、CDK4在低分化骨肉瘤和去分化骨肉瘤中經(jīng)常被擴(kuò)增，而MDM2、CDK4對(duì)那些從低級(jí)別骨肉瘤進(jìn)展而來的高級(jí)別骨肉瘤具有靈敏度和特異性，免疫組織化學(xué)可能有助于識(shí)別這一去分化亞群進(jìn)行精確的亞分類[31]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，CDK4、MDM2的共表達(dá)可區(qū)分骨肉瘤類型，但其陰性不能排除骨肉瘤[29]。因此，CDK4的免疫組織化學(xué)特異性表達(dá)為臨床醫(yī)師對(duì)骨肉瘤的診斷及分型提供了診療意見，也在很大程度上為個(gè)體化和精準(zhǔn)化治療提供了治療依據(jù)。然而，仍存在部分CDK4陰性表達(dá)的骨肉瘤，這也是臨床診療面臨的困難，需探索其他可能的骨肉瘤標(biāo)志物與CDK4聯(lián)合診斷，以提高骨肉瘤篩查率。

3.2 CDK4 抑制藥物的研究進(jìn)展

基于在惡性腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移過程CDK4的惡性生物學(xué)作用，CDK4抑制藥物的研究在不斷的探索中。首個(gè)CDK4抑制劑——palbociclib已獲批用于乳腺癌的治療，治療骨肉瘤的CDK4抑制藥物也在研發(fā)中。如palbociclib和CDK4特異性小干擾RNA抑制CDK4/6-cyclinD-Rb信號(hào)通路，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和生長[7]。動(dòng)力蛋白抑制劑 (Dynasore)[32]和斑蝥酸鈉[33]等也已被研究證實(shí)可通過直接或間接作用抑制CDK4表達(dá)而抑制骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。 這些藥物的研究為CDK4抑制藥物在骨肉瘤中治療的可行性提供了支持，為骨肉瘤治療藥物的研究打開了新的方向，同時(shí)也為CDK4抑制藥物與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用提供了新的思路。通過聯(lián)合用藥增強(qiáng)抗腫瘤藥物的敏感性、降低抗腫瘤藥物的不良反應(yīng)存在巨大的研究價(jià)值。但這些藥物的研究目前僅局限于臨床前的基礎(chǔ)研究，尚需得到進(jìn)一步的臨床考證。

4 小結(jié)與展望

骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果，在調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞周期進(jìn)程中CDK4具有核心地位。在骨肉瘤細(xì)胞中CDK4的擴(kuò)增加快了細(xì)胞周期G1期到S期轉(zhuǎn)變。CDK4的擴(kuò)增涉及染色體變異、甲基化、基因突變和細(xì)胞因子表達(dá)的改變等。但在骨肉瘤中CDK4擴(kuò)增機(jī)制的研究尚未完全成為一個(gè)體系。CDK4在骨肉瘤中的高表達(dá)差異性為在臨床工作中診斷骨肉瘤、分型、治療及預(yù)后提供了依據(jù)。CDK4抑制劑已在乳腺癌中應(yīng)用，在骨肉瘤基礎(chǔ)研究中也取得了初步進(jìn)展。但在臨床應(yīng)用方面缺乏有效的研究。探索在骨肉瘤中CDK4的作用機(jī)制，以及CDK4抑制藥物的研究、CDK4抑制藥物與其他抗骨肉瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化和個(gè)體化治療后續(xù)存在較大研究空間及價(jià)值。深入研究骨肉瘤中CDK4作用將會(huì)為骨肉瘤的精準(zhǔn)和個(gè)體化診治提供更多的選擇。