人趨化素樣因子超家族成員CMTM4在疾病中對細胞功能的調(diào)控*

王雅心 綜述，趙秀娟，朱鳳雪 審校

(北京大學(xué)人民醫(yī)院創(chuàng)傷救治中心 100044)

CMTM家族即趨化素樣因子(CKLF)樣含MARVEL穿膜結(jié)構(gòu)域超家族(CMTM)，由北京大學(xué)人類疾病基因研究中心韓文玲等率先在國際上報道[1]，利用經(jīng)植物血凝素(PHA)刺激后的人髓系白血病U937細胞系分離出CKLF，通過表達序列標簽(ESTs)數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)分析陸續(xù)發(fā)現(xiàn)趨化素樣因子超家族(CKLFSF)1～8。這9個在人類中表達的新基因?qū)?yīng)的蛋白功能介于經(jīng)典趨化因子和四跨膜蛋白超家族(M4SF)之間。2005年國際人類基因命名委員會(HUGO)依據(jù)編碼產(chǎn)物含有的MARVEL穿膜結(jié)構(gòu)域，將CKLFSF1～8更名為CMTM1～8，CMTM4是家族成員之一[2-3]。含MARVEL結(jié)構(gòu)域的蛋白一般都擁有四次跨膜區(qū)，參與膜蛋白轉(zhuǎn)運與細胞間緊密連接的形成。近幾年在腫瘤領(lǐng)域的研究發(fā)現(xiàn)CMTM4可能扮演抑癌基因的角色，表達水平的高低變化影響腫瘤細胞及相關(guān)免疫細胞的生物學(xué)功能，是潛在的癌癥免疫治療靶點，越來越多的研究團隊將關(guān)注點投向CMTM4。

1 CMTM4的發(fā)現(xiàn)

2003年北京大學(xué)人類疾病基因研究中心利用抑制性減數(shù)雜交技術(shù)(SSH)[4-5]，從經(jīng)過PHA刺激同時IL-10抑制的U937細胞中發(fā)現(xiàn)CKLF，在此基礎(chǔ)上通過比對與分析，發(fā)現(xiàn)編碼234個氨基酸的CMTM4全長cDNA序列，隨后采用PCR、DNA測序和Northern blot成功驗證這一新基因的真實存在，并將CMTM4的cDNA序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫。隨后，研究人員對人類和小鼠的CMTM家族基因進行比對，發(fā)現(xiàn)CMTM4的人鼠同源性在整個家族中最高，達97.6%，且在機體不同組織內(nèi)廣泛表達，這說明CMTM4在進化過程中高度保守。DNA測序發(fā)現(xiàn)人類CMTM4含有3種剪接體v1、v2、v3，而目前在小鼠體內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)CMTM4-v2的表達，與人類有95.7%的同源性，提示在動物實驗中采用小鼠作為人類疾病研究的實驗對象具有相對可靠性[1]。

為了深入研究CMTM4的表達情況及生物學(xué)功能，該研究團隊于2007年制備純化出具有高效價、高特異性的CMTM4多肽抗體Ab1和Ab2。Ab1特異性識別v1、v2剪接體，還可識別天然構(gòu)象的內(nèi)源性蛋白，結(jié)合小鼠內(nèi)源性CMTM4，可用于Western blot及免疫組織化學(xué)實驗；Ab2僅可用于Western blot實驗特異性識別CMTM4-v1，不可用于免疫組織化學(xué)檢測[6]。多抗的研制為后續(xù)開展CMTM4功能研究提供可能。

2 CMTM4的結(jié)構(gòu)特征

CMTM4與CKLF、CMTM1-3緊密分布在染色體16q22.1上形成基因簇，在諸多腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)該位點附近經(jīng)常發(fā)生基因改變，其中包含部分抑癌基因，所以該基因簇可能與抑癌作用相關(guān)[7-9]。測序結(jié)果顯示CMTM4含有v1、v2、v3三種不同剪接體，Northern blot測得蛋白分子大小依次為1.2、3.4、8.2 kb，分別對應(yīng)編碼234、208和179個氨基酸[1]，CMTM4-v2是全長cDNA的產(chǎn)物，在小鼠與人類高度同源，所以是3種剪接體中最穩(wěn)定、最保守的。在組織和細胞系內(nèi)CMTM4-v1和-v2表達頗為廣泛，而CMTM4-v3表達較局限，只在腎和胎盤中被發(fā)現(xiàn)[1,10]。NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)提供的數(shù)據(jù)顯示CMTM4在甲狀腺中表達量最高，其次為腦、腎、結(jié)腸，肝、脾、淋巴結(jié)和骨髓中表達量最少，幾乎不表達。CMTM4 屬于膜蛋白，獨特的MARVEL結(jié)構(gòu)域及在細胞質(zhì)膜、高爾基體膜及胞內(nèi)囊泡上的定位(來自The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫，https://www.proteinatlas.org/)，共同提示其可能具有調(diào)節(jié)跨膜運輸與緊密連接形成的功能[11]，部分研究證實其調(diào)節(jié)包括血管內(nèi)皮鈣黏連蛋白(VE-cadherin)和程序性死亡受體1(PD-L1)在內(nèi)的膜分子的運輸與穩(wěn)定性，且在某些惡性腫瘤中表現(xiàn)出調(diào)節(jié)腫瘤細胞和相關(guān)免疫細胞生物學(xué)行為的作用[12-15]。

3 CMTM4在疾病中對細胞功能的調(diào)控

擁有特殊跨膜結(jié)構(gòu)域的CMTM家族在人類疾病的發(fā)病、進展過程中均扮演著重要角色。已有研究證實家族成員在免疫、造血、循環(huán)、生殖等系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用，對腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移亦具有一定影響[16-21]。由于CMTM4基因在染色體上的定位附近存在一定數(shù)量抑癌基因，且利用NCBI、GEO、TCGA、TumourProfile等數(shù)據(jù)庫完成生物信息學(xué)分析后均發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤疾病中癌組織CMTM4基因表達量低于正常組織，研究者們便將關(guān)注點集中于探究CMTM4對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，對采集的腫瘤與正常組織標本進行基因和蛋白水平檢測，均發(fā)現(xiàn)具有表達差異——癌組織CMTM4水平低于癌旁組織。為進一步明確該基因?qū)毎飳W(xué)行為及功能的影響，實驗人員在體外利用基因編輯技術(shù)干預(yù)細胞CMTM4表達水平，分別從細胞增殖與細胞周期、遷移與侵襲能力、細胞凋亡等方面入手進行研究[15,22]。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)其在非腫瘤疾病中也存在調(diào)節(jié)作用。以下將對已證實的CMTM4對細胞功能的影響分類進行闡述。

3.1 對細胞增殖與細胞周期的影響

CMTM4表達水平對細胞增殖能力具有明顯影響作用。最初，KITTLER等[23]從5 305個esiRNAs(endoribonuclease-prepared short interfering)中篩選出37個對Hela細胞增殖分裂有影響的基因，CMTM4便是其中之一，敲除CMTM4基因不會終止細胞有絲分裂，紡錘體形態(tài)正常，亦不致細胞死亡，但可導(dǎo)致有絲分裂時胞質(zhì)分裂異常，形成雙核細胞。2010年P(guān)LATE等[14]觀察到的這一現(xiàn)象開展更加深入的機制研究，利用質(zhì)粒過表達Hela細胞CMTM4基因，發(fā)現(xiàn)活細胞計數(shù)、細胞集落形成數(shù)目均明顯減少。細胞周期是影響細胞增殖的關(guān)鍵機制，從流式細胞分析得到的細胞周期結(jié)果來看，無論是否預(yù)先對周期進行同步化處理，過表達CMTM4均導(dǎo)致細胞大量阻滯于G2/M期，阻止細胞增殖[14]。上述兩個團隊的結(jié)果共同證明CMTM4對Hela細胞增殖與細胞周期均產(chǎn)生影響。除明確了對Hela細胞有影響外，有學(xué)者還先后在腎透明細胞癌(ccRCC)[22]和結(jié)直腸癌(CRC)[15]中得出同樣的結(jié)論，通過上調(diào)及下調(diào)細胞CMTM4基因水平，借助CCK-8及活細胞計數(shù)觀察到CMTM4對786-O、HT29、SW480細胞系的增殖具有與對Hela細胞相同的影響，流式檢測也看到相同的細胞周期變化規(guī)律。

除腫瘤細胞外，荷蘭學(xué)者沉默及過表達HUVECs細胞系CMTM4基因，發(fā)現(xiàn)CMTM4表達減少對細胞增殖影響不大，但過表達導(dǎo)致細胞生長抑制，細胞周期停滯于G0/G1期[12]。這與在腫瘤中的研究結(jié)論存在差異，提示在非腫瘤性疾病中，CMTM4可能對細胞增殖和細胞周期發(fā)揮不完全一致的調(diào)節(jié)作用，存在分別研究的必要性。

在機制方面，目前僅有對ccRCC及CRC細胞的研究，且兩者機制并不相同。通過檢測ccRCC 786-O細胞周期調(diào)控的標志物表達水平發(fā)現(xiàn)，無論在轉(zhuǎn)錄還是翻譯水平上，CMTM4均上調(diào)細胞周期調(diào)控基因p21表達，上調(diào)的p21抑制Cdk1/CyclinB復(fù)合物對周期的調(diào)控作用致G2/M期阻滯，從而抑制786-O細胞增殖；另外，對參與調(diào)節(jié)CRC細胞增殖的信號通路進行Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)高表達CMTM4降低了AKT、ERK1/2、STAT3通路磷酸化水平，從而抑制CRC細胞生長[15,22]。有趣的是，在ccRCC的786-O細胞中作為p21上游分子的p53未被檢測到激活，所以CMTM4是如何上調(diào)p21的還需進一步研究。

3.2 對細胞遷移與侵襲能力的影響

BEI等[24]針對CMTM4與肝細胞肝癌(HCC)患者腫瘤臨床病理特征進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CMTM4表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期都密切相關(guān)。隨后研究者利用劃痕實驗與Transwell實驗觀察CMTM4水平對細胞遷移與侵襲能力的影響，過表達CMTM4后的ccRCC 786-O和CRC SW480其遷移與侵襲能力均明顯減弱，而下調(diào)則使CRC HT29能力增強。在ccRCC中，CMTM4高表達上調(diào)p21水平，通過抑制Rho GTP酶及相關(guān)信號通路影響細胞遷移；而在CRC中，CMTM4發(fā)揮的抑制作用是借助AKT、ERK1/2、STAT3通路磷酸化水平降低實現(xiàn)的，但這并不一定適用于其他腫瘤細胞，還需大量研究對機制進行探索[15,22]。與上述研究結(jié)論不同的是，CHRIFI等[12]利用劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，過表達CMTM4后的HUVECs并不對細胞遷移產(chǎn)生影響，但沉默會導(dǎo)致其遷移能力顯著下降。

3.3 對細胞凋亡的影響

北京大學(xué)人類疾病基因研究中心先后對CMTM4過表達的HeLa細胞[14]、786-O細胞[22]和SW480細胞[15]進行Annexin V-PI染色及流式檢測，均未觀察到細胞凋亡的發(fā)生。從現(xiàn)有實驗結(jié)果看，CMTM4分子似乎與實體腫瘤細胞凋亡并無太大關(guān)系，并不直接致細胞凋亡。

這是否代表CMTM4與凋亡不存在任何聯(lián)系呢？并非如此。ZHANG等[9]在研究miR-205對慢性腎病(CKD)的影響時發(fā)現(xiàn)CMTM4可使腎細胞發(fā)生凋亡。CMTM4 mRNA的3′UTR區(qū)域有兩個miR-205結(jié)合位點，結(jié)合后可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)CMTM4 mRNA活性。在體外對HK-2細胞上調(diào)miR-205表達可保護細胞不發(fā)生凋亡，利用Western blot和雙熒光素報告酶基因?qū)嶒灆z測過表達miR-205的HK-2細胞時，均顯示CMTM4 表達減少。由此得知，miR-205通過減少CMTM4 表達量實現(xiàn)對腎細胞凋亡的抑制作用，CMTM4影響腎細胞凋亡，高表達的CMTM4促進凋亡發(fā)生。

此外，MEZZADRA等[13]和BURR等[25]在Nature上分別發(fā)表了關(guān)于CMTM與PD-L1蛋白存在相互作用的文章，其共同證明CMTM6是調(diào)控PD-L1蛋白穩(wěn)定性與半衰期的關(guān)鍵分子。而在MEZZADRA等[13]的研究中發(fā)現(xiàn)CMTM4作為CMTM6的替代分子，與CMTM6具有相同的功能，備用調(diào)控及保護PD-L1。MEZZADRA等[13]在實驗中敲低12種腫瘤細胞系模型CMTM6基因，結(jié)果顯示無論是細胞固有表達的PD-L1，還是受IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的PD-L1，其蛋白水平均有2～10倍不同程度的降低；此外在免疫方面，在抗原呈遞細胞如樹突狀細胞(DCs)上亦是如此。CMTM4與CMTM6有55%同源性，與PD-L1共表達在腫瘤細胞和抗原呈遞細胞膜上，兩個基因的表達并不影響PD-L1轉(zhuǎn)錄水平，而是影響從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸出的蛋白活性，在翻譯水平進行保護，防止其被泛素化降解，延長半衰期，從而增加PD-L1在腫瘤細胞和抗原呈遞細胞膜上的蛋白水平。該調(diào)控作用不借助IFN-γR介導(dǎo)的信號通路，亦不影響組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHC-Ⅰ)和PD-L2水平。上調(diào)的PD-L1與更多的T細胞膜上PD-1結(jié)合，負向調(diào)控T細胞功能，T細胞增殖減少、凋亡增多，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。當然，PD-1/PD-L1信號通路不僅僅影響腫瘤中T細胞功能，在細菌感染中同樣發(fā)揮重要作用[26]。所以，CMTM4可通過對PD-L1的調(diào)控，間接影響表達PD-1的T細胞發(fā)生凋亡[13,27]。

3.4 對細胞連接的影響

參與和(或)調(diào)節(jié)細胞連接的形成是跨膜蛋白最本質(zhì)的功能特性，細胞間黏附連接(AJs)對于維持血管內(nèi)皮完整性十分重要，參與血管出芽、新生血管形成過程。VE-cadherin是形成細胞間黏附連接的關(guān)鍵分子，而CMTM4正對其具有調(diào)節(jié)作用。CHRIFI等[12]沉默斑馬魚CMTM4基因，觀察到肌間血管生成障礙；胞內(nèi)免疫熒光染色顯示CMTM4不僅與VE-cadherin共定位于細胞膜上，還在胞內(nèi)共定位于循環(huán)利用VE-cadherin的Rab4+，Rab7+，EEA1+，Rab11+囊泡上，借助細胞內(nèi)吞循環(huán)運輸通路促進其內(nèi)化循環(huán)的同時，部分囊泡還與溶酶體結(jié)合發(fā)生降解，加快細胞膜上VE-cadherin新舊更替及AJs形成，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞連接分子的黏附力以增強內(nèi)皮細胞屏障功能，但CMTM4不具備促進VE-cadherin合成的能力，并不改變細胞總體蛋白量?？偟膩碚f，CMTM4促進VE-cadherin在細胞表面的再利用，形成黏附連接，調(diào)節(jié)血管生成和出芽。

3.5 其他

除影響體細胞功能，CMTM4對男性生殖細胞亦有調(diào)控作用。LIU等[28]根據(jù)CMTM4在睪丸中高度保守表達這一發(fā)現(xiàn)推測其在男性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮一定作用[1,14]，在對無精癥和弱精癥患者、老年患者及CMTM4基因敲除小鼠模型進行表型變化和蛋白組學(xué)分析后，發(fā)現(xiàn)CMTM4表達量減少可通過抑制精子運動能力和頂體反應(yīng)從而降低男性生育能力。隨后研究者對CMTM4-KO小鼠的睪丸和精子進行定量蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)的蛋白基本與細胞物質(zhì)運輸和DNA結(jié)合有關(guān)，影響精子代謝功能；表達下調(diào)的蛋白主要與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、α/β-微管蛋白及肌動蛋白的結(jié)合力和蛋白酶/蛋白酶抑制劑活性有關(guān)，阻礙精子生成過程中組蛋白向精蛋白的轉(zhuǎn)化，抑制精子活力和頂體反應(yīng)等功能，減少精子產(chǎn)生，降低精子質(zhì)量[29]。

4 小 結(jié)

既往研究證明在不同疾病背景下，CMTM4差異表達會影響某些細胞功能，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤領(lǐng)域，利用GEO、TCGA等數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析后，再采集臨床標本做基因及蛋白水平驗證，均發(fā)現(xiàn)與正常癌旁組織相比，CMTM4在癌組織的表達顯著降低；利用基因編輯的動物及細胞模型進行體內(nèi)外實驗，發(fā)現(xiàn)CMTM4高表達會抑制腫瘤細胞生長、增殖等生物學(xué)行為。目前在非腫瘤性疾病領(lǐng)域的研究較少，已證實的是CMTM4參與男性不育疾病的發(fā)生；另外，CMTM4對血管內(nèi)皮細胞黏附連接具有調(diào)節(jié)作用，在發(fā)生血管滲漏、破裂、血管再生障礙的疾病中扮演重要角色。

CMTM4在臨床疾病中的研究仍處于起步階段，現(xiàn)有研究雖已在部分疾病背景下對其功能及少數(shù)機制方面有所涉及，但無論在疾病模型還是作用機制方面，均有非常大的探索空間。目前的研究主要集中于腫瘤領(lǐng)域，但從MEZZADRA等[13]和BURR等[25]發(fā)表在Nature上的成果來看，CMTM4可通過干預(yù)PD-L1活性及半衰期來間接影響機體的獲得性免疫功能。所以在干預(yù)機體免疫系統(tǒng)功能、引發(fā)炎性反應(yīng)的疾病中，CMTM4或許會影響疾病的病理生理過程，成為一個潛在的診斷標志物或治療靶點。CMTM4在膜上表達量的改變是否可用作診斷、分期指標，CMTM4是否可作為藥物作用的新靶點用于疾病的治療，有待后續(xù)的研究來證實。另外，在機制方面，作為膜蛋白其是否存在于外分泌囊泡中干預(yù)信號物質(zhì)分泌，尚無從得知，仍存在很多空白亟待研究深入，以支持、指導(dǎo)CMTM4在臨床疾病中的應(yīng)用。