膝骨關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

楊 威郭斯印易志勇黃旭東韓清民?張榮華

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院,廣州 510405; 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,廣州 510405;3.暨南大學(xué),廣州 510632)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種快速增長的致殘性疾病,估計(jì)全球已有2.5 億人受累,使醫(yī)療負(fù)擔(dān)持續(xù)劇增,最常累及膝關(guān)節(jié)(knee osteoarthritis,KOA),其高發(fā)病率與老齡化、肥胖和關(guān)節(jié)慢性損傷相互作用有關(guān),KOA 是一種全關(guān)節(jié)慢性炎性進(jìn)展性疾病,涉及到關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、半月板、滑膜和周圍肌肉功能與結(jié)構(gòu)的改變[1-3],按病因分為原發(fā)性(primary knee osteoarthritis, PKOA)和繼發(fā)性[4],繼發(fā)性KOA 包括創(chuàng)傷后(post-traumatic knee osteoarthritis, PTKOA)、廢用性和繼發(fā)于其他系統(tǒng)性疾病的KOA,由于具體病機(jī)不明,尚無有效的干預(yù)手段[3]。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是人們深入認(rèn)識(shí)KOA發(fā)病機(jī)制和探索有效治療手段的重要途徑[5-6]。

KOA 屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇,中醫(yī)認(rèn)為其病因病機(jī)為“本痿標(biāo)痹、本虛標(biāo)實(shí)”。肝腎虧虛,筋骨失養(yǎng)為本痿;邪氣痹阻,經(jīng)絡(luò)不暢為標(biāo)痹[7]。大致可分為氣滯血瘀證、寒濕痹阻證和肝腎虧虛證,據(jù)此遣方用藥以減輕KOA 患者疼痛、改善關(guān)節(jié)功能和調(diào)節(jié)整體生理功能進(jìn)而提高生活質(zhì)量,為進(jìn)一步探究其內(nèi)在機(jī)理,將動(dòng)物作為人類受難的替代者,分別模擬血瘀、寒濕和腎虛證型KOA 患者,結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)及筆者KOA 動(dòng)物造模經(jīng)驗(yàn),可將其分為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理學(xué)造模和中醫(yī)證型造模兩大類,以最常用的家兔和大鼠[8]為例,分析常用造模方式的內(nèi)在機(jī)制及優(yōu)缺點(diǎn)以供參考。

1 KOA 的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理學(xué)造模

經(jīng)典的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理學(xué)造模分為自發(fā)造模和人工誘發(fā),后者分為侵入性和非侵入性造模,侵入性包括關(guān)節(jié)腔注射、關(guān)節(jié)內(nèi)外手術(shù),非侵入性包括關(guān)節(jié)制動(dòng)和機(jī)械創(chuàng)傷[9-10],而目前復(fù)制KOA 動(dòng)物模型最常用的造模方法為關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)、石膏繃帶制動(dòng)和關(guān)節(jié)腔藥物注射法。評價(jià)KOA 模型最經(jīng)典的指標(biāo)是關(guān)節(jié)軟骨損傷的Mankin 評分[11]和改良Mankin評分[12],后者已逐漸取代前者,而國際骨關(guān)節(jié)炎研究組織(OARSI)推薦的滑膜組織半定量評分有助于KOA 早期評價(jià)[13]。

1.1 關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)

關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)是不同程度破壞或切除前后交叉韌帶、內(nèi)外側(cè)副韌帶或半月板等穩(wěn)定關(guān)節(jié)的軟組織,使關(guān)節(jié)不同程度地失穩(wěn),改變其生物力學(xué),增加關(guān)節(jié)表面摩擦,進(jìn)而促使關(guān)節(jié)軟骨退變誘發(fā)KOA。此法模型成功率高,可重復(fù)性好,造模時(shí)間短,病程可控,但具體操作要求較高,需要嚴(yán)格無菌,術(shù)者要掌握膝部解剖并具備一定的外科操作技能,以盡可能減少手術(shù)創(chuàng)傷出血。

1.1.1 傳統(tǒng)Hulth 法及Hulth 改良法

改良的Hulth 法即切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)半月板切除,而Hulth 法還需切除后交叉韌帶[9]。王婧等[14]在大鼠KOA 三種造模方式的比較中發(fā)現(xiàn)Hulth 模型組6 周即可造模成功:膝關(guān)節(jié)軟骨組織大體觀可見軟骨變薄或部分缺損、表面充血、有小裂縫,伴有骨贅形成;光鏡下可見軟骨表層較大缺損,軟骨細(xì)胞層分離,且細(xì)胞肥大呈空泡狀,潮線消失,軟骨下骨小梁斷裂,Mankin 評分高,相當(dāng)于KOA 中晚期。Hulth 法建模太快,不利于觀察不同時(shí)期KOA 滑膜、軟骨及軟骨下骨的病理表現(xiàn);而改良的Hulth 法操作簡單,創(chuàng)傷小,可動(dòng)態(tài)觀察KOA周圍組織的病理表現(xiàn),采用改良Mankin 評分判定分期。張沖等[15]采用改良Hulth+強(qiáng)迫兔奔跑法(約200 m/d),發(fā)現(xiàn)2 周軟骨改變,6 周進(jìn)入平臺(tái)期,10周可見晚期OA 表現(xiàn),13 周建立典型KOA 模型。

1.1.2 前交叉韌帶切斷術(shù)(ACLT)、半月板部分或全部切除術(shù)

ACLT(anterior cruciate liagament transection)模型是最早為大眾熟知的模型,也是KOA 研究中最常用到手術(shù)模型。錢潔等[16]認(rèn)為ACLT 建模時(shí)間較長,術(shù)后6、8 周分別為KOA 的早期和中期:關(guān)節(jié)大體可見軟骨面失去光澤,滑膜腫脹;鏡下觀顯示軟骨形態(tài)紊亂,甲苯染色變淺,軟骨細(xì)胞變性壞死增多,Mankin 評分較高,更適合用作發(fā)病機(jī)制、藥物治療方面的研究。譚啟釗等[17]對比三種OA 模型,術(shù)后8 周發(fā)現(xiàn)其膝關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨都發(fā)生明顯病理改變且各有差異,其中ACLT 組大鼠軟骨破壞較重,軟骨下骨沒有顯著改變。在體實(shí)驗(yàn),半月板切除引起內(nèi)外側(cè)關(guān)節(jié)面受力不均而導(dǎo)致KOA 樣改變,類似于人類膝內(nèi)外翻導(dǎo)致的內(nèi)外側(cè)KOA[18],部分切除的機(jī)理與全切類似。陳康等[19]認(rèn)為切斷兔的內(nèi)外側(cè)半月板和前交叉韌帶是制作KOA 模型較為理想的方法,造模2、6、10 周后,從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)表現(xiàn)和大體標(biāo)本觀察,兔右膝關(guān)節(jié)均呈典型不同時(shí)期KOA 特征。本法創(chuàng)傷相對較小,成功率高,容易控制實(shí)驗(yàn)方向,但對術(shù)者要求更高,穩(wěn)定性較差,成模時(shí)間較長。

1.2 石膏繃帶制動(dòng)

原理是增加或減少作用關(guān)節(jié)面的應(yīng)力誘導(dǎo)產(chǎn)生關(guān)節(jié)軟骨退行性改變。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一般以膝關(guān)節(jié)為觀察對象,按照作用關(guān)節(jié)是否為觀察對象可分為固定觀察關(guān)節(jié)法和固定非觀察關(guān)節(jié)法,按照制動(dòng)機(jī)制不同可分為過屈位和過伸位制動(dòng),筆者以為前者主要是限制關(guān)節(jié)伸直造成關(guān)節(jié)軟骨萎縮性變化,后者主要是限制活動(dòng),周圍組織對關(guān)節(jié)面產(chǎn)生過度壓力進(jìn)而導(dǎo)致KOA,過屈位操作簡單,成功率高,而過伸位制動(dòng)與臨床上KOA 發(fā)病機(jī)制類似,近年來應(yīng)用更為廣泛[20]。

無論是否固定在過伸、屈位或中間位,也無論是否對膝關(guān)節(jié)施加外力,固定一定時(shí)間后的膝關(guān)節(jié)軟骨都會(huì)出現(xiàn)類似臨床的退變。以新西蘭大白兔左后肢為觀察對象,田育魁等[21]或王麗娟等[22]人分別采用高分子繃帶于過屈或過伸位固定,8 或6周后成功建立KOA 模型。亦可用此法觀察過度負(fù)重的右膝與空白組關(guān)節(jié)軟骨的病理變化,但目前尚未見報(bào)道。

1.3 關(guān)節(jié)腔藥物注射法

關(guān)節(jié)腔藥物注射法是將誘導(dǎo)炎癥的復(fù)合物或生物制劑直接注射到關(guān)節(jié)腔,多用于研究藥物抑制炎癥或減輕疼痛的療效。最常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑有木瓜蛋白酶和碘乙酸(sodium monoiodoacetate, MIA),其次是尿激酶和膠原酶等。木瓜蛋白酶分解軟骨基質(zhì)中具有抗壓作用的糖蛋白,促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨降解,誘發(fā)KOA。王平樂等[23]將1.6%的木瓜蛋白酶注射到兔的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi),每只0.5 mL,每3 天一次,共兩次,2周后取材發(fā)現(xiàn)注射的膝關(guān)節(jié)軟骨退變。而目前更為常用的是MIA 注射,它能抑制三羧酸循環(huán)中的三磷酸甘油醛脫氫酶導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨降解,王寶娟等[24]發(fā)現(xiàn)7.5 mg/kg 的MIA 為建立家兔KOA 模型最小有效劑量,且成活率高。最近,劉軍等[25]分別在第1、7 天將10 ng/mL 的TNF-α 注射到大鼠關(guān)節(jié)腔,4 周后成功構(gòu)建KOA 模型。此法操作簡便、創(chuàng)傷小且成模時(shí)間短,但是藥物劑量因動(dòng)物或部位而異,首次注藥后關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重阻礙后期注藥,往往需要使用其他化學(xué)催化劑[10],反復(fù)注射易出現(xiàn)硬結(jié)、潰爛,所形成的模型與人類KOA 有所差異。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理學(xué)造模方法繁多,且不斷創(chuàng)新,無法一一列舉,每一種具體造模方式都有其獨(dú)特的優(yōu)缺點(diǎn),需要根據(jù)其特有的致病機(jī)制、病理變化特點(diǎn)及自身需求選擇合適的方法模擬所需KOA 模型。

2 KOA 的中醫(yī)證型造模

古今醫(yī)家對KOA 病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)可大致概括為正虛、邪實(shí)和虛實(shí)夾雜三大證。為模擬臨床KOA證型,目前中醫(yī)證型造模也以腎陽虛、血瘀和寒濕證為主,與前文論及的KOA 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理學(xué)造模相結(jié)合形成病證結(jié)合的復(fù)合模型。目前中醫(yī)證型的評價(jià)是以《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》中臨床表現(xiàn)與證型的對應(yīng)為主。

2.1 腎陽虛證KOA 模型

腎陽虛證KOA 模型是腎陽虛證+KOA 病證結(jié)合的模型,腎陽虛證模型是研究最早的中醫(yī)證候動(dòng)物模型[26],按機(jī)理大致可分為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理學(xué)造模和中醫(yī)病因?qū)W造模,且以前者多見。根據(jù)《辨證論治實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》對腎陽虛證候評分,結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論進(jìn)行證候評價(jià)[27],典型表現(xiàn)為精神萎靡、發(fā)抖畏寒喜暖、卷縮弓背、大便稀溏和抓取無抵抗等。

2.1.1 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理學(xué)造模

中醫(yī)腎包含現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的性腺功能,性激素水平下降可反映腎氣的衰退,并且下丘腦-垂體-靶腺軸的功能紊亂是腎虛證的主要病理基礎(chǔ)[28]。研究表明cAMP、cGMP 及其比值可反映腎虛證[16],腎陽虛時(shí),cAMP 降低,cGMP 升高,cAMP/cGMP 降低,反之為腎陰虛。腎陽虛證的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理學(xué)造模可分為腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺、性腺功能抑制模型等。最早和最為常用的是糖皮質(zhì)激素法,且最為國內(nèi)外所認(rèn)可的方式是將氫化可的松注射液以10 mg/(kg·d)的劑量注射到成年大鼠腹腔持續(xù)15 d 便可成模[29]。其次最為常用的是去勢法,切除動(dòng)物雙側(cè)睪丸或卵巢,可成功模擬腎陽虛證,但也有研究認(rèn)為此法不僅創(chuàng)傷大且性腺軸的反饋途徑中斷,去勢后的動(dòng)物不能較好地模擬臨床腎陽虛患者表現(xiàn)[26]。由于激素造模嚴(yán)重影響骨骼肌力量和骨的代謝,進(jìn)而影響KOA 模型,病證結(jié)合模型中多采用去勢法。陳穎穎等[30]通過多種不同造模方法比對發(fā)現(xiàn)去除雙側(cè)睪丸聯(lián)合Hulth 法[9]更適合建立雄性SD 大鼠KOA 腎陽虛證模型;根據(jù)Hartley 豚鼠關(guān)節(jié)軟骨快速衰老的特性,筆者前期單純采用去除雙側(cè)卵巢法成功建立豚鼠絕經(jīng)后PKOA腎陽虛證模型,操作雖然簡單,但耗時(shí)太長,并且去勢后骨小梁明顯缺失,骨質(zhì)疏松特別嚴(yán)重[12]。最近,陳穎穎等[31]對雄性SD 大鼠采用Hulth 造模法+不同濃度腺嘌呤灌胃成功構(gòu)建腎陽虛型KOA 模型,并發(fā)現(xiàn)100 mg/kg 是最佳濃度。

2.1.2 中醫(yī)病因?qū)W造模

腎藏精,主骨生髓,主持人體發(fā)育和生殖,腎虛多由先天稟賦不足或后天失養(yǎng),房勞內(nèi)傷,久病耗氣,年老或受驚所致。腎陽虛證中醫(yī)病因?qū)W造?？煞譃?房勞模型、老年大鼠腎陽虛模型和“恐傷腎”模型等[32],房勞模型主要是針對單個(gè)雄鼠和多個(gè)動(dòng)情期雌鼠同籠,誘導(dǎo)雄鼠房事不節(jié);老年大鼠腎陽虛模型是根據(jù)老年大鼠自然衰老所致腎陽虛衰;“恐傷腎”模型主要是利用貓嚇鼠,使動(dòng)物精神-神經(jīng)內(nèi)分泌-效應(yīng)器之間相互關(guān)系發(fā)生紊亂影響代謝功能,出現(xiàn)腎陽虛證。然筆者尚未發(fā)現(xiàn)運(yùn)用中醫(yī)病因?qū)W方法或復(fù)合KOA 病理學(xué)造模法建立腎陽虛型KOA 復(fù)合模型的文獻(xiàn)報(bào)道。

目前,腎陽虛造模法種類繁多,病理造模方法遠(yuǎn)多于病因造模,而后者被越來越多的研究者青睞,但兩者都存在明顯不足,前者只能反映臨床腎陽虛病理的單個(gè)方面,后者病因和病證之間不存在一一對應(yīng)的關(guān)系,病證結(jié)合模型將是未來發(fā)展的方向[33]。

2.2 血瘀證KOA 模型

血瘀證的臨床表現(xiàn)為舌質(zhì)青紫、瘀斑等,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是舌質(zhì)瘀紫,尾色瘀青,血流緩慢、血黏度增高等,常用的造模方法是腎上腺皮質(zhì)激素注射法[34],具體是氫化可的松10 mg/(kg·d)肌肉注射,13 次用藥后腎上腺素0.36 mg/kg 皮下注射一次。2013 年,劉振峰等[35]用此法+經(jīng)典Hulth 造模法成功建立了動(dòng)物體征和血液流變學(xué)均符合血瘀證的大鼠KOA 模型;盡管臨床上血瘀證常見,且常以活血法治之,但此后未見單純血瘀證KOA 動(dòng)物模型報(bào)道,多是復(fù)合證 KOA 模型。劉愛峰等[10]及 Liu等[32]用關(guān)節(jié)內(nèi)注射木瓜蛋白酶0.05 mL(1.6U)/關(guān)節(jié)劑量,并將雄性Wistar 大鼠膝關(guān)節(jié)在50℃環(huán)境下作用2 h,觀察局部淤血腫脹、疼痛和活動(dòng)受限程度及軟骨病理變化,得到腎虛血瘀型KOA 模型,此法亦屬病理學(xué)造模范疇,簡便易行,周期短,可重復(fù)性高,且成功解決了傳統(tǒng)木瓜蛋白酶因首次注射后關(guān)節(jié)腫脹而致后續(xù)注射受阻的難題。截止目前,筆者尚未發(fā)現(xiàn)血瘀證病因?qū)W造模及客觀評價(jià)指標(biāo)的文獻(xiàn)報(bào)道。

2.3 寒濕證KOA 模型

《內(nèi)經(jīng)·痹論篇》曰:“風(fēng)寒濕三氣雜至,合而為痹也?！憋L(fēng)寒濕邪是重要的病因。2016 年,李艷彥及其團(tuán)隊(duì)等[36]采用石膏伸直位固定法+冰水站立復(fù)制寒濕證KOA 模型,通過將大鼠放入(6±0.5)℃的水中6 h,而后予以雙下肢石膏固定18 h,如此反復(fù)6周后行關(guān)節(jié)病理學(xué)檢查低倍鏡下可見軟骨表面不平,滑膜層增多、增粗,較多血管翳形成,高倍鏡下發(fā)現(xiàn)大量軟骨細(xì)胞破壞,排列紊亂,較多炎性細(xì)胞及壞死組織分布。隨后,趙樂等[37]對其改進(jìn),通過交替將大鼠雙下肢伸直位石膏固定和自然站立于(6±2)℃冰水中各6 h,持續(xù)6 周,發(fā)現(xiàn)模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原及TGF-β 表達(dá)明顯下降,iNOS(一氧化氮合成酶)表達(dá)明顯升高。2020 年,孫力威等[38]采用石膏固定+低溫環(huán)境刺激(4℃氣溫箱8 h)+冰水站立成功建立雌性SD 大鼠腎陽虛寒濕證KOA 模型,用高劑量黃芪桂枝五物湯灌胃后腎陽虛表現(xiàn)消失,趾溫也正常,關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)表現(xiàn)及血清炎性指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn),以此反證腎陽虛寒濕證KOA復(fù)合模型成功。此法為中醫(yī)病因?qū)W造模,即采用致病因素干預(yù),但其作用時(shí)間、評判標(biāo)準(zhǔn)或病理學(xué)造模未見報(bào)道。

3 總結(jié)與展望

據(jù)中醫(yī)史料記載,與KOA 相似癥狀的病名有骨痹、痛痹、寒痹和鶴膝風(fēng)等。KOA 中醫(yī)病因病機(jī)是腎陽虛、寒濕和淤血,基本證型是腎陽虛、氣滯血瘀證和寒濕阻滯證,分別對應(yīng)腎陽虛、血瘀證和寒濕證KOA 動(dòng)物模型。祖國醫(yī)學(xué)從整體辨證論治的角度出發(fā),治療KOA 有獨(dú)特的優(yōu)勢,而有關(guān)KOA 的中醫(yī)證候動(dòng)物模型研究及相關(guān)文獻(xiàn)資料缺乏或零散,尤其缺少病因?qū)W模型研究,由于單一病證病因較多,且同一病因可誘發(fā)不同證型,加之臨床上患者病證的復(fù)雜性、動(dòng)態(tài)性及伴隨疾病的相互影響,嚴(yán)重限制了中醫(yī)藥對KOA 的深入研究。普遍認(rèn)為KOA 證型是多種病因相互作用的結(jié)果,進(jìn)而出現(xiàn)多種證型兼夾或轉(zhuǎn)變,因此實(shí)際造模時(shí)可以將多種基本模型按需求和內(nèi)在規(guī)律組合建立符合中醫(yī)臨床的復(fù)合證候模型,但干預(yù)因素過多,實(shí)際操作困難,模型穩(wěn)定性和可靠性不高,另外,動(dòng)物的食水、墊料、光照及周圍環(huán)境等飼養(yǎng)條件也極為重要。

KOA 病因病機(jī)不明,單純用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)或祖國醫(yī)學(xué)都不能有效地解除患者病痛,而兩者結(jié)合療效顯著,為探究其內(nèi)在機(jī)理,由此過渡到基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn),將西方先進(jìn)的KOA 造模理念結(jié)合中醫(yī)證候模型建立病證結(jié)合動(dòng)物模型[39]將是人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)KOA 病因病機(jī)以及藥物防治的主流方向。當(dāng)前KOA 病證結(jié)合模型主要以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理病因造模為主,缺乏體現(xiàn)中醫(yī)證候的病因或誘因,在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)建?；A(chǔ)上施加中醫(yī)病因可能有助于解決,另外科學(xué)地評價(jià)病證結(jié)合模型很難,為推動(dòng)KOA 模型更好地服務(wù)于科研,武晏屹等[40]以KOA 中、西醫(yī)最新臨床診療規(guī)范為依據(jù),創(chuàng)造性地提出了動(dòng)物模型與中、西醫(yī)的臨床吻合度,也更有利于病證結(jié)合模型的發(fā)展;宋亞剛等[39]提出“證候”評價(jià)指標(biāo)+“病”評價(jià)指標(biāo)綜合評估,具體需要與獸醫(yī)合作采集動(dòng)物的“四診信息”,結(jié)合基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)等信息,宏觀微觀相結(jié)合共同評價(jià),必要時(shí)運(yùn)用經(jīng)典方劑佐證,這將是病證結(jié)合模型的發(fā)展方向。