內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原蛋白1及其與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展

吳 敏 綜述，黃尤光 審校

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所 650118)

惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類生命健康的主要公共衛(wèi)生問題之一，據(jù)美國最新癌癥數(shù)據(jù)顯示，2020 年美國將有 1 806 590 例新發(fā)癌癥患者和 606 520 例癌癥死亡患者[1]。隨著惡性腫瘤發(fā)病率和病死率的持續(xù)攀升，且缺乏有效的干預(yù)策略以提高患者的生存率，因此尋找新的治療靶點(diǎn)已經(jīng)成為近年來的研究熱點(diǎn)。近年來研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原蛋白 1(endoplasmic reticulum oxidoreductin 1，ERO1)在多種類型的腫瘤組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，且與腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)，還與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[2-5]，因而深入研究 ERO1與腫瘤的關(guān)系，或?qū)⒊蔀樾碌哪[瘤治療干預(yù)靶點(diǎn)。

1 ERO1家族概述

ERO1是一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)膜腔緊密結(jié)合的糖基化黃素酶，其主要作用是參與二硫鍵的形成，從而維持蛋白質(zhì)的正確折疊，其基因定位于 14 號(hào)染色體上，基因組序列含有16個(gè)外顯子和 15 個(gè)內(nèi)含子[6-7]。在哺乳動(dòng)物中有兩個(gè)與酵母 ERO1p 同源的蛋白質(zhì)，稱為ERO1α和 ERO1β。ERO1α和 ERO1β 顯示出不同的組織分布，ERO1α 在人體的多種組織中均有表達(dá)，而 ERO1β 主要在分泌組織中高表達(dá)，如胰腺和胃[8]。此外，二者在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中也顯示出一定差異：ERO1α 由低氧條件誘導(dǎo)，而 ERO1β 表達(dá)由未折疊蛋白反應(yīng) (unfolded protein response,UPR)優(yōu)先誘導(dǎo)[9]，表明 ERO1的激活有一定程度的選擇性。

2 ERO1的生物學(xué)功能

蛋白質(zhì)的氧化折疊主要發(fā)生在真核細(xì)胞ER中，是新生肽鏈折疊成天然蛋白形成正確二硫化物的過程。二硫鍵的形成對(duì)于維系分泌蛋白和膜結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，且二硫鍵的錯(cuò)配會(huì)顯著增加未折疊蛋白反應(yīng)的發(fā)生，而真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中二硫鍵形成的兩個(gè)主要參與者是二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase,PDI)和 ERO1[10]。PDI 可直接催化還原底物中二硫化物的形成，并且可以通過異構(gòu)化反應(yīng)將非天然二硫鍵轉(zhuǎn)化為天然二硫鍵，從而糾正蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊[11]。ERO1可氧化被還原的PDI結(jié)構(gòu)域[12]，使蛋白質(zhì)氧化折疊開始新的循環(huán)，并通過其非共價(jià)結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)，將電子轉(zhuǎn)移到分子氧，產(chǎn)生H2O2[11,13]。此外，有研究表明 ERO1除了參與蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，還參與代謝的調(diào)節(jié)，比如促進(jìn)睪丸激素的分泌、調(diào)節(jié)類固醇的生成和胰島素分泌[9,14-15]。

3 ERO1在腫瘤中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

新近研究表明，相較于正常細(xì)胞和組織中的 ERO1水平，ERO1在肝癌、胰腺癌、膽管癌、宮頸癌、乳腺癌等多種類型的癌細(xì)胞和癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[2-5,16]。ZHANG等[17]對(duì) 205 例胰腺導(dǎo)管腺癌患者的癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，ERO1高表達(dá)的胰腺導(dǎo)管腺癌患者總生存率顯著低于 ERO1低表達(dá)患者，且 ERO1的表達(dá)與腫瘤的大小和組織學(xué)分化密切相關(guān)。YAN等[4]收集了 186 例膽管癌組織標(biāo)本和 36 例癌旁組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn) ERO1在膽管癌組織中的陽性表達(dá)率為 84.9%，而在癌旁組織中表達(dá)率為 0，進(jìn)一步對(duì) ERO1表達(dá)與臨床病理和患者預(yù)后進(jìn)行相關(guān)分析后表明，ERO1的高表達(dá)與臨床分期和病理分期密切相關(guān)，且 ERO1的表達(dá)是膽管癌患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。同樣地，YANG等[2]收集了 114 例原發(fā)性肝癌患者的術(shù)后癌組織和癌旁組織，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的ERO1α mRNA 和蛋白水平明顯高于癌旁組織，且ERO1α高表達(dá)的肝癌患者 5 年總生存期較ERO1α低表達(dá)的肝癌患者低，無復(fù)發(fā)、生存期縮短，此外經(jīng) RT-qPCR 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)ERO1α高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。綜上，ERO1在腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)，提示 ERO1也許可作為腫瘤患者預(yù)后新的生物標(biāo)志物。

4 ERO1表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

腫瘤細(xì)胞的過度增殖、高度遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力是惡性腫瘤的主要特征，也是惡性腫瘤患者不良預(yù)后的主要原因之一。已有研究表明實(shí)體腫瘤中大多都存在低氧的微環(huán)境，其有助于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)容易產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而限制了抗腫瘤療效[18-19]，而ERO1α在缺氧條件下其表達(dá)可顯著升高[20]。

4.1 ERO1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡

ZHANG等[5]研究表明，敲低宮頸癌 HeLa 細(xì)胞中ERO1α的表達(dá)會(huì)明顯抑制HeLa 細(xì)胞的增殖，使 HeLa 細(xì)胞周期被阻滯于G1期。GUPTA等[3]使用 CRISPR/Cas 基因組編輯技術(shù)沉默胰腺癌細(xì)胞中ERO1α的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞的增殖能力顯著降低，且明顯抑制了胰腺癌細(xì)胞的克隆形成能力，進(jìn)一步建立裸鼠皮下成瘤模型后，發(fā)現(xiàn)沉默ERO1α表達(dá)組的裸鼠其皮下成瘤能力較未沉默組顯著降低。此外，筆者團(tuán)隊(duì)經(jīng)過前期研究同樣發(fā)現(xiàn)，敲低結(jié)腸癌細(xì)胞中的ERO1α的表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)可以顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡[21]。上述體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，ERO1的表達(dá)不僅可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，還可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活。

4.2 ERO1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移

YANG 等[2]通過細(xì)胞劃痕、Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，敲低肝癌細(xì)胞中ERO1α的表達(dá)后，可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。HAN等[22]研究表明敲低胰腺癌細(xì)胞中 ERO1的表達(dá)時(shí)，胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低，進(jìn)一步檢測(cè)了裸鼠皮下移植瘤組織中侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白 MMP-2 和 MMP-9 表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，敲低 ERO1抑制了 MMP-2 和 MMP-9 的表達(dá)。此外，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也同樣表明，與注射了野生型乳腺癌細(xì)胞的小鼠相比，注射了敲低ERO1α表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞的小鼠，其體內(nèi)腫瘤生長延遲，且體內(nèi)腫瘤的肺轉(zhuǎn)移數(shù)也顯著降低[23]。綜上所述，ERO1的高表達(dá)顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，深入研究 ERO1與腫瘤發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系及具體機(jī)制，靶向 ERO1可有望成為惡性腫瘤治療的潛在新策略。

5 ERO1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

5.1 ERO1調(diào)控腫瘤血管生成

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種高度特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的因子，其在促進(jìn)腫瘤新生血管的生成中發(fā)揮重要作用，而新生血管的生成是惡性腫瘤具有侵襲性的重要標(biāo)志之一。TANAKA等[16]分別將低表達(dá)ERO1α的乳腺癌細(xì)胞和過表達(dá)ERO1α的乳腺癌細(xì)胞注入小鼠乳腺后，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ERO1α顯著增加了腫瘤組織中血管的數(shù)量，而敲低ERO1α的表達(dá)則明顯抑制了腫瘤血管的生成。KUTOMI等[23]敲低乳腺癌細(xì)胞中ERO1α的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞分泌的 VEGF 明顯減少。此外，YANG等[2]檢測(cè)了肝癌組織中的 VEGF 表達(dá)，發(fā)現(xiàn) VEGF 水平與肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且轉(zhuǎn)移性肝癌標(biāo)本中 VEGF 水平上調(diào)與ERO1α過表達(dá)呈正相關(guān)，同時(shí)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn) ERO1α低表達(dá)的肝癌細(xì)胞其 VEGF 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯低于過表達(dá)ERO1α的肝癌細(xì)胞，且發(fā)現(xiàn)了ERO1α可通過S1PR1/STAT3/VEGF-A 信號(hào)通路促進(jìn)血管生成。ERO1主要參與二硫鍵的形成，而 VEGF 需要形成二硫鍵以發(fā)揮其生物活性，因此，ERO1與腫瘤血管的生成密切相關(guān)，且 ERO1不僅通過介導(dǎo) VEGF 的氧化蛋白折疊來發(fā)揮作用，還通過增加 VEGF 的 mRNA 表達(dá)來增加 VEGF 的分泌。

5.2 ERO1調(diào)控腫瘤上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)

EMT 在腫瘤惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，EMT 不僅會(huì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)還會(huì)增加腫瘤對(duì)臨床干預(yù)的耐受[24]。有研究表明在肝癌細(xì)胞中敲低ERO1α 的表達(dá)后，EMT 相關(guān)蛋白 E-鈣黏蛋白表達(dá)水平升高，而波形蛋白(Vimentin)和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail2表達(dá)水平降低，且在過表達(dá)ERO1α的肝癌細(xì)胞中得到相反的結(jié)果，同樣地在ERO1α低表達(dá)和過表達(dá)的肝癌細(xì)胞免疫熒光顯示出相同的結(jié)果[2]。TAKEI等[7]敲低結(jié)腸癌細(xì)胞中ERO1α的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn) E-鈣黏蛋白表達(dá)增加，而鋅指轉(zhuǎn)錄因子 Snail 的表達(dá)及整合素連接激酶1(ILK1)的表達(dá)減少。ZHANG等[5]的實(shí)驗(yàn)同樣表明在宮頸癌細(xì)胞中敲低ERO1α的表達(dá)后，EMT促進(jìn)蛋白的表達(dá)水平明顯降低，且用活性氧清除劑 N-乙酰半胱氨酸處理宮頸癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其抑制了ERO1α過表達(dá)觸發(fā)的 EMT 信號(hào)傳導(dǎo)現(xiàn)象，表明了ERO1α可能通過其副產(chǎn)物以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生 EMT。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ERO1通過參與腫瘤細(xì)胞 EMT 過程的調(diào)控，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

5.3 ERO1調(diào)控腫瘤免疫

在生理?xiàng)l件下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)可以及時(shí)識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞，而惡性腫瘤卻能夠采用不同生存策略，在抗腫瘤免疫應(yīng)答的各階段得以幸存，但其具體的調(diào)控機(jī)制目前尚未完全明確。有研究表明腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的ERO1α促進(jìn)了粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，趨化因子CXCL1和CXCL2的氧化折疊，用于誘導(dǎo)和募集多核型髓源抑制性細(xì)胞，從而抑制抗腫瘤T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[25]。TANAKA等[26]研究表明ERO1α不僅可以通過促進(jìn)程序性死亡配體-1(programmed death-ligand 1,PD-L1)的氧化蛋白折疊來上調(diào) PD-L1 的表達(dá)，還可通過ERO1α產(chǎn)生ROS從而上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α 的表達(dá)水平，導(dǎo)致 PD-L1 mRNA 的表達(dá)增加，而 PD-L1在腫瘤發(fā)生免疫逃逸中起關(guān)鍵作用。綜上，ERO1在調(diào)控腫瘤免疫的過程中發(fā)揮著重要作用，ERO1的過表達(dá)不僅促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，且可通過抑制抗腫瘤 T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答來促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長，這為建立有效的腫瘤免疫治療提供了新思路。

5.4 其他作用機(jī)制

整合素β1 是整合素的亞家族之一，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的信號(hào)傳遞，且參與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[27]。TAKEI等[7]發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，敲低ERO1α 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)影響整合素β1的N-糖基化和膜轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表面的整合素 β1 表達(dá)減少，從而使ERO1α低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更高的接觸抑制特性，提示在缺氧條件下ERO1α通過調(diào)控整合素信號(hào)傳導(dǎo)，使腫瘤細(xì)胞失去接觸抑制的特性。 Akt/mTOR 信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。YAN等[4]研究表明在沉默膽管癌細(xì)胞中ERO1α的表達(dá)后，AKT/mTOR 信號(hào)通路的效應(yīng)蛋白p-Akt、p-4EBP1和p-S6 的表達(dá)明顯降低，在過表達(dá)ERO1α 的細(xì)胞中得到相反的結(jié)果，且在進(jìn)一步使用 Akt 通路抑制劑以后，發(fā)現(xiàn)ERO1α的蛋白水平無明顯改變，提示了ERO1α是 Akt/mTOR 信號(hào)通路的上游調(diào)控分子，ERO1α 可通過調(diào)控 Akt/mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展。JNK 信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶三大主要信號(hào)通路之一，主要參與調(diào)控細(xì)胞周期、增殖和凋亡等生理及病理過程[28]。SEOL等[29]敲低胃癌細(xì)胞中ERO1的表達(dá)后，JNK 的磷酸化明顯降低，表明敲低ERO1表達(dá)對(duì)JNK信號(hào)通路有抑制作用，提示ERO1可能通過調(diào)控JNK信號(hào)通路的活化，以調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，有研究表明在胰腺癌細(xì)胞中過表達(dá)ERO1激活了Wnt/catenin信號(hào)通路，并上調(diào)Wnt/catenin信號(hào)通路的相關(guān)靶蛋白，從而調(diào)節(jié)胰腺癌的進(jìn)展[22]。綜上，ERO1可能通過調(diào)控多條信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)腫瘤的惡性進(jìn)展過程，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

6 ERO1表達(dá)與腫瘤耐藥關(guān)系

目前，化療是治療惡性腫瘤的主要治療方法之一，但隨著化療耐藥不斷增加，腫瘤耐藥性已經(jīng)成為當(dāng)今全世界都亟待解決的一個(gè)問題。研究表明通過沉默胃癌細(xì)胞中 ERO1的表達(dá)，可明顯增加胃癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶和紫杉醇的敏感性，顯著增強(qiáng)抗腫瘤療效[29]。此外，HAYES等[30]對(duì) 76 例接受地塞米松治療和 188例接受硼替佐米治療的多發(fā)性骨髓瘤患者的分析表明，在同樣接受地塞米松和硼替佐米治療的情況下，ERO1高表達(dá)的多發(fā)性骨髓瘤患者其總生存期明顯低于ERO1低表達(dá)的患者。這些結(jié)果提示，ERO1可能是腫瘤發(fā)生耐藥性的原因之一，且與藥物本身的作用機(jī)制無關(guān)，ERO1也許可作為抗腫瘤治療過程中監(jiān)測(cè)腫瘤患者發(fā)生耐藥性的一個(gè)生物標(biāo)志物。

7 小 結(jié)

ERO1是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)，其不僅參與二硫鍵形成，還能夠調(diào)控機(jī)體的正常代謝。在各種損害因素作用下可促進(jìn)機(jī)體ERO1過表達(dá)，并通過調(diào)控腫瘤血管生成、EMT和腫瘤免疫等多種信號(hào)通路促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ERO1的表達(dá)水平不僅與腫瘤惡性進(jìn)程相關(guān)，且和腫瘤患者不良預(yù)后密切相關(guān)，提示 ERO1或能作為惡性腫瘤的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。目前關(guān)于 ERO1在腫瘤中的具體作用機(jī)制尚未明確，未來需要更多的基礎(chǔ)和臨床研究來進(jìn)一步闡明 ERO1在調(diào)控腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移中具體機(jī)制，為臨床防治腫瘤提供新見解和新手段。