癲癇動物模型的研究進展

董博思邱湘苗賴婉琳李宛凌彭安嬌陳 蕾

(四川大學華西醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,成都 610041)

癲癇是一種常見的由多種病因所致的發(fā)作性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,為了了解其復雜的生理病理機制,探究相關遺傳因素及開發(fā)抗癲癇藥物(antiepileptic drugs, AEDs),人們建立了癲癇動物模型。最初的模型是Jackson 等人于1869 年在狗身上建立的[1],在此基礎上各種理化因素誘導的動物模型根據(jù)不同的研究目的被建立。本文將目前已有的癲癇動物模型的誘發(fā)方式、優(yōu)缺點、主要應用、改良方式等做一總結(jié)。

1 常見癲癇模型的行為學特征及優(yōu)缺點

常用癲癇建模方法及應用見表1。

1.1 化學藥物

常用的化學點燃方式可通過直接在動物腦內(nèi)注射低劑量的興奮劑,或通過反復系統(tǒng)應用閾下濃度的驚厥劑來誘發(fā)癲癇。由于點燃可以精確地確定癲癇發(fā)作的時間、癲癇發(fā)作的部位,故可提供癲癇傾向性、反復癲癇發(fā)作對大腦的影響、不同結(jié)構在調(diào)節(jié)癲癇持續(xù)時間和擴散中的作用、不同區(qū)域相對易感性等大量信息。當然它也有一定的缺點:局部刺激可能無法預測其他部位的后果;在正常動物中進行的癲癇可能與癲癇動物的發(fā)作結(jié)果不同,且不同品系、年齡、性別動物對這些化學致癇劑及AEDs 反應存在差異[2];點燃也是一個昂貴和耗時的過程,包括植入物丟失、損壞的風險。此外,許多化合物在全身給藥時也能產(chǎn)生急性全面性起源發(fā)作,如3-巰基丙酸、β-咔啉、美解眠等。這些模型的共同優(yōu)點是制作簡單,雖然致癇機制稍有不同,但藥物的選擇通常主要取決于研究者的熟悉程度[3]。該類模型對我們了解從刺激性癲癇到癲癇持續(xù)狀態(tài)的轉(zhuǎn)變有哪些變化,癲癇在什么時候加重并導致腦損傷,以及如何預防等問題至關重要。

1.1.1 戊四氮(pentylenetetrazol, PTZ)

化學藥品中最經(jīng)典的便是通過阻斷GABA 傳遞致癇的PTZ,可用于建立急、慢性癲癇動物模型。在嚙齒類動物中以閾值劑量注射PTZ 可導致急性肌陣攣和緊張性擴張;而以較低的閾下劑量重復給藥可引起點燃現(xiàn)象,其最初的非驚厥劑量可降低實驗動物的死亡率,同時大多數(shù)動物都能誘發(fā)癲癇活動,如無需后續(xù)藥物干預的改良window-PTZ 點燃法[4],但少見明顯苔蘚纖維發(fā)芽及自發(fā)性癲癇發(fā)生[5]。此外,低劑量 PTZ(20 ～30 mg/kg)可引起失神發(fā)作,適合于相關AEDs 篩選[6]。

1.1.2 紅藻氨酸(kainic acid, KA)

KA 是一種從紅藻中提取的L-谷氨酸神經(jīng)毒類似物,對海馬具有特別突出的毒性作用,并呈劑量依賴性,故以中小劑量常用[7]。腦內(nèi)注射KA 可用于研究致癇灶對周圍和正常腦組織的影響,而全身注射KA 通常用來研究大腦多個區(qū)域?qū)Πd癇發(fā)生的易感性和藥物研究。在此基礎上的KA 快速點燃法可節(jié)約時間、藥品成本且具有永久性[8],KA 模型在潛伏期、行為癥狀、潛伏期持續(xù)時間以及潛伏期和慢性期的腦電圖特征等方面與人類相似[9],有助于我們更好地了解顳葉癲癇過程,開發(fā)更有效的靶向治療藥物。此外,用KA 靶向注射小鼠腹側(cè)海馬可建立一個在癲癇發(fā)作和認知表型與標準背側(cè)海馬模型相似的顳葉癲癇模型,但具有明顯的情感特征,可用于進一步研究顳葉癲癇的重要共病[10]。

1.1.3 匹羅卡品

毛果蕓香堿(匹羅卡品)誘導癲癇的能力可能取決于M1 受體的激活,并可在癲癇發(fā)作后可引起海馬谷氨酸水平升高及NMDA 受體激活,從而維持癲癇發(fā)作[11]。該模型具有反復自發(fā)性發(fā)作、典型海馬硬化、苔蘚纖維發(fā)芽等特點[12]。匹羅卡品模型相較于上述藥物發(fā)作更加持久,更可靠、實驗時間更短及成本最低。雖然其腦電圖特征和神經(jīng)病理學改變與KA 相似,但全身應用匹羅卡品后,可觀察到丘腦、黑質(zhì)、大腦皮質(zhì)等更廣泛的形態(tài)學病變,但須考慮到系統(tǒng)性使用KA 也可能會導致海馬外區(qū)域損傷,且顳葉癲癇患者也會有海馬外神經(jīng)元損傷的表現(xiàn)。此外,鋰-毛果蕓香堿模型不僅可減少匹羅卡品劑量,也顯示出與人類持續(xù)性癲癇非常相似的表現(xiàn),杏仁核電刺激代替鋰預處理也可得到類似效果[13]。

1.1.4 金屬

通過損傷皮層制備癲癇模型應用最為廣泛的便是植入金屬,其中最具有代表性的是涂抹鋁乳膏的動物模型。該模型發(fā)作間期和發(fā)作期腦電圖與臨床局灶性癲癇相似,偶爾會進展為繼發(fā)性全面強直陣攣性發(fā)作,且該模型對標準AEDs 的反應也與局灶性癲癇患者相同[14]。雖然植入金屬模型是慢性局灶性癲癇的良好模型,但制備難度大、成本高。另外,鐵離子導入蛛網(wǎng)膜下腔動物模型與皮層或杏仁核注射相比,雖不適合作為人類難治性癲癇的藥物及發(fā)病機制研究,但其早期誘發(fā)出癲癇強烈,成功率高(95%),且能模擬人類蛛網(wǎng)膜下腔出血所產(chǎn)生的癲癇,操作起來也相對容易[15]。

1.1.5 青霉素

低劑量青霉素誘導局灶性癲癇模型適用于研究癲癇發(fā)作活動擴散的分析[16],但青霉素模型更常用于模仿具有抗藥性的失神發(fā)作,且PTZ、光刺激和GABA 能激動劑可加劇發(fā)作。但給嚙齒動物肌注時,不會持續(xù)產(chǎn)生與貓相似的雙邊同步棘慢波發(fā)放(spike wave discharges, SWDs),相反地會產(chǎn)生多灶性尖峰。不過用青霉素預處理大鼠后,可增加其他化學藥物誘導SWDs[17],對研究與棘慢波發(fā)放相關的細胞機制與在產(chǎn)生棘慢波爆發(fā)時皮質(zhì)對皮質(zhì)下結(jié)構的作用非常有用。

1.1.6 AY-9944

AY-9944 是一種抑制7-脫氫膽固醇降解為膽固醇的化合物,是目前唯一永久性的不典型失神模型,其誘導機制尚不完全清楚,不過為膽固醇在抑制癲癇發(fā)生的作用提供思路。另外AY 結(jié)合抗有絲分裂劑(methylazoxymethanol acetate, MAM)可模擬伴有腦發(fā)育不全的難治性不典型失神發(fā)作[18]。該模型在可靠性、自發(fā)性、復發(fā)性和誘發(fā)癲癇的慢性發(fā)作方面比遺傳模型相更具優(yōu)勢,但在識別和量化實驗性失神發(fā)作所需腦電圖監(jiān)測方面要求更高。

1.1.7 γ-羥基丁酸鹽(γ-hydroxybutyrate, GHB)

GHB 模型是公認的失神發(fā)作模型,可觀察到雙側(cè)同步的與行為停止、面部肌陣攣和顫動抽搐有關的SWDs[19]。使用有生物活性的GHB 前體(GBL)可產(chǎn)生與GHB 完全相同的腦電圖和行為效應,但其效應相對更持續(xù)和迅速。

1.2 物理方法

1.2.1 電刺激

一種局灶性癲癇發(fā)作模型是通過直接電刺激皮質(zhì)產(chǎn)生的,重復電脈沖會導致腦急劇放電[20]。另一種更常用的是通過電點燃數(shù)周后,動物可表現(xiàn)出自發(fā)癲癇發(fā)作。對于電刺激參數(shù),通常認為電刺激間隔時間才是關鍵變量,在波寬1 ms, 頻率60 Hz,刺激時間為1 s 的標準條件下,間隔15 min 到7 d都能引出點燃,但間隔15 ～30 min 需要更多次刺激才能點燃[21]。在此基礎上一種快速電點燃模型可使苔蘚纖維發(fā)芽發(fā)展更快,減少動物痛苦[22]。

由于電點燃法需要先進的外科手術和腦電圖技術,6 Hz 角膜點燃法成為了一種簡單有效的替代方法。該模型在顯性表現(xiàn)和腦電圖模式上與精神運動性癲癇具有高相似性;也被認為是耐藥性癲癇潛在治療藥物的篩選工具[23]。然而,電點燃與海馬硬化癥無關,損傷與顳葉癲癇也不相似,自發(fā)癲癇相對藥物發(fā)生較少。

最大電休克(maximal electroshock, MES)是目前研究全面性發(fā)作最透徹、最適宜使用的模型。因為MES 和PTZ 制備方法簡單,且有比較高的篩選AEDs 的效率,故MES 模型和PTZ 模型通常是作為初次篩選癲癇藥物的金標準。但MES 模型對作用于離子型通道的藥物有偏向性,易導致其他AEDs(如氨基己酸、噻加賓等)被忽略[24]。

此外Hunter 等[25]人的研究顯示刺激內(nèi)丘腦可產(chǎn)生類似失神表現(xiàn)和腦電圖,但是由于需要長期置入電極需不斷刺激,且死亡率相對較高,而很少使用于制造失神模型。

1.2.2 低溫

低溫損傷模型是一種不需要將外源性藥物注入體內(nèi)也可以引起局灶性癲癇的模型。這種液氮探針可造成致癇病灶伴隨腦水腫發(fā)生,發(fā)作可持續(xù)數(shù)天,具有可重復性,死亡率較低(<5%),可發(fā)生自發(fā)性癲癇,但動物年齡、系統(tǒng)給藥對該模型驚厥閾值的影響還不清楚[17]。

1.3 遺傳模型

一些神經(jīng)元煙堿乙酰膽堿受體基因(CHRNA4,CHRNB2,CHRNA2)和KCNT1 引起常染色體顯性遺傳性夜間額葉癲癇和LGI1 與具有聽覺特征的常染色體顯性遺傳性癲癇的嚙齒類動物模型[26]使得遺傳因素在局灶性癲癇中的重要作用現(xiàn)已得到充分證實。而利用遺傳性模型來研究人類全面發(fā)作也被認為是目前最有希望的途徑之一[3],主要有光敏性狒狒Papio Papio 模型、遺傳性癲癇易感鼠聽源性模型、個體差異較大的癲癇易感沙土鼠(MG)等模型。此外,遺傳因素在失神發(fā)作的發(fā)病機制中也發(fā)揮著重要作用,但大多數(shù)品系的小鼠與在WAG/Rij大鼠身上觀察到的相反,并沒有自發(fā)的SWDs,而當觀察到SWDs 時,通常伴發(fā)其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如嗜睡小鼠(l h/l h)、Tottering 鼠、Stargazer 鼠、Ducky 鼠等[27]。研究人員還發(fā)現(xiàn)一些品系還具有其他特性,適宜用來研究癲癇與抑郁等其他疾病的關系,并有助于制定治療這些共病的新治療策略[28]。然而,自然界發(fā)現(xiàn)的癲癇動物不能確保一定是研究所篩選的基因引起的,目的性地敲除或過表達所要研究的基因、制作出特定的小鼠基因模型越來越受歡迎(見表2)。但特定的基因表達可能導致任何年齡的動物死亡,如果轉(zhuǎn)基因DNA 隨機插入基因組,在多達5%的轉(zhuǎn)基因品系中會發(fā)生中斷或干擾內(nèi)源性基因的表達,而這種插入突變產(chǎn)生的潛在表型是不可預測的,明顯干擾了研究對轉(zhuǎn)基因本身表達產(chǎn)生癲癇的解釋。

1.4 新生兒驚厥模型

新生兒驚厥動物模型有助于研究自發(fā)性發(fā)作的潛伏期和降低癲癇發(fā)作閾值,有望用于探究預防癲癇發(fā)作的方法,也適宜進行細胞培養(yǎng)用于體外研究。目前主要有缺氧缺血(hypoxia-ischemia, HI)和熱性驚厥(febrile seizures, FSs)模型成功復制了新生兒驚厥發(fā)作的一些結(jié)構異常和認知功能障礙?，F(xiàn)快速缺血缺氧模型可沒有明顯腦損傷,且各品系之間差別微小[29]。但FS 不涉及明顯的神經(jīng)元丟失[30],且動物癲癇發(fā)作是由高溫引起的,這些都與人類的疾病過程不同;而HI 模型在更年幼(P5)和成年(P60)大鼠通常不會發(fā)作[31],這其中可能涉及其他機制。

此外,上述藥物或技術可聯(lián)合使用以實現(xiàn)各種模型優(yōu)勢互補。有研究發(fā)現(xiàn)苯環(huán)定(phencyclidine,PCP)對125 mg/kg NMDA 引起癲癇表現(xiàn)沒有干擾,但可大大降低動物死亡率[32];聯(lián)合鎮(zhèn)靜劑與感覺刺激可產(chǎn)生無人工制品使用和腦損傷的模型,用于研究反射性癲癇產(chǎn)生和傳播機制,以及評價AEDs[33];還有在應用基因工程技術增加動物癲癇易感性的基礎上,用點燃等方式誘發(fā)癲癇來研究遺傳機制等。

表1 常見動物模型制備Table 1 The summary of models of seizures and epilepsy

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 基因小鼠模型Table 2 The summary of genetic models

基因Gene功能Function突變方式Mutation type表型Phenotype or syndrome in mice人類對應基因突變后表型Phenotype or syndrome in human Cacna 1a Chrna4 Chrnb2電壓依賴性鈣通道 α1 A 亞基Voltage dependent calcium channel α 1 A subunit煙堿型乙酰膽堿受體Nicotinic acetylcholine receptor煙堿型乙酰膽堿受體Nicotinic acetylcholine receptor突變Spontaneous敲入Knock in(KI)轉(zhuǎn)基因Transgene失神發(fā)作,共濟失調(diào)Absence epilepsy, ataxia尼古丁誘發(fā)癲癇的閾值降低Reduced threshold to nicotine induced seizures自發(fā)性癲癇Spontaneous seizures家族性偏癱偏頭痛;原發(fā)性全面性癲癇伴共濟失調(diào)及輕度學習困難;失神發(fā)作Familial hemiplegic migraine (FHM); Primary generalized epilepsy, ataxia, mild learning difficulties; absence epilepsy常染色體顯性夜間額葉癲癇Autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy (ADNFLE)常染色體顯性夜間額葉癲癇ADNFLE Gabrb3 γ 氨基丁酸 A 受體GABAA Gabrg2 GABA 受體 γ2 亞基GABAγ2敲除KO敲除KO肌陣攣及偶發(fā)性癲癇發(fā)作;腭裂Myoclonus and occasional epileptic seizures;cleft palate癲癇發(fā)作約4 周后死亡Epilepsy,lethality around 4 week腭裂;Angelman 綜合征、Prader-Willi 綜合征相關癲癇發(fā)作Cleft palate; Human Rearrangements of 15q11-q13 Angelman syndrome (AS) and Prader-Willi syndrome (PWS)-associated seizures全身癲癇伴熱驚厥發(fā)作Generalized epilepsy with febrile seizures plus(GEFS+)Gad2谷氨酸脫羧酶-2 Glutamate decarboxylase-2敲除KO自發(fā)性癲癇(死亡率高)Spontaneous seizures,increased mortality-Glra1 甘氨酸受體, α1 Glycine receptor, α 1 Kcna1 電壓門控K 通道Voltage gated K+ channel Kcnc2 電壓門控K 通道Voltage gated K+ channel Kcnq2 電壓門控K 通道Voltage gated K+ channel敲入KI敲除KO敲除KO有條件的顯陰性的轉(zhuǎn)基因Conditional dominant-negative Kcnq2 transgene癲癇發(fā)作約3 周死亡;驚跳病Seizures and lethality by 3 week; hyperekplexia成年后自發(fā)性癲癇Frequent spontaneous seizures through adult life自發(fā)性強直陣攣性發(fā)作Spontaneous tonicclonic convulsions自發(fā)性癲癇伴海馬形態(tài)改變Spontaneous seizures,behavioral hyperactivity and morphologic changes in the hippocampus驚跳病Hyperekplexia強直陣攣及單純部分性癲癇發(fā)作Tonic-clonic and simple partial seizures-良性家族性新生兒癲癇Benign familial neonatal convulsions (BFNC)Lgi1 Scn1a Scn1b富亮氨酸膠質(zhì)瘤失活Inactivation of leucine rich glioma電壓門控鈉通道Voltage gated Na+ channel電壓門控鈉通道Voltage gated Na+ channel敲除KO敲除KO敲除KO自發(fā)性癲癇Spontaneous seizures自發(fā)性癲癇Spontaneous seizures自發(fā)全面性癲癇Spontaneous generalized seizures伴聽覺特征的常染色體顯性遺傳癲癇Autosomal dominant epilepsy with auditory features Drave 氏綜合征;全身癲癇伴熱性驚厥DS; GEFS+全身癲癇伴熱性驚厥GEFS+

續(xù)表2

2 模擬特殊病因模型的行為學特征及優(yōu)缺點

2.1 外傷

目前創(chuàng)傷后癲癇動物模型都是模仿創(chuàng)傷后晚期癲癇發(fā)作,即初始損傷后超過一周發(fā)生癲癇,主要用于探究創(chuàng)傷后癲癇發(fā)病機制、認知缺陷與細胞死亡、治療等方面。流體沖擊損傷是創(chuàng)傷后癲癇最廣泛使用和研究最深入的模型,可模仿創(chuàng)傷性腦損傷相關的組織病理學,且在傷后1 年內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)的神經(jīng)運動和認知缺陷,但該模型缺乏對治療藥物有效性的預測;控制性皮質(zhì)撞擊可模仿急性硬膜下血腫、軸突損傷、血腦屏障功能障礙等,數(shù)周后癲癇易感性增加,表現(xiàn)為與顳葉癲癇相關的特征,但需要復雜的技術裝置;加速沖擊模型相對制造簡單且造成損傷嚴重程度易控制,但再現(xiàn)可靠率低,死亡率高,不能產(chǎn)生自發(fā)性發(fā)作[62]。

2.2 微生物感染

雖然病毒、寄生蟲等感染模型有炎癥和神經(jīng)元死亡、高興奮性和行為性癲癇的證據(jù),可用于相關腦炎治療藥物的檢測,但因模型的高死亡率和癲癇活動的變異性,不適于AEDs 的檢測。

2.3 腦腫瘤

癲癇發(fā)作頻率和發(fā)生率與腫瘤的位置、病理特征和病變進展有關,故而了解腫瘤性癲癇的病因是準確有效治療的前提。目前通常將鼠C6 膠質(zhì)瘤細胞移植到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)基因的大鼠的皮質(zhì)中進行造模,在組織學上類似于人類膠母細胞瘤的彌漫性侵襲性膠質(zhì)瘤[17]。

2.4 腦卒中

腦卒中后癇性發(fā)作模型是確定發(fā)作關鍵步驟或途徑并制定預防卒中后癇性發(fā)作干預策略的關鍵,目前尚無標準的動物模型,主要因為技術要求高、病變的大小和分布不一、死亡率高。近年來光血栓模型備受關注,其癇性發(fā)作發(fā)生在光血栓形成數(shù)周后,在海馬區(qū)可發(fā)現(xiàn)苔蘚狀纖維,死亡率相對較低[63]。

3 展望

動物模型除了應用于探究癲癇機制及AEDs外,當代社會一些環(huán)境對癲癇患者發(fā)作的影響也值得探究制作相關的癲癇動物模型來進行研究。有研究發(fā)現(xiàn)在一次嚴重的空氣污染事件中,癲癇的急救呼叫明顯增加[64];居民暴露于道路交通噪聲和空氣污染與高熱驚厥的風險增加有關[65];睡眠紊亂和低氧狀態(tài)也可以導致航空飛行中癲癇發(fā)作[66];基礎實驗也有發(fā)現(xiàn)噪聲暴露下的豚鼠神經(jīng)遞質(zhì)GABA及下丘的電生理發(fā)生改變[67],提示噪聲暴露會導致中樞聽覺相關通路的損傷;妊娠期小鼠暴露在空氣細顆粒物下不僅影響胚胎神經(jīng)發(fā)育,而且通過干擾神經(jīng)發(fā)生/膠質(zhì)形成事件、髓鞘形成和突觸發(fā)生,干擾小鼠出生后大腦的生長和成熟[68]。這些都提示一些特殊環(huán)境下的癲癇模型制備有重要的研究意義。

綜上所述,在揭示癲癇發(fā)生的基本機制、確定藥物治療特定癲癇類型和預防癲癇發(fā)展的療效等方面,這些動物模型發(fā)揮了關鍵的作用。但我們很難設計一個能概括癲癇所有特征的動物模型,而且目前的模型都不完美,故應意識到各種模型的局限性。但需要強調(diào)的是,動物模型應該是復雜系統(tǒng)的簡單表示,模擬疾病的特定方面,而決不是試圖復制具有人類疾病的所有復雜性。因此,無論何時使用動物模型,定義一個特定的問題并確保所選模型符合目的,根據(jù)目的制造和選擇模型才是至關重要的。