25-羥基膽固醇的免疫調(diào)控作用及其對(duì)結(jié)核肉芽腫形成的意義①

周 爽 李 丹 宋璟瑞 聞 馨 杜德兵 王德成

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，三峽大學(xué)感染與炎癥損傷研究所，宜昌443002）

1 概述

膽固醇在人體中具有多種生理功能，不僅參與細(xì)胞膜形成，還是合成膽汁酸、維生素D及甾體激素的原料。在脂質(zhì)脫氫酶和氧化酶的催化下，膽固醇環(huán)或側(cè)鏈上添加羥基形成一系列氧化衍生物，稱為氧固醇。早期認(rèn)為氧固醇的代謝只是一種簡(jiǎn)單的生物轉(zhuǎn)化，增加極性，利于體內(nèi)消除；上世紀(jì)90年代以來(lái)，通過(guò)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，ATH）的深入研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含大量氧固醇，從而引起研究者對(duì)氧固醇的重視［1］。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，氧固醇也是孕烯醇酮和甾體激素合成的中間體，且其還能與特定的受體相互作用，識(shí)別信號(hào)通路［2］。近年發(fā)現(xiàn)，氧化的膽固醇比未氧化的膽固醇更有助于免疫反應(yīng)［3］。25HC（25-hydroxycholesterol，25HC）屬于眾多膽固醇氧化物中的內(nèi)源性氧固醇，是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的唯一氧固醇，其在不同生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要免疫作用，包括抗病毒效應(yīng)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等［4］。CH25H（cholesterol 25-hydroxylase）是一種干擾素刺激基因的表達(dá)產(chǎn)物，是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)酶，可催化膽固醇生成25HC［5］。體內(nèi)與體外研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核感染時(shí)細(xì)胞內(nèi)CH25H∕25HC通路異常高表達(dá)［6-7］。結(jié)核患者肉芽腫區(qū)域存在豐富的泡沫細(xì)胞，且最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)或體外25HC均能誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞產(chǎn)生［8-9］。提示25HC可能介導(dǎo)泡沫細(xì)胞參與肉芽腫的形成，而CH25H∕25HC通路在結(jié)核肉芽腫中的作用目前未見(jiàn)報(bào)道。因此本文將討論25HC的免疫作用的進(jìn)展，并重點(diǎn)討論25HC在結(jié)核肉芽腫形成過(guò)程的作用。

2 25HC的免疫調(diào)控作用

2.1 25HC的抗病毒效應(yīng) 25HC具有明顯的抗病毒效應(yīng)，但其作用機(jī)制目前尚無(wú)定論。病毒感染會(huì)刺激細(xì)胞產(chǎn)生干擾素（interferons，IFNs），Ⅰ型和Ⅱ型IFNs能夠上調(diào)CH25H蛋白表達(dá)，CH25H主要通過(guò)其催化產(chǎn)物25HC來(lái)抵抗病毒入侵。Zika病毒感染細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)CH25H和25HC的水平顯著上調(diào)，25HC插入到病毒感染的細(xì)胞膜，降低細(xì)胞膜流動(dòng)性，阻斷病毒介導(dǎo)的細(xì)胞之間的膜融合，抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞［10］。研究顯示，過(guò)表達(dá)CH25H或用25HC處理細(xì)胞可抑制包膜病毒的復(fù)制，包括埃博拉、艾滋病病毒、水皰性口炎病毒及鼠皰疹病毒68等［11］。也有研究者認(rèn)為，25HC是通過(guò)影響蛋白質(zhì)復(fù)制、對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾，從而阻止病毒復(fù)制［12］。CH25H抵抗拉沙熱病毒的機(jī)制，便是通過(guò)影響GP1蛋白的糖基化來(lái)阻礙病毒與宿主受體的吸附，從而抑制病毒的入侵［13］。此外，氧固醇還可能激活綜合應(yīng)激反應(yīng)，這種反應(yīng)會(huì)激活轉(zhuǎn)錄重組，抑制蛋白質(zhì)合成，從而抑制病毒復(fù)制［14］。最新研究發(fā)現(xiàn)，豬繁殖和呼吸障礙綜合癥病毒還能通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解CH25H，進(jìn)一步說(shuō)明CH25H∕25HC具有重要的抗病毒作用［15］。

2.2 25HC調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng) 炎癥是十分常見(jiàn)的基本病理過(guò)程，抗炎和促炎因子維持平衡才能使機(jī)體既有效抵御致病因素的侵襲，又使炎癥反應(yīng)不至于過(guò)度強(qiáng)烈而損傷機(jī)體正常功能。在Toll樣受體的配體和Ⅰ型IFNs刺激下，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞均可表達(dá)大量的CH25H；CH25H可抑制B細(xì)胞中IgA產(chǎn)生，也可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中促存活因子表達(dá)而促進(jìn)胞內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)［16］。缺乏CH25H表達(dá)的巨噬細(xì)胞則會(huì)分泌更多的IL-1家族細(xì)胞因子［5］。25HC還能通過(guò)阻斷固醇調(diào)節(jié)響應(yīng)元件結(jié)合蛋白的激活，抑制炎性體活動(dòng)和后續(xù)的IL-1β的產(chǎn)生［5］。

研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病患者痰液中25HC的表達(dá)水平增加［17］；25HC能增加核因子κB的DNA結(jié)合活性，最終導(dǎo)致IL-8和IL-6釋放增多［18］。用25HC處理小鼠巨噬細(xì)胞時(shí)，趨化因子CCL5在培養(yǎng)基中呈劑量依賴性釋放［19］。25HC還是一種與整合素生理相關(guān)的激活因子，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［20］。此外，缺乏25HC的小鼠因其炎癥病理?yè)p傷減輕導(dǎo)致存活率增加，證實(shí)25HC具有放大炎癥信號(hào)的作用［21］。以上結(jié)果表明，25HC的炎性調(diào)節(jié)作用比較復(fù)雜，其既能促進(jìn)炎癥發(fā)生，也能抑制炎性損傷，提示其在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中的精細(xì)與微妙作用。

2.3 25HC參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 25HC是高效的肝X受體（liver X receptor，LXR）的配體，能激活LXR［22-23］。25HC能通過(guò)LXR增加膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體A1和ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體G的活性，抑制巨噬細(xì)胞和其他外周細(xì)胞中的膽固醇積累［24］。研究發(fā)現(xiàn)，25HC通過(guò)糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）信號(hào)通路介導(dǎo)了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的肌肉萎縮，小鼠腹腔注射25HC后，肌肉萎縮素1和肌肉特異性環(huán)指蛋白1的表達(dá)上升，并抑制了IGF-1∕Akt信號(hào)通路，激活了GSK3β信號(hào)通路［25］。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)氧化固醇結(jié)合蛋白2的抑制顯著增加25HC的水平，25HC通過(guò)p53∕SREBF2∕NFYA信號(hào)傳導(dǎo)途徑也能下調(diào)氧化固醇結(jié)合蛋白2的表達(dá)［26］。此外，25HC經(jīng)過(guò)CYP7B1催化后的產(chǎn)物7α，25-二羥基膽固醇（7α，25-dihydroxycholesterol，7α-25HC），是EB病毒誘導(dǎo)受體2（Epstein-Barr virus induced receptor 2，EBI2）的強(qiáng)效配體，而EBI2∕氧甾酮信號(hào)通路對(duì)適應(yīng)性免疫反應(yīng)非常重要［27］。EBI2在維持B細(xì)胞準(zhǔn)確定位中具有舉足輕重的作用，僅毫微摩爾的7α-25HC即可使激活的B細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的遷移反應(yīng)［28］。此外，7α-25HC與EBI2的相互作用還能促進(jìn)激活的CD4+T細(xì)胞遷移到炎癥組織［29］。雖然7α-25HC是否只能由25HC生成尚不明確，但目前發(fā)現(xiàn)其只能在有25HC的區(qū)域生成［30］。

3 25HC促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成

泡沫細(xì)胞是含有豐富脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞對(duì)死亡細(xì)胞及病原體的清除吞噬使巨噬細(xì)胞中含有大量的膽固醇等脂質(zhì)，豐富的膽固醇會(huì)刺激乙酰輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶，形成膽固醇酯，以脂滴的形式在細(xì)胞質(zhì)中儲(chǔ)存［31］。在Toll樣受體的激活，及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和單核細(xì)胞趨化因子CCL2等促炎因子的持續(xù)刺激下，巨噬細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)血清中低密度脂蛋白顆粒的流入和流出間的平衡轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞［32-33］。泡沫細(xì)胞最常見(jiàn)于ATH，膽固醇在動(dòng)脈內(nèi)膜沉積，泡沫細(xì)胞在血管中出現(xiàn)。人體中氧固醇與ATH的形成密切相關(guān)，ATH斑塊中含有大量的泡沫細(xì)胞和氧固醇，包括25HC；而激活轉(zhuǎn)錄因子3（activating transcription factor 3，ATF3）通過(guò)與ch25h基因的啟動(dòng)子直接結(jié)合，抑制ch25h的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞生成減少［9］。以上結(jié)果證實(shí)，25HC能誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞生成。SOTTERO等［34］證實(shí)25HC能誘導(dǎo)IL-8及多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致ATH形成。在ATH病理過(guò)程中，泡沫細(xì)胞的形成在很大程度上是由25HC介導(dǎo)的。神奇的是，LATHE等［35］發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默癥與血管粥樣硬化這兩種看似毫無(wú)關(guān)系的疾病竟有緊密聯(lián)系。與ATH患者病變相似，阿爾茲海默癥患者大腦內(nèi)血管壁明顯增厚，氧固醇、膽固醇前體和類固醇含量增多，并在大腦神經(jīng)元發(fā)生退化區(qū)域測(cè)得高表達(dá)的Ch25hmRNA，提示此處高表達(dá)的Ch25hmRNA與增厚的血管壁可能密切相關(guān)。

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，與ATH巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)的漸進(jìn)式積累與轉(zhuǎn)化相似，結(jié)核患者肺肉芽腫的脂質(zhì)含量比未感染的肺組織明顯增加，結(jié)核肉芽腫內(nèi)存在大量泡沫細(xì)胞［36］。研究報(bào)道，結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染可導(dǎo)致小鼠泡沫巨噬細(xì)胞內(nèi)Ch25h轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平均升高，且CH25H可使膽固醇脂質(zhì)含量增加，促進(jìn)MTB在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存［37］。目前認(rèn)為，25HC通過(guò)抑制膽固醇酯的水解，減少細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇的形成，抑制低密度脂蛋白受體的表達(dá)，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成［38］。25HC促進(jìn)泡沫細(xì)胞生成的詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

4 25HC介導(dǎo)泡沫細(xì)胞參與結(jié)核性肉芽腫形成

4.1 泡沫細(xì)胞參與結(jié)核性肉芽腫形成 肺結(jié)核由MTB引起，經(jīng)呼吸道傳播，結(jié)核病作為嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，治療效果卻并不理想。結(jié)核從潛伏期、亞臨床感染發(fā)展為活動(dòng)性疾病，最終導(dǎo)致感染性桿菌的傳播，這一過(guò)程可從肉芽腫水平來(lái)局部地確定病情進(jìn)展。因此，了解肉芽腫的形成過(guò)程，對(duì)了解感染的進(jìn)展演變至關(guān)重要。結(jié)核性肉芽腫是細(xì)菌與宿主感染部位的細(xì)胞局部相互作用的結(jié)果，意味著免疫系統(tǒng)對(duì)感染的抑制，這是一個(gè)“僵持”的時(shí)期，在此期間，細(xì)菌的數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定，主要是一群非復(fù)制狀態(tài)的桿菌維持在“潛伏期”。肉芽腫對(duì)病灶既可進(jìn)行局部滅菌，也可形成局部壞死，液化形成空洞導(dǎo)致感染性細(xì)菌在呼吸道擴(kuò)散。小鼠感染結(jié)核菌后，早期的肺組織沒(méi)有任何損傷，組織反應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定，但上皮細(xì)胞和固有層之間的細(xì)胞數(shù)目增加［39-40］。沒(méi)有細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)菌基因組等碎片堆積，表明細(xì)菌數(shù)量仍然相對(duì)穩(wěn)定［41］。當(dāng)易感宿主吸入結(jié)核桿菌，肺泡巨噬細(xì)胞就會(huì)將其吞噬并激活，激活后的巨噬細(xì)胞釋放TNF、炎癥因子和趨化因子，肉芽腫的形成需要持續(xù)的TNF信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)維持細(xì)胞招募和趨化因子濃度［42-43］。巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進(jìn)入感染部位，隨后巨噬細(xì)胞分化成幾種不同的形態(tài)，包括多核巨細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞和充滿脂滴的泡沫巨噬細(xì)胞［44］；接著結(jié)構(gòu)更加分層，泡沫細(xì)胞進(jìn)一步增多，成纖維細(xì)胞等圍繞在巨噬細(xì)胞層外，并將淋巴細(xì)胞排除在外，形成一個(gè)多細(xì)胞聚集的慢性炎癥區(qū)域，繼而發(fā)展為泡沫細(xì)胞豐富的肉芽腫［45］。

在MTB感染初期，巨噬細(xì)胞內(nèi)的吞噬體內(nèi)有多個(gè)桿菌，稱其為早期脂質(zhì)體［46］。當(dāng)感染的巨噬細(xì)胞慢慢出現(xiàn)在肉芽腫周圍時(shí)，早期脂質(zhì)體形態(tài)發(fā)生變化，慢慢失去了甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性的特性，這種失去染色陽(yáng)性的脂質(zhì)體的出現(xiàn)即標(biāo)志著泡沫細(xì)胞生成［46］。結(jié)核性肉芽腫的一個(gè)顯著特點(diǎn)是吞噬細(xì)菌的巨噬細(xì)胞分化為脂質(zhì)豐富的泡沫細(xì)胞。脂質(zhì)是胞內(nèi)MTB生長(zhǎng)所必需的，其在肉芽腫微環(huán)境下能夠利用的營(yíng)養(yǎng)有限，因此脂質(zhì)豐富的泡沫細(xì)胞則成為保證細(xì)菌生長(zhǎng)的重要物質(zhì)。將膽固醇用放射性碳（C14）標(biāo)記追蹤，發(fā)現(xiàn)環(huán)上的碳轉(zhuǎn)化為二氧化碳（CO2），而側(cè)鏈上的26位碳被MTB吸收到其膜脂中，包括細(xì)胞壁上一種叫作PDIM（phthiocerol dimycocerosates）的脂質(zhì)成分［47］。這證明泡沫細(xì)胞對(duì)MTB在肉芽腫中的生存有重要作用。肉芽腫內(nèi)泡沫細(xì)胞位于肉芽腫中干酪樣壞死中心與淋巴細(xì)胞的交界處，緊密圍繞在壞死中心周圍［48］；而干酪樣壞死組織成分主要為膽固醇、膽固醇酯及磷脂等，與泡沫細(xì)胞中的脂質(zhì)成分基本一致［49］。泡沫細(xì)胞在肉芽腫內(nèi)的位置及其胞內(nèi)脂質(zhì)成分，都證明泡沫細(xì)胞在肉芽腫形成及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

4.2 25HC介導(dǎo)泡沫細(xì)胞參與結(jié)核性肉芽腫形成CD4+T細(xì)胞是MTB感染的關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，結(jié)核感染患者與健康對(duì)照者相比，其CD4+T細(xì)胞內(nèi)CH25H表達(dá)顯著增高，25HC含量也明顯增加，而且在活動(dòng)性肺結(jié)核患者體內(nèi)升高更明顯［50］。體外研究顯示，減毒菌株（細(xì)胞壁有缺陷）與野生型MTB感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)CH25H表達(dá)水平都明顯增高，25HC含量也顯著增加，尤其是野生型MTB［7］。以上結(jié)果顯示，結(jié)核感染時(shí)免疫細(xì)胞內(nèi)CH25H∕25H通路在體內(nèi)體外均表現(xiàn)為異常高表達(dá)。肉芽腫是MTB感染后形成的特征性標(biāo)志物，也是結(jié)核病理診斷標(biāo)志物。大量研究證實(shí)泡沫細(xì)胞參與肉芽腫形成的全過(guò)程，為細(xì)菌提供碳源，并成為細(xì)菌抵御外界不良因素的屏障，保障細(xì)菌在肉芽腫內(nèi)穩(wěn)定的生存。泡沫巨噬細(xì)胞保證細(xì)菌的持續(xù)感染，介導(dǎo)肉芽腫形成的關(guān)鍵。因此，在結(jié)核感染期間發(fā)生的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝改變可能與感染進(jìn)展有關(guān)，通過(guò)減少泡沫細(xì)胞的生成，可能有助于控制肉芽腫的形成。以上結(jié)果提示，25HC可能通過(guò)介導(dǎo)泡沫細(xì)胞參與肉芽腫的形成，其具體作用機(jī)制還有有待進(jìn)一步研究。

5 總結(jié)與展望

結(jié)核病是一種慢性消耗性疾病，是一種特殊的炎癥，目前治療結(jié)核病的宿主導(dǎo)向療法旨在達(dá)到最大限度殺死細(xì)菌的同時(shí)，盡可能減少炎癥所致組織損傷［51］。MTB感染宿主后，生成大量泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞不僅為結(jié)核菌提供營(yíng)養(yǎng)和能量，還能助其抵御外界不良環(huán)境，保證結(jié)核菌在肉芽腫內(nèi)的潛伏和持久性。因此，可通過(guò)抑制泡沫細(xì)胞的生成抑制MTB生長(zhǎng)。實(shí)際上，在結(jié)核病治療最新進(jìn)展中，已有研究表明，他汀類藥物（降脂類藥物，可減少分枝桿菌形成的脂滴）與標(biāo)準(zhǔn)方案聯(lián)用能加快小鼠肺部細(xì)菌的清除速度［52］。肉芽腫能保護(hù)機(jī)體，控制MTB感染，限制細(xì)菌在體內(nèi)播散。面對(duì)環(huán)境變化時(shí)，肉芽腫中心壞死液化，細(xì)菌再活化并傳播。那么是否可以通過(guò)對(duì)肉芽腫進(jìn)展的把握來(lái)控制結(jié)核病情的進(jìn)展，并進(jìn)行診斷治療？通過(guò)調(diào)控CH25H∕25HC介導(dǎo)泡沫細(xì)胞參與肉芽腫的形成，將有助于為研究結(jié)核病發(fā)病機(jī)制提供新線索，發(fā)展迫切需要的新的抗結(jié)核感染的治療方法，以及提供新的有效的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。然而，25HC參與結(jié)核性肉芽腫形成的機(jī)制仍需深入研究。