母乳中可溶性TLR2對HIV感染的作用①

劉洪杉 何秋水 （首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學系，北京100069）

Toll 樣受體（Toll like receptors，TLRs）屬于Ⅰ型跨膜受體，由胞外域、跨膜域和胞內域三部分組成。TLRs 參與識別病原體相關模式分子（pathogen-asso?ciated molecular patterns，PAMPs）和損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）后觸發(fā)信號級聯(lián)反應，激活NF-κB 信號轉導通路，促進下游抗病毒和促炎癥細胞因子產(chǎn)生［1-2］。NF-κB激活后通過結合反轉錄病毒基因長末端重復序列（long terminal repeated，LTR）以促進病毒復制［3］。人類TLR2 位于4 號染色體，定位于細胞膜表面，可與TLR1、TLR6 和 TLR10 形成異源二聚體［4］。目前有許多病毒蛋白已被鑒定為TLR2 的新型PAMPs，包括DNA 病毒、單正鏈RNA 病毒、單負鏈病毒、雙正鏈病毒［5-12］。

1 TLR2在HIV感染中的作用

HIV病毒屬于慢病毒屬，是一種強變異性病毒，可大量破壞以CD4+T 細胞為代表的宿主免疫細胞，影響人體免疫系統(tǒng)對病毒的抵御能力［13］。HIV-1 結構蛋白 p17、p24 和 gp41 可引起 TLR2 介導的細胞活化并增加前病毒DNA 含量，進而加重T 細胞中的HIV 感染和 HIV-1 病毒在巨噬細胞中的復制［12，14-15］。此外，HIV-1 gp120 可增加TLR2 引起的病毒復制和TNF-α、IFN-β 分泌［16-18］。TLR2/TLR1 異源二聚體可識別 HIV 結構蛋白 p17 和 gp41，TLR2/TLR6 可識別HIV p24 結構蛋白并引起免疫激活。此外，在沒有TLR6 的情況下，單獨 TLR2 與 HIV p24 結合后可阻斷p17和gp41所引起的免疫激活［12］。盡管目前關于TLR2 與 TLR10 的研究較少，但也提出 TLR2 可與TLR10 形成自源性或異源二聚體共同識別gp41，影響HIV在機體內引起的免疫反應［19］。

2 母乳中sTLR2與HIV作用機制

可溶性 Toll 樣受體（soluble toll like receptors，sTLRs）與 TLRs 胞外域高度同源，可與 TLRs 競爭結合配體，是TLRs的負反饋調節(jié)途徑之一［20］。細胞膜表面的TLR2 結構域脫落后，整聯(lián)蛋白金屬蛋白酶（a distintegrin and metalloproteinase，ADAM），包括ADAM10 和ADAM17，對脫落蛋白進行水解切割后生成可溶性Toll 樣受體2（soluble toll like receptor 2，sTLR2）［21］。母乳中的 sTLR2 可與 sCD14 結合形成異源二聚體，受到經(jīng)典配體Pam3Cys刺激，影響二者的結合，以此實現(xiàn)sTLR2的激活［21-22］。sTLR2可能通過與sCD14 相互作用和/或與細胞膜結合的CD14發(fā)揮其抑制活性，從而干擾脂肽對CD14 介導的細胞膜 TLR2 的觸發(fā)及信號傳導［21，23］。sTLR2 存在于多種體液之中，首先發(fā)現(xiàn)以高濃度形式存在于母乳中［24］。母乳中 sTLR2 作為誘餌受體結合多種PAMPs 和DAMPs 來干擾細胞膜表面TLR2 的激活，減少病毒感染后靶細胞的募集，幫助調節(jié)細胞的過度活化［25］。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，母乳可以保護發(fā)育中的嬰兒免受環(huán)境病原體侵害，無論母體HIV 感染狀況如何，母乳喂養(yǎng)均可降低嬰兒出生6個月內HIV 母嬰傳播（MTCT）的風險［26-27］。盡管對母乳是如何保護嬰兒不被感染HIV 的具體原理仍在研究，但可以肯定的是，母乳中具有抗病毒活性的免疫成分［28-29］。對HIV 患者母乳組成成分進行分析發(fā)現(xiàn)存在大量sTLRs［24］，將尼日利亞的 HIV 感染患者母乳與尼日利亞和加拿大的未感染患者母乳中sTLR2的表達水平進行對比發(fā)現(xiàn)，感染患者sTLR 平均濃度水平在104~105pg/ml，未感染患者sTLR 平均濃度水平在103~104pg/ml，HIV 感染患者母乳中 sTLR2 濃度水平明顯升高［30］。鑒于 TLR2 在 HIV 感染中的重要作用，由此推斷sTLR2 亦是抑制HIV-1 蛋白誘導細胞活化的重要免疫因子。

sTLR2 通過與HIV-1 結構蛋白的直接相互作用而干擾病毒在宿主細胞上的附著，對HIV-1 感染有顯著抑制特性，并抑制了病毒誘導的NF-κB 信號通路的活化和炎癥反應，且隨著體內sTLR2 濃度的增加，對HIV的抑制作用越強，可一定程度上減緩HIV疾病進程［12，31］。母乳中 HIV-1 蛋白 p17、p24 和 gp41或Pam3CSK4的增多均可使乳腺上皮細胞和單核巨噬細胞分泌產(chǎn)生的 sTLR2 增多［30］。sTLR2 可與 HIV結構蛋白 p17、p24 和 gp41 直接結合，但與 HIV 結構蛋白gp120 或HIV ssRNA 之間未檢測到相互作用［24］。隨著sTLR2濃度水平的升高，gp41誘導的IL-8表達受到顯著抑制，p17 誘導的細胞活化水平降低［30］。sTLR2 濃度水平與疾病進展標志物 p24 含量呈正相關，同時HIV 感染患者體內α-防御素水平、Pam3CSK4 含量與母乳中的病毒負荷均可影響sTLR2 的分泌水平［30］。此外，sTLR2 也可以通過與HIV-1 結構蛋白結合，減少NF-κB 依賴性細胞活化，進而抑制HIV-1受體CCR5表達，并且這種抑制作用隨著sTLR2 濃度升高而增強，從而顯著減弱HIV-1感染［32］。同時，sTLR2 濃度水平與感染 HIV-1 的母乳中的IL-15 含量密切相關。隨著機體內sTLR2 濃度水平增加，IL-15分泌增多，NK 細胞的殺傷作用和繁殖得以加強，使HIV 復制得到有效控制，其機制類似于TLR2 依賴性促炎癥因子產(chǎn)生機制以及暴露于HSV 包膜糖蛋白中巨噬細胞釋放IL-15 的機制［30］。

3 母乳中不同sTLR2片段與HIV的作用

在LEBOUDER 等［21］研究中，血漿和母乳及單核細胞培養(yǎng)上清液中共發(fā)現(xiàn)6 種sTLR2 片段，分別是32、36、40、66、70 和 83 kD 多肽。TLR2 的未加工形式的分子量約為90 kD，人TLR2 的細胞外結構域約為64 kD，并通過N-連接的糖基化增加至84 kD，因此母乳中的sTLR2 多肽是來自整個TLR2 分子或細胞外結構域的加工片段［33］。由此推測，83 kD 多肽可能對應于完整TLR2 細胞外結構域即完整sTLR2 片段，而其他較短多肽片段可能是由83 kD 多肽的進一步修飾水解產(chǎn)生的。

而在 HENRICK 等［24］研究中發(fā)現(xiàn)母乳中主要sTLR2片段是38 kD 和26 kD 多肽，乳腺和母乳中的多個細胞有助于26 kD sTLR2的生成，但是38 kD 形式的來源目前仍不清楚。數(shù)據(jù)表明38 kD sTLR2 的產(chǎn)量在產(chǎn)后隨時間下降，并且在室溫下容易降解，這一現(xiàn)象可能與嬰兒的免疫系統(tǒng)成熟有關。sTLR2 38 kD 和26 kD 多肽片段通過非共價鍵相互結合，以sTLR2 蛋白復合物的形式抑制細菌PAMPs 誘導的促炎癥細胞因子產(chǎn)生感染和無細胞R5 HIV-1感染，有助于減少HIV-1向嬰兒的垂直傳播［24］。這一點在體外實驗中也得到了驗證——使用免疫中和和免疫耗竭的方法將母乳中sTLR2 去除，將無細胞的R5 HIV-1 與含sTLR2 和不含sTLR2 的母乳上清液孵育并感染TZMbl 細胞發(fā)現(xiàn)，與不含sTLR2 的上清液相比，含有sTLR2 的細胞上清液中IL-8 的含量顯著降低，當使用 TLR2 mAb 中和 sTLR2 時，IL-8 的含量顯著增加，并且sTLR2 濃度越高，IL-8 含量降低越明顯［30］。同樣用不含sTLR2母乳進行體外免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，Pam3CSK4 可使細胞中IL-8 分泌顯著增加。由此可見sTLR2 還與抑制Pam3CSK4 誘導的炎癥有關，對嬰兒健康和預防HIV 母嬰垂直傳播至關重要［24］。

4 sTLR2對HIV治療的作用

在HIV的治療過程中sTLR2可作為良好的標記物從而反應治療效果。隨著HIV 感染患者的單核巨噬細胞分泌sTLR2 的增加，sTLR2 含量與其他炎癥標記物，如 TNF-α、IL-6 和 IL-1Ra，濃度水平呈正相關，這一點說明sTLR2 提高了HIV 感染患者免疫激活［34］。sTLR2 濃度水平的升高反映出 sTLR2 可有效抑制 TLR2 與 HIV-PAMP 的結合，通過 ELISA 或Western blot 對體液中sTLR2 的表達水平進行檢測，在未來對HIV患者的治療和HIV感染的預防有重要作用［24，30，34-35］。

5 結語

sTLR2 在HIV 發(fā)病機理中發(fā)揮重要作用，當HIV病毒感染機體后，sTLR2可與HIV-1病毒表面結構蛋白 p17、p24 和 gp41 直接作用，與 TLR2 競爭結合配體，抑制下游NF-κB 信號通路活化和炎癥反應，增加 IL-15 產(chǎn)生，減少 IL-8 分泌和 CCR5 表達。鑒于母乳中sTLR2 和免疫因子之間的密切關系，從而認為這些先天因素共同起作用，有助于抑制HIV病毒的感染和復制，并在預防HIV 母嬰垂直傳播和保護嬰兒健康中發(fā)揮重要作用。此外，sTLR2 與其他免疫分子相互作用可能是預防易感人群HIV-1感染和HIV 治療的關鍵。目前，sTLR2 在HIV 感染和治療中以及在病毒感染過程中的免疫調節(jié)作用仍然知之甚少，并且在中國這方面的研究還未見報道。然而，越來越多的證據(jù)表明免疫系統(tǒng)可以使用一系列可溶性分子來抵御病毒感染。通過sTLR2直接與HIV-1 蛋白的相互作用，可以推測sTLR2 可以至少通過以下兩種可能的方式抑制病毒感染：①sTLR2 直接識別病毒表面蛋白，與之結合后并阻礙病毒-宿主細胞膜融合以減少病毒的入侵和感染；②sTLR2 以劑量依賴的方式顯著抑制了病毒誘導的TR2依賴性NF-κB信號傳導通路的激活和后續(xù)細胞因子的分泌。sTLR2在以HIV 為代表的病毒感染中的抑制作用為病毒免疫療法和病毒相關疫苗制備提供新的方案，為病毒在人體內的發(fā)生發(fā)展和治療預防提出新的思路。