腫瘤中PD-L1表達調(diào)控的分子機制研究進展①

胡唯偉 楊大松 （大理大學(xué)，大理671000）

T 細胞選擇性識別并清除病原和不正常細胞如腫瘤細胞來維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，T 細胞通過其受體（T cell receptor，TCR）與靶細胞表面組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complexes，MHC）結(jié)合來識別這些異常的細胞，除此之外，這一識別過程還受T細胞共刺激/共抑制受體和相應(yīng)配體（免疫檢查點）調(diào)控，例如：細胞毒性T 淋巴細胞相關(guān)蛋白（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CT?LA-4）、程序性死亡受體 1（programmed death-1，PD-1，PDCD1 基因編碼）、程序性死亡配體 1（pro?grammed death-ligand 1，PD-L1，CD274 基因編碼）TIM3（T cell immunoglobulin and mucin domain-con?taining protein 3）、LAG3（lymphocyte-activation gene 3）等，過度活化的T細胞能夠攻擊機體正常細胞，造成自身性免疫疾病。因此這些免疫檢查點嚴(yán)密調(diào)控T細胞的生理功能，能維持機體的免疫平衡。

PD-1/PD-L1 免疫檢查點在許多惡性腫瘤治療靶點中脫穎而出，靶向PD-1/PD-L1藥物的臨床試驗已有1 000 多項，盡管阻斷PD-1/PD-L1 的治療能顯著改善患者的預(yù)后，但只有少數(shù)患者對這些治療有長久的響應(yīng)。PD-L1 在多種腫瘤中高表達，如非小細胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、腎細胞癌、胃癌、甲狀腺乳頭狀癌和睪丸癌等，PD-L1 的高表達與患者預(yù)后不良密切相關(guān)［1］，除了腫瘤細胞表達PD-L1，腫瘤微環(huán)境和淋巴結(jié)中有多種類型的宿主細胞也表達PDL1，包括樹突狀細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和T 細胞［2］。PD-L1與T細胞PD-1結(jié)合后激活Src同源2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP-1、SHP-2），導(dǎo)致TCR激活通路的抑制，進而抑制T 細胞的活化，造成T 細胞耗竭，產(chǎn)生腫瘤免疫逃逸。PD-L1 在多種腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中的表達與臨床治療響應(yīng)密切相關(guān)，本文將總結(jié)現(xiàn)有調(diào)控PD-L1的分子機制，為探索新的調(diào)控PD-L1的分子機制提供參考。

1 PD-L1的結(jié)構(gòu)和功能

PD-L1 是Ⅰ型跨膜蛋白屬于免疫球蛋白超家族，PD-L1包含Ig-V 和Ig-C 樣胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和不含下游信號活化序列的胞漿結(jié)構(gòu)域［3］。PDL1細胞外結(jié)構(gòu)域和PD-1相互作用能誘導(dǎo)PD-1的構(gòu)象變化，通過Src 激酶家族磷酸化細胞質(zhì)免疫受體酪氨酸抑制序列（ITIM）和免疫受體酪氨酸開關(guān)序列（ITSM），這些磷酸化酪氨酸序列隨后募集酪氨酸磷酸酶（SHP-2和SHP-1）來減弱T細胞活化信號，抑制T 細胞增殖、存活、細胞因子釋放和其他效應(yīng)功能。PD-L1 還能與T 細胞上CD80 結(jié)合，遞送抑制性信號來抑制T細胞的活化。PD-L1結(jié)合PD-1后向腫瘤細胞傳遞促生存信號，來抵抗Fas 誘導(dǎo)的凋亡［4］。在沒有PD-1 結(jié)合信號的情況下，PD-L1 可保護腫瘤細胞免受Ⅰ型和Ⅱ型干擾素的細胞毒及細胞毒T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞裂解［5］。

2 基因組改變和重排對PD-L1的調(diào)控

編碼PD-L1 的基因CD274 位于染色體9p24.1上，該染色體區(qū)域重排包括擴增和移位，已有報道在原發(fā)性縱膈大B淋巴細胞瘤、非小細胞肺癌、鱗狀細胞癌和EB 病毒陽性的胃癌中PD-L1 通過此種方式高表達，在原發(fā)性縱膈大B淋巴細胞瘤中，20%患者出現(xiàn)移位，29%患者出現(xiàn)擴增，對霍奇金淋巴瘤多樣本隊列深入分析顯示在97%的受試病例中PDL1 位點發(fā)生了改變［6-7］。參與炎癥通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的JAK2 同樣位于染色體9p 上，JAK2 的擴增通過增強IFN-γ 信號通路來促進 PD-L1 表達［6，8］。在不同腫瘤中發(fā)現(xiàn)小部分患者PD-L1 的3'UTR 區(qū)域缺失導(dǎo)致PD-L1 表達的增加，通過CRISPR Cas9 技術(shù)敲除PDL1 3'UTR 區(qū)域，使 PD-L1 mRNA 表達更加穩(wěn)定，在調(diào)節(jié)PD-L1 基因的篩選中，發(fā)現(xiàn)通過基因陷阱技術(shù)造成PD-L1 3'UTR 缺失的基因富集在PD-L1 高表達的細胞中［9-10］。迄今為止，染色體畸變導(dǎo)致PD-L1高表達的腫瘤是否對PD-1/PD-L1 阻斷治療反應(yīng)率增加還沒有系統(tǒng)的研究。在卵巢癌中PD-L1 3'UTR 區(qū)域缺失的患者對PD-1 阻斷治療有很好的響應(yīng)［11］。因此檢測PD-L1基因在染色體的重排可以作為是否對PD-1/PD-L1阻斷治療響應(yīng)的標(biāo)志物。

3 表觀遺傳修飾對PD-L1的調(diào)控

表觀遺傳修飾同樣參與了對PD-L1 表達的調(diào)控，在多種腫瘤中檢測到PD-L1啟動子甲基化，在急性淋巴細胞白血?。ˋML）中，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑能夠顯著促進PD-L1 的表達，PD-L1 啟動子甲基化與前列腺癌復(fù)發(fā)密切相關(guān)，與結(jié)腸癌的患者生存期也密切相關(guān)，在非小細胞肺癌中，PD-L1啟動子高度甲基化導(dǎo)致PD-L1 低表達，造成對PD-1 治療的耐藥，在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤中，IDH 突變患者與無突變患者相比，PD-L1啟動子甲基化水平增加［12-15］。組蛋白修飾也參與對PD-L1的調(diào)控，在胰腺癌中，組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶MLL1能夠使H3K4me3富集到PD-L1啟動子上，促進PD-L1 的表達，抑制MLL1 能夠顯著抑制H3K4me3 在 PD-L1 啟動子區(qū)域的富集［16］。組蛋白乙?；Y(jié)合蛋白BET 結(jié)合到CD274 啟動子區(qū)域，促進PD-L1 mRNA 表達，抑制組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶能夠促進PD-L1 的表達，抑制組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶能夠促進PD-L1 的表達，但抑制組蛋白去乙?；窰DAC6卻抑制了PD-L1的表達，機制研究發(fā)現(xiàn)抑制HDAC6 是通過抑制STAT3 的激活進而抑制了PD-L1 的表達［17］。甲基化轉(zhuǎn)移酶 EZH2 通過活化H2K27me3 來抑制 PD-L1 的表達，PARP1 蛋白能夠通抑制EZH2來促進PD-L1的表達［18-20］。

4 炎癥信號通路參與對PD-L1的調(diào)控

炎癥信號通路參與對PD-L1 的調(diào)控，免疫細胞產(chǎn)生許多可溶性因子促進PD-L1 的表達，已有報道在多種腫瘤、健康組織和免疫細胞中，IFN-γ 參與對PD-L1表達的調(diào)控，IFN-γ作為一種促炎因子主要由活化的 T 細胞和 NK 細胞分泌，IFN-γ 結(jié)合其受體后活化下游JAK-STAT 信號通路，主要通過STAT1 激活下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達，稱為干擾素效應(yīng)因子（interferon-responsive factors，IRFs），其中 IRF1 在IFN-γ 誘導(dǎo) PD-L1 的調(diào)控中起主要作用。PD-L1 在腫瘤細胞和免疫細胞中受調(diào)控的方式不同，在肉瘤小鼠模型中，IFN-γ 阻斷抗體能夠顯著抑制腫瘤細胞中PD-L1 的表達，但只能部分抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞中 PD-L1 的表達［21］。在對 PD-1 阻斷治療不響應(yīng)的患者中，發(fā)現(xiàn)JAK1/2 的突變，這些腫瘤通過進化其他途徑而不是通過PD-L1 通路來產(chǎn)生免疫逃逸［22］。除了 IFN-γ 外，在黑色素瘤細胞、內(nèi)皮細胞、單核細胞和樹突狀細胞中，Ⅰ型干擾素IFN-α 和IFN-β也參與對PD-L1表達的調(diào)控［23］。脂多糖（lipo?polysaccharide，LPS）通過 TLR4-NF-κB 通路來誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素分泌來參與對PD-L1 的調(diào)控，在黑色素瘤中，抑制 NF-κB 只能部分阻斷 IFN-γ 對 PD-L1 的調(diào)控，說明NF-κB不直接參與對PD-L1的調(diào)控，兩個信號通路之間存在交聯(lián)［24-25］。其他炎癥因子如IL-17、IL-10、TNF-α、IL-4、IL-1β、IL-6和IL-27等也有報道參與對PD-L1 的調(diào)控。抗炎因子TGF-β 參與對PD-L1的調(diào)控是條件依賴性的，在體外細胞模型中，TGF-β 能夠抑制單核細胞和腎小管上皮細胞中PDL1的表達，但在胰島移植的體內(nèi)模型中，CD8+T細胞產(chǎn)生TGF-β 是細胞持續(xù)表達PD-L1 所必需的，在樹突狀細胞中同樣觀察到TGF-β 促進PD-L1 的表達［26-29］。在不同疾病中，不同的炎癥因子激活的炎癥通路對PD-L1 的調(diào)控也各不相同，需要結(jié)合體外和體內(nèi)試驗來共同闡明，同時結(jié)合對T 細胞功能的調(diào)控來解釋不同炎癥通路在疾病中的作用。

5 致癌信號通路參與對PD-L1的調(diào)控

腫瘤中致癌信號通路不僅參與對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控，同時參與對PD-L1的表達調(diào)控，來協(xié)助腫瘤細胞產(chǎn)生免疫逃逸，這種調(diào)控主要是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、信號通路效應(yīng)分子和上游受體來參與。許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與對PD-L1 的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控，癌基因 MYC 直接參與對 PD-L1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［30］，缺氧是腫瘤共有特征之一，通過缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxiainducible factors，HIFs）來激活下游基因的表達。HIF-1α 和 HIF-2α 均能直接與 PD-L1 啟動子區(qū)域缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response element，HRE）結(jié)合，參與對PD-L1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子STAT3被多種生長因子和炎癥因子調(diào)控，參與對多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控，已有報道STAT3 直接參與對PD-L1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。NF-κB能夠被多種癌基因突變和炎癥信號通路激活，已有報道抑制NF-κB 能顯著抑制PDL1 的表達，NF-κB 亞基 RelA 能夠與 PD-L1 啟動子區(qū)域結(jié)合，證明NF-κB 直接參與對PD-L1 的表達調(diào)控［31］。AP-1 作為二聚化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，包含c-Jun、FOS、MAF 和 ATF 亞基，已經(jīng)鑒定 AP-1 與 PD-L1 第一個內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合來參與對PD-L1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［32］。CDK5 通過轉(zhuǎn)錄后修飾共抑制分子IRF2BP2來造成IRF2 的不穩(wěn)定，進而解除IRF2 對IRF1 的抑制，促進 IRF1 對 PD-L1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［33］。Ⅰ型和Ⅱ型干擾素通過活化PI3K-AKT-mTOR 信號通路來參與干擾素依賴的mRNA 轉(zhuǎn)錄，干擾素受體信號通路和PI3K-AKT-mTOR 信號通路之間存在協(xié)同作用，抑制PI3K-AKT 信號通路能夠抑制 IFN-γ 對 PD-L1 的調(diào)控，同時PI3K-AKT 信號通路也可以不依賴IFN-γ 信號通路來參與對PD-L1的調(diào)控［34］。在非小細胞肺癌中EGF 通過PI3K 信號通路誘導(dǎo)PD-L1表達，在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞中17β 雌二醇通過PI3K信號通路來誘導(dǎo)PD-L1 的表達，在樹突狀細胞中CpG 或 poly（I：C）通過 PI3K 信號通路來誘導(dǎo) PD-L1表達［35-36］。在BRAF突變的黑色素瘤細胞中，通過活化STAT3 和MAPK 信號通路下游JUN 來促進PD-L1的表達，MEK 抑制劑能夠顯著抑制JUN 和STAT3 的活化，同時阻斷TLR配體對PD-L1的調(diào)控［37］。MAPK通路中的p38同樣參與了對PD-L1的調(diào)控［38］。KRAS突變會活化下游MEK/ERK 信號通路能夠促進PDL1 的表達，EGFR 的突變在配體EGF 刺激下會活化下游ERK、mTOR、NF-κBp65、STAT3 和JAK2-STAT1信號通路來促進 PD-L1 的表達［39-41］。ALK 癌基因信號通路通常會引起基因移位和擴增，在淋巴瘤中NPM-ALK 的融合會活化下游MEK-ERK 和STAT3信號通路促進PD-L1 的表達，在非小細胞肺癌中，EML4-ALK 融合會活化下游 ERK、AKT、STAT3 和HIF-1α 來促進PD-L1的表達［42-43］。在非小細胞肺癌中，腺苷受體 A1（adenosine A1 receptor，ADORA1）可以抑制cAMP 通過cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）活化cAMP 依賴性轉(zhuǎn)錄因子3（cAMP-depen?dent transcription factor 3，ATF3），進而抑制了ATF3對PD-L1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通過ADORA1 抑制劑可以促進PD-L1 的表達，增加患者對PD-1 抗體治療的敏感性［44］。最近研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌中血紅素產(chǎn)生受阻激活了綜合應(yīng)激反應(yīng)通路（integrated stress response，ISR），ISR 活化后通過翻譯起始因子eIF5B 來促進PD-L1的表達［45］。

6 MicroRNA對PD-L1的調(diào)控

在正常生理狀態(tài)下，miRNAs 的功能是轉(zhuǎn)錄后通過介導(dǎo)靶基因mRNA 的降解或者通過抑制翻譯來調(diào)節(jié)靶基因的表達。miRNAs 可以結(jié)合PD-L1 mRNA 直接參與對PD-L1 的調(diào)控，或者通過結(jié)合調(diào)控PD-L1 基因的mRNA 來間接參與對PD-L1 的調(diào)控。miR-513 直接結(jié)合PD-L1 的3'UTR 抑制PD-L1的表達，IFN-γ 可以抑制 miR-513 的表達，TNF-α 和IFN-γ 能夠促進 miR-155 的表達來抑制 PD-L1 的表達，miR-513 和 miR-155 可以作為 IFN-γ 動態(tài)調(diào)控PD-L1 表達的分子［46-47］。在非小細胞肺癌中 p53 通過 miR-34a 來抑制 PD-L1 的表達，此外 miR-142-5p、miR-93、miR-106b、miR-138-5p、miR-217、miR-200、miR-152、miR-570、miR-17-5p、miR-15a、miR-193a和miR-16 都參與抑制PD-L1 的表達。在結(jié)腸癌中，miR-20、miR-21 和 miR-130b 通過抑制 PTEN 的表達來間接促進PD-L1的表達，在非小細胞肺癌中，miR-197 通過抑制CKS1B-STAT3 信號通路來間接抑制PD-L1的表達［48-49］。

7 翻譯后修飾對PD-L1的調(diào)控

多種調(diào)控分子參與對PD-L1 蛋白的調(diào)控，含有β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)序列E3 泛素蛋白連接酶（β-TrCP）結(jié)合 PD-L1 的 S176 位點使 PD-L1 發(fā)生 K48 泛素化。CMTM（chemokine-like factor MARVEL transmem?brane domain-containing family）家族成員 CMTM4 和CMTM6 能夠同PD-L1 蛋白直接相互作用，增強PDL1的穩(wěn)定性，CMTM6能夠與PD-L1共定位于質(zhì)膜和循環(huán)內(nèi)體，保護PD-L1 免受溶酶體介導(dǎo)的降解，CMTM6 同時也能增強PD-L1 蛋白的半衰期，抑制PD-L1 泛 素 化 ，敲 除 CMTM6 后 發(fā) 現(xiàn) CMTM4 同CMTM6 發(fā)揮相似的調(diào)控功能參與對PD-L1 的調(diào)控。蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)很少的蛋白與CMTM6 互作，提示CMTM6 可作為一個很有前景的治療靶點［50-51］。CyclinD-CDK4 介導(dǎo) SPOP 蛋白磷酸化，SPOP 蛋白與E3 泛素連接酶復(fù)合物 APC/CCdh1解離，SPOP 是 Cul?lin3 的一種銜接蛋白，作為E3 泛素連接酶降解PDL1，CDK4 通過間接作用使PD-L1 泛素化降解來負調(diào)控PD-L1［52］。在乳腺癌細胞中，糖原合酶激酶3b（GSK3b）和非糖基化的PD-L1 之間存在相互作用，從而促進 PD-L1 的降解［53］。在乳腺癌中，NF-κB 信號通路可以誘導(dǎo)COP9 信號體5（CSN5）的表達來去泛素化PD-L1，進而促進PD-L1的表達［54］。PD-L1胞外區(qū)（N35、N192、N200、N219）是糖基化結(jié)合位點，糖基化能夠穩(wěn)定PD-L1 蛋白，使PD-L1 蛋白半衰期從4 h 延長到12 h，突變這4 個糖基化位點能夠促進抗腫瘤免疫應(yīng)答，Sigma1 和FKBP51 促進糖基化的PD-L1折疊，增強其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的穩(wěn)定性［55-56］。寡糖基轉(zhuǎn)移酶STT3 將聚糖結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到PD-L1，IL-6/JAK1通路促進PD-L1與STT3作用，促進PD-L1的糖基化［57］。PD-L1 糖基化還能夠促進其與 PD-1 的結(jié)合，EGF/EGFR 信號通路能夠通過β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 3（β-1，3-N-acetylglucosaminyl?transferase 3，B3GNT3）介導(dǎo)多聚乙酰乳糖胺（poly-N-acetyllactosamine，poly-LacNAc）來使PD-L1（N192、N120）發(fā)生糖基化，促進PD-L1同PD-1結(jié)合［58］。PDL1 胞外區(qū)域含有激酶磷酸化位點，GSK3β 參與對PD-L1（T180、S184）的磷酸化調(diào)控，同時募集 E3 泛素連接酶使 PD-L1 在胞漿中降解［59］。JAK1 磷酸化PD-L1的Y112位點，促進PD-L1同STT3作用形成復(fù)合體，導(dǎo)致PD-L1糖基化同時移動到細胞膜表面［57］。

8 研究展望

以PD-L1-PD-1 軸為靶點的免疫療法在腫瘤治療中顯示出很好的前景，但是只有小部分患者有響應(yīng)。PD-L1 的表達水平可以用來作為抗PD-1/PDL1 療法能否響應(yīng)的標(biāo)志物。在許多癌癥中，與PDL1 陰性腫瘤患者相比，PD-L1 陽性腫瘤患者有更高的客觀應(yīng)答率，提升無進展生存期和總體生存率。然而也會出現(xiàn)PD-L1陰性腫瘤患者對治療響應(yīng)，PDL1 陽性腫瘤患者對治療產(chǎn)生抵抗。因此研究在個體患者中其他檢查點分子以及調(diào)控PD-1/PD-L1 檢查點的其他分子機制十分重要，同時需要研究腫瘤微環(huán)境中表達PD-1 的其他細胞以及PD-1 下游信號分子。開發(fā)靶向調(diào)控PD-L1上游分子的藥物不能完全阻斷PD-L1 的表達，同時PD-L1 抗體藥物不能足夠快速阻斷新出現(xiàn)的PD-L1 與PD-1 的結(jié)合，這些因素都是影響靶向PD-1/PD-L1 檢查點治療效果的因素。因此抑制調(diào)控PD-L1 表達的上游分子聯(lián)合PDL1 阻斷療法可能成為阻斷PD-1/PD-L1 檢查點的有效策略。