內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸與抗病毒免疫應(yīng)答①

沈娛汀 李 娟 宋 云 方 亮 陳麗華（空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，西安710032）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞質(zhì)中一個與細胞基質(zhì)相隔離，但彼此相通的囊腔和細管系統(tǒng)。早在1945年，PORTER等用電鏡觀察小鼠成纖維細胞時發(fā)現(xiàn)了細胞中的分支相互連通的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，稱之為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。根據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上是否附著核糖體，可將其分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上附著有大量核糖體，為蛋白質(zhì)和多肽鏈的加工合成提供場所；而滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上無核糖體附著，無法合成蛋白質(zhì)，但與糖類、脂質(zhì)的合成作用有關(guān)，并參與脂質(zhì)的運輸［1］。線粒體是真核細胞有氧呼吸的主要場所，參與能量轉(zhuǎn)化、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化等反應(yīng)。同時，線粒體可以儲存由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運過來的Ca2+，從而控制細胞中的鈣穩(wěn)態(tài)。透過電子顯微鏡觀察到，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的距離十分微小，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體外膜之間的距離為10 nm，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體外膜之間的距離為25 nm［2］。人們將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的結(jié)構(gòu)域稱之為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸，其在調(diào)節(jié)細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)、磷脂合成、細胞凋亡、線粒體動力學(xué)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等方面均發(fā)揮著重要的作用［3-4］。除此之外，越來越多的蛋白質(zhì)被證明參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸，提示敲除或誘導(dǎo)這些蛋白的表達可能會影響細胞的一系列生物學(xué)功能［5］。本文將對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸方式以及此結(jié)構(gòu)調(diào)控抗病毒反應(yīng)的相關(guān)性研究進行綜述，以期為抗病毒治療提供新的靶點與方向。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸是線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜之間相互接近并且相互作用的結(jié)構(gòu)域，在多種生理過程中發(fā)揮著重要作用。目前，人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間并不是直接相互接觸的，而是需要通過許多蛋白或蛋白質(zhì)之間的相互作用來實現(xiàn)，包括：線粒體融合蛋白2（mitofusin2，Mfn2）、三磷酸肌醇受體（inositol triphosphate receptors，IP3R）與電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channels，VDAC）之間相互作用、囊泡相關(guān)膜蛋白相關(guān)蛋白B（vesicle-associated membrane protein-associated protein B，VAPB）與蛋白酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51（protein tyrosine phosphatase interacting protein-51，PTPIP51）相互接觸以及B細胞受體相關(guān)蛋白31（B-cell receptor-associated protein 31，Bap31）與線粒體裂變蛋白1（Fission 1 homologue，F(xiàn)is）之間的相互作用等。

1.1 Mfn2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸中的作用 在哺乳動物細胞中，Mfn2存在于線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面。通過共聚焦顯微鏡，研究者觀察到Mfn2水平降低時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的距離相應(yīng)增加［6］。但FILADI等［7］通過透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，在Mfn2-∕-小鼠的胚胎成纖維細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸的數(shù)目多于野生型（wide type，WT）小鼠，當(dāng)敲除WT小鼠的Mfn2后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸數(shù)目增加，同時Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體的轉(zhuǎn)運增強［8］。作者認為，造成這兩種相反結(jié)果的原因可能是透射電子顯微鏡評估的是細胞器之間接觸的數(shù)量和大小，而熒光顯微鏡通常測量的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的重疊面積或體積。當(dāng)Mfn2敲除后，線粒體腫脹碎裂，形態(tài)發(fā)生明顯改變，并且所占細胞面積減少，因此通過熒光顯微鏡容易觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體接觸水平降低。事實上，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體的接觸數(shù)量不但沒有減少，反而呈增高趨勢。

1.2 IP3R-VDAC與Ca2+轉(zhuǎn)運IP3R是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三磷酸肌醇依賴性鈣通道，當(dāng)細胞外可溶性激動劑與G偶聯(lián)蛋白受體結(jié)合時，磷脂酶Cβ（phospholipase Cβ，PLC）被激活，由磷脂酰肌醇4，5二磷酸（phosphatidylinositol 4，5 bisphosphate，PIP2）水解產(chǎn)生肌醇-1，4，5-三磷酸（inositol-1，4，5-trisphosphate，IP3）［5］。IP3與其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的受體結(jié)合并誘導(dǎo)其開放，從而介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放［9］。VDAC是一個廣泛存在于線粒體外膜的分子，高等多細胞生物和哺乳動物具有三種不同類型的VDAC（VDAC1、VDAC2、VDAC3），其中VDAC1最具有代表性。研究表明，IP3R與VDAC并非直接接觸，而是需要通過位于線粒體基質(zhì)中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75（Glucose regulated protein 75，Grp75）連接促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體相互作用［10］。

細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中Ca2+濃度分別約為100 nmol∕L、1 000 μmol∕L和1 000 nmol∕L，線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運蛋白（mitochondrial calcium uniporter，MCU）是一種位于線粒體內(nèi)膜上的高選擇性離子通道，介導(dǎo)Ca2+通過MCU穿過線粒體內(nèi)膜進入線粒體。因此，IP3R-Grp75-VDAC-MCU鈣調(diào)節(jié)軸在維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［10］。

最近，BARTOK等［11］研究發(fā)現(xiàn)IP3R1大部分粘附在細胞表面，而IP3R2和IP3R3在細胞中的分布更加均勻，不同亞型的IP3R對于Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的轉(zhuǎn)運速率不同（IP3R2＞IP3R3＞IP3R1）。同時，IP3R2與IP3R3在細胞中的主要作用是促進Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的快速轉(zhuǎn)運，IP3R1的主要作用是維持Ca2+在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的轉(zhuǎn)運。然而值得注意的是，無論是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間形成緊密相互作用方面，還是在調(diào)節(jié)細胞器的亞細胞分布方面，IP3R的作用均不依賴于Ca2+的轉(zhuǎn)運。

1.3 VAPB-PTPIP51調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白VAPB與線粒體蛋白PTPIP51的接觸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的相互作用中同樣發(fā)揮重要作用。通過透射電子顯微鏡觀察到，過表達的VAPB或PTPIP51可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體接觸更加緊密；而當(dāng)用siRNA敲除VAPB或PTPIP51時，接觸變得更 加 松弛，并促進自噬體的形成［12］。同時，人工連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體降低了自噬體水平，說明VAPB-PTPIP51對自噬體形成的調(diào)節(jié)是通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸來完成的［13］。

VAPB-PTPIP51間相互作用還可以調(diào)節(jié)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體的釋放［14］；過表達或siRNA敲除VAPB和PTPIP51影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸導(dǎo)致IP3R與VDAC之間的相互作用發(fā)生改變，進而影響IP3R依賴的線粒體對Ca2+的吸收。有趣的是，這些變化并不涉及IP3R、VDAC以及MCU表達水平的改變。同時，當(dāng)阻斷IP3R介導(dǎo)的Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體轉(zhuǎn)運時，VAPB-PTPIP51過表達對自噬體形成的抑制作用被完全消除［13］。

PTPIP51除了能與VAPB相互作用以外，GALM-ES等［15］通過免疫共沉淀實驗證明，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，氧化固醇結(jié)合蛋白家族（oxysterol-binding protein（OSBP）-related proteins，ORPs）ORP5∕8通 過 其ORD結(jié)構(gòu)域中的磷脂轉(zhuǎn)移同樣可以與PTPIP51結(jié)合，在維持線粒體形態(tài)與呼吸方面發(fā)揮重要作用，但其具體機制還不清楚。

1.4 Bap31-Fis與細胞凋亡 凋亡誘導(dǎo)因子刺激時，多功能分選蛋白2（multifunctional sorting protein 2，PACS-2）與去磷酸化的BH3結(jié)構(gòu)域凋亡蛋白（BH3 interacting death agonist，Bid）結(jié)合，并將其運輸至線粒體中。Bid蛋白最終被切割成為截短型Bid片段（truncated Bid，tBid），從而導(dǎo)致細胞色素C的釋放，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，caspase-3）的激活和細胞凋亡［16］。但如何將凋亡信號逆向從線粒體傳入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，作者并未在文中闡明。IWASAWA等［17］在用Fis轉(zhuǎn)染HeLa細胞以及在用siRNA敲除廣泛表達于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Bap31時發(fā)現(xiàn)，Bap31中的死亡效應(yīng)域的變異為procaspase-8的活化提供平臺。Fis與Bap31相互作用，通過procaspase-8促進其分裂為促凋亡的P20Bap31，從而將凋亡信號從線粒體傳遞至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

1.5 其他蛋白對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸的影響 隨著對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸的深入研究，越來越多的蛋白或蛋白之間的相互作用被證明參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸，進而調(diào)控機體的代謝等生理反應(yīng)。如：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸位點上的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白2（mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）以及糖 原 合 酶 激 酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）的亞細胞分布促進己糖激酶I（hexokinase I，HK-I）向VDAC的募集，進而支持記憶CD8+T細胞快速獲得發(fā)揮其效應(yīng)功能所需的代謝能量［18］；FUN14相 關(guān) 蛋 白1（FUN14 domain containing 1，F(xiàn)undc1）定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸部位，與IP3R2結(jié)合介導(dǎo)IP3Rs依賴的Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體或肌漿的釋放。Fundc1缺陷細胞內(nèi)Ca2+水平降低抑制Fis表達，進而破壞線粒體分裂，導(dǎo)致線粒體功能障礙［19-20］；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白Sigma-1同樣定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸部位，與另一內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白Bip結(jié)合。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔Ca2+濃度降低導(dǎo)致IP3Rs開放后，Sigma-1和Bip解離并與IP3R3結(jié)合，從而減少Ca2+轉(zhuǎn)移并防止蛋白酶體降解［9］。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸與抗病毒免疫應(yīng)答

病毒是由核酸和蛋白質(zhì)外殼構(gòu)成的介于生命和非生命之間的一種物質(zhì)，需要依賴寄生于細胞中存活。病毒處于細胞外環(huán)境時，其復(fù)制并不活躍，但具有感染細胞的能力。當(dāng)病毒進入細胞后，則解體釋放核酸分子，借助細胞內(nèi)的物質(zhì)進行自我復(fù)制。同時，為了抵抗和消除病毒的感染和破壞，機體將啟動抗病毒免疫應(yīng)答。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸參與調(diào)節(jié)機體的抗病毒免疫應(yīng)答過程。

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸與抗RNA病毒免疫應(yīng)答RNA病毒是一種以核糖核酸為遺傳物質(zhì)的病毒，包括大部分植物病毒（如煙草花葉病毒）和少量動物病毒（如HIV）。與DNA病毒相比，RNA病毒更加容易致病及突變，因此種類更多，難以研制有效疫苗。固有免疫應(yīng)答是機體在發(fā)育和進化過程中形成的天然免疫防御措施，當(dāng)宿主細胞受到病毒的攻擊時，細胞內(nèi)的模式識別受體（pathogen recognition receptors，PRRs）識別病毒的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated-molecular patterns，PAMPs）從而啟動固有免疫應(yīng)答。細胞中經(jīng)典的PRRs分為Toll樣受體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體家族（NLRs）以及視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（RIG-1）樣受體（RLRs）。研究表明RLRs主要在細胞質(zhì)中與病毒RNA結(jié)合［21］，包括了RIG-1和黑色素瘤分化相關(guān)基因5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA-5）。當(dāng)RNA病毒感染時，RIG-1和MDA-5中的兩個Caspase募集結(jié)構(gòu)域（caspase recruitment domains，CARDs）與線粒體抗病毒信號蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）的CARDs結(jié)構(gòu)域相互作用，在K63多泛素鏈存在的情況下將內(nèi)源性MAVS轉(zhuǎn)化為有功能的MAVS信號復(fù)合體，MAVS復(fù)合體募集TRADD、FADD、Ripk-1、cFLIPL和Caspase-8等多種信號分子，從而激活起始κB激酶（IKK）相關(guān)的TANK結(jié)合酶1（TBK1）［21-23］。IKK激活NFκB促進促炎因子的形成，TBK1誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子3∕7（interferon regulatory factor，IRF3∕7）磷酸化進而激活Ⅰ型干擾素（interferon，IFN），兩者均可抑制病毒的復(fù)制及組裝［24］。

2.1.1 Mfn2與MAVS調(diào)節(jié)抗病毒免疫應(yīng)答MAVS定位于線粒體外膜，但也存在于過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸部位，可以協(xié)助宿主對RNA病毒感染產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答［25］。免疫共沉淀結(jié)果表明，Mfn2和MAVS的相互作用取決于MAVS在線粒體上的定位，其主要發(fā)生在Mfn2的中央疏水七肽重復(fù)序列（HR1）和MAVS的C-端區(qū)域之間［26］。過度表達 的Mfn2抑 制RIG-1、MDA-5以 及MAVS介 導(dǎo) 的IRF3和NF-κB的活化；敲除Mfn2可以增加病毒誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，從而減少病毒復(fù)制［27］。但是，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸，通過改變Mfn2的定位是否可以影響抗病毒應(yīng)答現(xiàn)在還不清楚。

2.1.2 其他蛋白與抗病毒免疫應(yīng)答 香葉酰香葉?；堑鞍踪|(zhì)翻譯后的脂質(zhì)修飾，其通過Rac1限制MAVS介導(dǎo)的天然抗病毒免疫應(yīng)答。在香葉酰香葉酰基轉(zhuǎn)移酶-I缺陷的小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸部位上的小G蛋白超家族中的Rac1直 接與MAVS結(jié)合，限 制MAVS與E3連接酶Trim31的相互作用，抑制MAVS的激活；同時Rac1與MAVS連接促進caspase-8∕cFLIPL向MAVS的轉(zhuǎn)運，從而降解泛素化的Ripk-1，終止MAVS介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答［22］。CHATEL-CHAIX等［28］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)歉餆岵《荆╠engue virus，DENV）感染時，DENV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的卷曲膜相連，可以拉長線粒體、破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸結(jié)構(gòu)域，從而促進DENV復(fù)制以及減少RIG-1依賴的干擾素對病毒的免疫應(yīng)答。

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸與抗DNA病毒免疫應(yīng)答DNA病毒是一種以脫氧核糖核酸為遺傳物質(zhì)的病毒，廣泛存在于人、脊椎動物和昆蟲體內(nèi)。DNA病毒感染細胞時，主要依賴胞質(zhì)DNA的信號傳感器環(huán)狀GMP-AMP合酶（cyclic guanosine monophosphateadenosine monophosphate（cGAMP）synthase，cGAS）誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素對雙鏈DNA及逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生應(yīng)答［29］。cGAS活性位點的重排促進cGAMP的合成，隨后與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留的接頭蛋白STING結(jié)合并伴隨有TBK1的聚集。TBK1磷酸化STING的C末端尾部（CTT）結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子IRF3的磷酸化并易位于細胞核，介導(dǎo)IFN-β的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生免疫應(yīng)答［30］。早期研究表明，STING與MAVS和RIG-1存在相互作用關(guān)系［31］，但STING-MAVS的相互接觸在抗病毒免疫應(yīng)答中的作用并未被闡明。此外，當(dāng)某些RNA病毒感染時，可以觸發(fā)mtDNA釋放到胞漿，mtDNA結(jié)合cGAS但其具體機制還不清楚［32］。

3 總結(jié)與展望

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體作為細胞中重要的細胞器參與多種代謝調(diào)節(jié)。隨著顯微技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間存在著緊密的接觸，并且這一接觸調(diào)控著細胞的多種生命活動，包括：磷脂合成、Ca2+轉(zhuǎn)運、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。越來越多的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)之間的相互作用被證明參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸的調(diào)節(jié)，應(yīng)用分子生物學(xué)手段增加或敲除這些蛋白的表達，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體之間的接觸也相應(yīng)改變。然而，多數(shù)研究僅僅停留在發(fā)現(xiàn)這些蛋白可以影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸，但其在免疫應(yīng)答中的特定作用仍有待闡明。

在抗病毒免疫應(yīng)答領(lǐng)域，有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸在抗雙鏈RNA病毒免疫應(yīng)答中作用的研究較多，而在抗DNA病毒免疫應(yīng)答方面的研究相對較少。而DNA病毒廣泛存在于人、脊椎動物、昆蟲以及多種傳代細胞系中，和人類生活密切相關(guān)。因此，研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸對病毒信號傳導(dǎo)以及病毒的復(fù)制與組裝是十分必要的，不僅為深入理解病毒感染的機制提供理論和實驗依據(jù)，也可以為臨床中抗病毒治療提供新的方向。