乳腺癌前哨淋巴結(jié)活檢光聲示蹤劑的進(jìn)展與展望

趙家賢，王春建，叢斌斌，王永勝

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東 濟(jì)南 250062；

2.山東省腫瘤防治研究院（山東省腫瘤醫(yī)院）乳腺病中心，山東 濟(jì)南 250117

乳腺癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是影響乳腺癌患者預(yù)后的重要因素。前哨淋巴結(jié)（sentinel lymph node，SLN）的狀態(tài)可反映腋窩區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。研究［1］表明，對(duì)于早期乳腺癌患者，腋窩前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)（sentinel lymph node biopsy，SLNB）已可取代腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)成為治療早期乳腺癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的首要方案，從而減輕腋窩淋巴結(jié)清掃帶來(lái)的并發(fā)癥，如上肢淋巴水腫、感覺(jué)異常及運(yùn)動(dòng)障礙等。

目前國(guó)內(nèi)及國(guó)際指南推薦藍(lán)染料聯(lián)合核素示蹤法作為SLN的定位方法［2-3］，這是當(dāng)前SLN檢出率最高的方法。然而藍(lán)染料顆粒直徑較小，不具有靶向性，易將次級(jí)淋巴結(jié)染色，存在較高的假陰性率［4］。核素存在放射性污染的問(wèn)題，其制備過(guò)程復(fù)雜且需嚴(yán)格質(zhì)控，限制了放射性核素示蹤劑在臨床中的推廣［5-6］。常用的熒光示蹤法以熒光脈管系統(tǒng)成像，熒光示蹤劑發(fā)出的熒光穿透厚度低，較難發(fā)現(xiàn)位置較深的SLN，解剖分離過(guò)程中易切斷淋巴管導(dǎo)致熒光示蹤劑泄露導(dǎo)致周?chē)M織熒光污染，難以識(shí)別并定位SLN［7-8］。

研發(fā)具有靶向性、價(jià)格低廉、易質(zhì)控和較好可視性的新型示蹤技術(shù)和示蹤劑勢(shì)在必行。光聲成像（photoacoustic imaging，PAI）是近年來(lái)新興的成像技術(shù)，本文介紹PAI成像原理，重點(diǎn)對(duì)光聲造影劑在乳腺癌SLNB中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并展望通過(guò)PAI技術(shù)將新型熒光靶向示蹤劑應(yīng)用于乳腺癌SLNB的未來(lái)前景。

1 PAI與光聲造影劑

PAI依賴(lài)于光熱轉(zhuǎn)換，生物內(nèi)源性生色基團(tuán)或外源性造影劑吸收脈沖光引起局部熱彈性膨脹，隨后向外輻射超聲波，由于不同組織成分的光吸收系數(shù)不同，超聲換能器可以檢測(cè)到不同強(qiáng)度的超聲波，分析處理后可形成生物組織光能吸收差異分布圖，即成像。PAI不僅結(jié)合了光學(xué)成像高對(duì)比度和超聲成像高穿透力的優(yōu)勢(shì)，還能通過(guò)光聲造影劑獲得組織功能及相關(guān)分子信息，有助于組織結(jié)構(gòu)形態(tài)、生理、病理學(xué)特征和代謝功能等的研究，在機(jī)器的深度學(xué)習(xí)后不斷迭代，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［9-12］。

除應(yīng)具有生物醫(yī)學(xué)制劑的低毒性、低致熱原性特性外，良好的光聲造影劑還應(yīng)具有以下特性［9-10］：高摩爾吸光系數(shù)（最大程度吸收脈沖光）、近紅外光吸收峰、高光熱轉(zhuǎn)換效率、高光穩(wěn)定性（確保光譜特征不受光線照射而改變）、低量子產(chǎn)率（激發(fā)態(tài)電子的弛豫可以發(fā)生在輻射或非輻射過(guò)程中，取決于造影劑處于激發(fā)態(tài)的時(shí)間和其電子構(gòu)型。PAI需要非輻射弛豫，所以熒光發(fā)射的量子產(chǎn)率應(yīng)盡可能低）。

PAI作為一種非侵入性分子成像技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于研究與臨床中，如腦、甲狀腺、乳腺及淋巴結(jié)成像，乳腺癌的轉(zhuǎn)移抑制及治療等［13-19］。近年來(lái)用于乳腺癌SLNB研究的PAI造影劑主要包括小分子近紅外染料、金屬或半導(dǎo)體納米材料和有機(jī)納米材料［10，25］。

2 應(yīng)用于乳腺癌SLNB的光聲造影劑

2.1 菁染料

菁染料中的吲哚菁綠［20］（indocyanine green，ICG）是常用的小分子近紅外染料，是一種獲得中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的低毒染料，在熒光染料中有較高摩爾吸光系數(shù)（2.3×105/M·cm）。在水溶液中，ICG的光吸收峰在波長(zhǎng)780 nm處，在此波長(zhǎng)可獲得在熒光染料中較低的熒光量子產(chǎn)率（0.027）。ICG能迅速與血漿蛋白結(jié)合，所以臨床上常被用作血流造影劑［27］。

近年來(lái)，ICG被提出可作為乳腺癌SLNB的示蹤劑。Papathemelis等［21］的研究和Guo等［22］的研究顯示，ICG通過(guò)熒光成像系統(tǒng)用于SLNB顯示出與核素法相同的檢出率（98%）和比藍(lán)染料法更高的檢出率（97%vs89%）。然而其不具備靶向性，同時(shí)Ahmed等［7］的研究顯示ICG發(fā)出的熒光穿透厚度約為9 mm，較難發(fā)現(xiàn)位置較深的SLN。

Song等［23］早期報(bào)道了亞甲藍(lán)作為PAI造影劑用于乳腺SLN的鑒別，他們通過(guò)在小鼠SLN上疊加雞胸組織增加成像深度，獲得了深度達(dá)30 mm的SLN圖像。此外，Kim等［24］用ICG通過(guò)同樣方法在小鼠實(shí)驗(yàn)中獲得了22 mm深度SLN的光聲圖像。Sivasubramanian等［25］聯(lián)合PAI及超聲雙模態(tài)成像系統(tǒng)對(duì)比了MB與ICG染色后的乳腺癌SLN成像，結(jié)果顯示這兩種染料均顯像良好，成像深度達(dá)1.5 cm，并實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)SLN細(xì)針穿刺。

ICG在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，SLN解剖過(guò)程中易切斷淋巴管導(dǎo)致熒光示蹤劑泄露從而導(dǎo)致周?chē)M織熒光污染，難以識(shí)別并定位SLN，同時(shí)，其熒光穿透厚度低。這些局限性限制了其在臨床推廣，近年來(lái)學(xué)者們研究通過(guò)將ICG涂層于超順磁性氧化鐵和納米碳材料、與小分子抗體耦合等方式形成新型化合物，以滿足實(shí)際應(yīng)用需求［26，31］。

2.2 貴金屬納米顆粒

由于局部表面等離子共振效應(yīng)（當(dāng)暴露于適當(dāng)波長(zhǎng)的光時(shí)，納米顆粒表面導(dǎo)電電子在陽(yáng)離子晶格的共振頻率下相互振蕩，振蕩能大部分轉(zhuǎn)換成PAI所檢測(cè)的熱能），貴金屬納米顆粒具有優(yōu)異的光吸收和特殊的光熱轉(zhuǎn)換能力，其摩爾吸光系數(shù)比小分子染料高多個(gè)數(shù)量級(jí)，是近紅外光范圍內(nèi)最高摩爾吸光系數(shù)的造影劑，具有高光聲轉(zhuǎn)化效率［12，27-28］。

金納米顆粒（Au nanoparticle，AuNP）長(zhǎng)期以來(lái)被廣泛用作PAI造影劑。AuNP可以在激光照射下實(shí)現(xiàn)高光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)［29］，具有很高的生物相容性、良好的化學(xué)惰性、優(yōu)異的理化性能和高的消光系數(shù)［30］。

AuNP的缺點(diǎn)是長(zhǎng)時(shí)間暴露于激光照射后易發(fā)生形變，影響光聲信號(hào)并導(dǎo)致成像結(jié)果隨時(shí)間延長(zhǎng)而不一致。Luke等［31］研究將二氧化硅涂層于AuNP上形成Si-AuNP，二氧化硅涂層提供了一個(gè)保護(hù)殼，保護(hù)Si-AuNP免受激光誘導(dǎo)的光熱降解，使其可在持續(xù)的PAI過(guò)程中保持顆粒的熱力學(xué)穩(wěn)定性。他們以小鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌為模型，通過(guò)PAI在波長(zhǎng)1 064 nm處定位Si-AuNP，以獲取PA圖像。Dumani等［32］使用PAI聯(lián)合超聲系統(tǒng)，結(jié)合聚乙二醇-殼聚糖涂層金納米粒子（GCAuNP）作為成像造影劑來(lái)檢測(cè)SLN轉(zhuǎn)移，組織學(xué)分析證實(shí)，GC-AuNP標(biāo)記的免疫細(xì)胞的分布因轉(zhuǎn)移細(xì)胞的存在而改變，成功地區(qū)分出了轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)和非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。預(yù)計(jì)該方法可以幫助檢測(cè)SLN微轉(zhuǎn)移，從而指導(dǎo)SLNB。

在合成過(guò)程中，AuNP存在潛在細(xì)胞毒性，體積較大時(shí)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取后不能完全從體內(nèi)清除，其短期和長(zhǎng)期安全性尚需前瞻性研究驗(yàn)證。此外，AuNP價(jià)格較其他光聲造影劑貴，臨床應(yīng)用受到限制。

2.3 碳納米材料

碳納米材料由于合成和官能化的靈活性在PAI中應(yīng)用廣泛，其摩爾吸光系數(shù)高于小分子近紅外染料，其中廣泛用于PAI的是碳納米懸浮液（carbon nanoparticle suspensions，CNS）。作為PAI造影劑，碳納米材料的吸收光譜相對(duì)較寬，在400～1 100 nm的光譜上具有強(qiáng)而寬的吸光度（包括紫外光、可見(jiàn)光、近紅外光和微波），在吸收光譜內(nèi)無(wú)明顯的吸收峰［27，36］。

CNS以其黑染的特性被應(yīng)用于SLNB，其直徑為150 nm，可通過(guò)淋巴管（100～500 nm）而不會(huì)進(jìn)入毛細(xì)血管（20～50 nm）。CNS具有淋巴系統(tǒng)趨向性，注射后迅速進(jìn)入淋巴管，聚集在淋巴結(jié)，使淋巴結(jié)染成黑色，從而達(dá)到檢測(cè)SLN的作用。Zhang等［33］研究發(fā)現(xiàn)，以CNS為示蹤劑行SLNB，SLN的檢測(cè)率為99.1%（329/332）。Yang等［34］研究發(fā)現(xiàn)，以CNS為示蹤劑行SLNB成功率為99.59%，準(zhǔn)確率為97.06%，靈敏度為93.22%。此外，在4例患者中發(fā)現(xiàn)假陰性，假陰性率為6.78%。

單獨(dú)通過(guò)CNS的黑染進(jìn)行SLNB具有一定的局限性，黑染較淺的SLN可視性較差，此外其對(duì)于淋巴管的染色較差，實(shí)際操作時(shí)易遺漏SLN。De La Zerda等［35］將ICG染料涂層于單壁碳納米管（single-walled carbon nanotube，SWCNT）表面使PA信號(hào)增強(qiáng)，同時(shí)使其具有特定的吸收光譜，合成物SWCNT-ICG在780 nm時(shí)的光學(xué)吸光度比普通SWCNT高出20倍，并與其他分子基團(tuán)結(jié)合也能維持高光聲對(duì)比。Liu等［36］以CNS為示蹤劑應(yīng)用PAI聯(lián)合超聲的方法對(duì)SD大鼠SLN行細(xì)針穿刺，結(jié)果顯示，該方法能夠敏感地識(shí)別SLN，并可提供高對(duì)比度的圖像引導(dǎo)。

通過(guò)ICG的涂層后，以CNS的黑染特性聯(lián)合PAI及超聲方法，其或可成為新型熒光靶向示蹤方法，但仍需進(jìn)一步前瞻性研究驗(yàn)證。

3 小分子近紅外染料與利妥昔單抗聯(lián)合

抗體染料偶聯(lián)物最近被用于乳腺癌的高度特異性分子PAI［37］。利妥昔單抗（rituximab，Rit）是一種針對(duì)淋巴結(jié)中B淋巴細(xì)胞膜上CD20分子的特異性人源化單克隆抗體，用于治療CD20+的淋巴瘤及免疫相關(guān)疾病，能夠與淋巴結(jié)內(nèi)B淋巴細(xì)胞膜上的CD20分子特異性結(jié)合，并且結(jié)合后不易解離，另外其具備有與其他小分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，能夠與小分子物質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。

吳爽等［38］將ICG與Rit進(jìn)行偶聯(lián)，形成一種新型的熒光靶向示蹤劑ICG-Rit，其可與SLN特異性結(jié)合，通過(guò)熒光成像儀標(biāo)記的發(fā)光淋巴管及淋巴結(jié)即為SLN，結(jié)果顯示，ICG-Rit顯像淋巴結(jié)的準(zhǔn)確率為97.0%（97/100），靈敏度為96.2%（25/26），特異度為100.0%（26/26），假陰性率為3.8%（1/26），陰性預(yù)測(cè)值為98.6%（71/72），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%（25/25）。熒光法對(duì)比聯(lián)合法的一致性評(píng)價(jià)，Kappa值為0.973（P＜0.001），表明有極好的一致性。在臨床應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，該示蹤劑仍存在SLN發(fā)射熒光難以穿透較深腋窩組織的缺陷。

叢斌斌等［39］研究將利妥昔單抗與菁基染料CY754耦合，形成一種較ICG-Rit穿透力更強(qiáng)的示蹤劑CY754-Rit，并將其探測(cè)SLN的結(jié)果與ICGRit示蹤結(jié)果進(jìn)行比較，同時(shí)進(jìn)行CY754-Rit毒性研究，結(jié)果顯示，CY754-Rit 所激發(fā)出熒光穿透薄層脂肪組織的最大厚度為22 mm，ICG-Rit樣品的發(fā)射熒光穿透薄層脂肪組織的最大厚度為10 mm，同時(shí)該研究顯示，CY754-Rit對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠來(lái)說(shuō)是無(wú)急性毒性、無(wú)肝腎毒性且代謝后無(wú)臟器殘留的化合物。

有研究［8，39］顯示，將菁基染料CY754與Rit耦合的新型示蹤劑為無(wú)菌、無(wú)致熱原的溶液且局部注射不會(huì)產(chǎn)生危害；Rit與ICG質(zhì)量比例為4∶1、6∶1偶聯(lián)形成的新型示蹤劑，SLN顯像效果最佳。田崇麟等［40］研究顯示，ICG-Rit的最佳注射劑量為0.12 μg，達(dá)最佳顯像時(shí)間約為34 min，該示蹤劑能清晰定位SLN且6 h內(nèi)無(wú)次級(jí)淋巴結(jié)顯像，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

4 展望

以往菁基染料以其熒光特性對(duì)SLN的顯像仍具有局限性，通過(guò)PAI技術(shù)或可提高乳腺癌SLN的檢測(cè)率。ICG和CY754具有較高的摩爾吸光系數(shù)、近紅外光吸收峰、較高光熱轉(zhuǎn)換效率。同時(shí)，其價(jià)格較低廉、易質(zhì)控、具有較好的可視性。ICG及CY754與利妥昔單抗偶聯(lián)后，其光穩(wěn)定性提高，同時(shí)可以與淋巴結(jié)特異性結(jié)合，一定劑量下靶向引流至SLN，利用PAI技術(shù)提高成像深度，可避免熒光成像儀無(wú)法全景觀察腋窩淋巴結(jié)引流狀況的問(wèn)題。菁基染料與利妥昔單抗偶聯(lián)形成的新型熒光靶向示蹤劑制備工藝簡(jiǎn)單且無(wú)放射性危害，為無(wú)菌、無(wú)致熱原、無(wú)急性毒性的示蹤劑，能夠用于SLN顯像。預(yù)計(jì)該新型熒光靶向示蹤劑將兼具光聲造影劑和抗體型靶向示蹤劑的優(yōu)點(diǎn)，避免了傳統(tǒng)示蹤劑的缺點(diǎn)。通過(guò)PAI技術(shù)可成為乳腺癌SLNB的理想示蹤方法，具有良好的臨床應(yīng)用前景。