非人靈長類動物模型低溫治療方法及在腦卒中模型中的應用進展

何小奪吳 迪?吳隆飛陳 健丁玉川

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院中美神經科學研究所,北京 100053; 2.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經外科,北京 100053)

缺血性腦卒中是導致嚴重的功能缺失和死亡的腦血管病之一,目前臨床上被證實治療卒中有效的方法只有溶栓和取栓治療[1]。基礎研究發(fā)現,治療性低溫具有降低局部腦缺血后腦損傷以及減輕繼發(fā)性損傷的功效[2]。但是目前為止治療性低溫在缺血性腦卒中方面的保護作用尚未得到臨床證實[1]。在非人靈長類動物動物模型上開展的轉化研究將為治療性低溫的最終臨床應用提供重要的依據[3]。

非人靈長類(nonhuman primates, NHPs)應用于醫(yī)學研究已經有很長的歷史,由于其在親緣關系上與人類最接近,與人類的遺傳物質有75%～85%的同源性,在生理結構以及免疫代謝方面與人類高度相似,是醫(yī)學研究中具有極高價值的實驗動物[4]。NHPs 在腦卒中轉化研究中具有巨大的轉化研究優(yōu)勢。相比于嚙齒類動物,NHPs 的止凝血成分、腦組織解剖結構與人類相似,適合作為臨床實驗前的動物載體。

低溫治療是目前公認的、明確的神經保護作用,可減輕動物和人的各種腦損傷。低溫治療在心臟外科和神經外科手術中應用逐漸廣泛,取得良好的腦保護作用,但體溫低于28℃時,常誘發(fā)心律失常、凝血機制障礙等嚴重并發(fā)癥。近期研究發(fā)現,腦溫下降2～3℃的亞低溫對缺血性腦損傷也有保護作用,且無深低溫所致的各種并發(fā)癥,使低溫治療重新引起人們的興趣[5]。近幾年,使用亞低溫治療腦缺血、腦缺氧和腦出血患者,取得了令人囑目的研究成果。臨床證據表明,輕度至中度低溫(降低2～5℃)可安全有效地減少細胞死亡,改善腦缺血后的功能預后[6-8]。但是,在臨床轉化過程中,由于低溫誘導速度、持續(xù)時間、復溫速度等不確定性,近期低溫治療的臨床研究均得到陰性結果。鑒于非人靈長類動物在低溫轉化研究中的重要作用,我們將綜述靈長類動物模型上進行的低溫研究以及在局部腦缺血模型中的應用。

1 靈長類動物常用低溫方法

1.1 全身低溫方法

目前常用的全身低溫方法包括循環(huán)水泵低溫、制冷墊低溫、置入鈦冷卻板低溫、灌注低溫等。這幾種方法能夠控制液體溫度、灌注速度和時間,有利于對靈長類動物模型的溫度進行調控。

循環(huán)水泵低溫方法是由冷卻系統(tǒng)控制誘導的,包括一個冷卻帽、冷水毯,和一個循環(huán)水泵。初始溫度8℃～12℃。所有恒河猴的體溫由直腸溫度傳感器的反饋,有控制算法通過修改水溫進行回應。精確控制模型的目標溫度,包括輕度低溫,溫度控制在 35.0℃ ～36.5℃,中度低溫,溫度控制在<35.0℃。這是一種無創(chuàng)的、有效的和精確的方式管理體溫,研究中目標體溫維持72 h。這種低溫方法選擇幼年恒河猴作為動物模型,發(fā)現輕度低溫可以降低七氟烷麻醉造成的神經功能損傷,降低凋亡水平。這種方法簡便、易于調控,可以嚴格控制低溫目標溫度和時長[9-10]。

另一種常用的全身低溫方法為液體灌注,將體溫(直腸溫度)控制在較低水平。該方法常用于心臟手術中的體外循環(huán)過程,經股動脈灌注液體后平均需要(35±7) min 達到目標溫度(15℃)。冷卻過程中流量逐漸減少至60 mL/(kg·min)并維持[上套管為 20 mL/(kg·min),下套管為 40 mL/(kg·min)]直至松開主動脈。研究發(fā)現,低溫的保護作用與降低主動脈阻斷后脊髓下胸和腰段的脊髓血流再灌注損傷密切相關。在胸腹主動脈動脈瘤修補術中,低溫心肺轉流所產生的深度低溫可能是一種保護脊髓的有效方法,并可能降低脊髓缺血性損傷的發(fā)生率。研究者使用成年雄性狒狒,主動脈鉗夾夾閉血管,制作動脈夾夾閉脊髓缺血模型,主動脈鉗夾前冷卻至直腸溫度15℃,并在此溫度下進行體外循環(huán),直到主動脈被松開[11]。他們發(fā)現經過低溫后存活下來的動物神經系統(tǒng)損傷顯著降低,但是深度低溫也伴隨了一定的死亡概率。

1.2 局部低溫方法

冷熱墊(ChillerPad)裝置是另一種局部低溫方法,包括一個由鑄型聚氨酯制成的20×25 mm 厚的冷墊,泡沫絕緣輸入輸出油管,電腦控制的泵,熱電冷卻器。在恒河猴創(chuàng)傷性腦損傷后2.5 h,將冷卻墊放置在硬腦膜上,通過激活水泵和熱電冷卻裝置開始降溫。皮質表面迅速冷卻到15℃并保持24 h,隨后冷卻裝置再從 15℃ ～37℃復溫。復溫方式2.5℃ /h,大約復溫 10 h。Ikonomidou 等[9]選用成年恒河猴,此低溫方法可以用于外科手術開顱后、創(chuàng)傷性腦損傷后的局部低溫,該方法具有快速降溫、低溫穩(wěn)定、復溫可控等優(yōu)點,但是該方法需要局部保留硬腦膜,可能限制其應用[12]。

另一種局部低溫方法采用環(huán)形熱電設備對大腦皮層表面進行局部冷卻。將電熱芯片黏在橢圓形的空心銅散熱器的底部。通過冷鹽水(0℃～4℃,90 mL/min)灌注到散熱器中進行熱量交換,實現快速有效的降溫。用螺絲將整個冷卻裝置固定在頭骨上,儀器只接觸到大腦皮層表面,通過溫度控制系統(tǒng)準確控制降溫速度、低溫水平、持續(xù)時間和正常復溫。研究中納入5 只成年食蟹猴,將低溫組溫度分別為20℃、18℃、16℃。他們發(fā)現 20℃低溫對癲癇的控制作用最佳[13]。另一項研究中將 352mm2的鈦冷卻板埋入獼猴大腦的硬膜外表面,實現低溫誘導和維持。7 min 后大腦皮層表面腦溫降至15℃,并保持冷卻溫度30 min,通路冷卻板灌注低溫乳酸林格氏液,實現溫度控制。腦表面溫度(15±0.2)℃,液體流入溫度(12±0.4)℃。冷卻停止,停止循環(huán)冷卻劑,復溫時皮層溫度同樣在7 min 內升至35℃,復溫時間約15 min。此方法發(fā)現重度低溫(15℃)可持續(xù)抑制癲癇發(fā)作,并且在降溫和復溫過程中沒有發(fā)現明顯的運動異常[14]。

1.3 自體血低溫保護方式

自體血低溫也是一種特殊全身低溫方法,冷血灌注可迅速降低體溫,并使體溫降低到一定程度,從而產生有意義的神經保護作用。這種技術在減少手術干擾、設備簡單、對血液的需求最小等方面具有全身灌注的優(yōu)點。同時,由于其通過冷卻動物模型的自身血液,對模型目標溫度、持續(xù)時間的調控更加準確和精準。Schwartz 等[7]和 Arthur 等[15]在狒狒上證實低溫保護方式。暴露錐動脈、頸內動脈、頸外動脈、頸總動脈,通過頸部的正中切口。局部腦低溫通過一個小型熱交換器完成。從股動脈中泵出血液經過交換器泵入頸總動脈中的T 型套管,放置后即刻開始灌注,兩椎動脈、頸總動脈立即恢復在灌注,在未灌注側的頸動脈分叉處和雙側頸外動脈均通過預設的圈套結扎血管。通過一個單獨的頸內動脈為大腦提供低溫血液,并在很大程度上防止了全身的暖血對腦血管的干擾。灌注開始時的流速與動物的腦血流量相等。達到目標溫度,灌注流速就降低到維持水平。大腦溫度保持恒定持續(xù)的低溫灌注30 min。結果表明,灌注單側頸總動脈與灌注單側頸內動脈大腦冷卻速度相同、效果一致。低溫灌注7 ～8 min 后,記錄的大腦不同區(qū)域的最大溫差為2.7℃。大腦不同區(qū)域溫度相差約1℃。單一頸內動脈冷卻34 min 至大腦深部溫度7℃。Mack 等[16]導管被置入股靜脈后進入下腔靜脈。造模缺血6 h 后,冷卻到目標溫度32℃持續(xù)3 h(185.3±17.5) min。通過核心溫度反饋來控制冷卻系統(tǒng),并在整個卒中誘導、再灌注、冷卻和再升溫過程中記錄核心和大腦溫度。用加熱毯將動物加熱(1.0±0.1)℃ /h 到正常核心溫度(36.5±0.5)℃用時超過6 h。[7,15-17]

通過靈長類動物的腦低溫灌注研究發(fā)現,該方法降溫快速、穩(wěn)定,低溫的大腦可以通過以低流速持續(xù)灌注冷血來維持所需的溫度水平。體溫保持的相對較好,但全身血壓和心率等全身不良反應較為嚴重,可能顯著影響低溫保護作用。有研究發(fā)現,腦溫度維持在8℃～9℃時,出現2 只動物死亡現象[15]。如何保留低溫的保護作用,降低其不良反應值得深入研究。

1.4 血管內低溫保護方式

Wang 等[18]采用介入方法,將微導管置于大腦中動脈(middle cerebral artery, MCA),在正常恒河猴模型上評估局部低溫效果。研究者將100 mL 林格氏液(4℃)經過微導管注入大腦中動脈。經大腦中動脈局部灌注冷的林格氏液能迅速降低大腦皮層和紋狀體區(qū)的溫度,在皮層,降幅從(37.7±0.1)℃降低到(34.0±0.6)℃,在紋狀體從(37.6±0.1)℃降至(33.9±0.3)℃。局部大腦中動脈灌注乳酸林格氏液20 min 后大腦溫度降到最低的治療溫度。因此,局部血管內低溫具有降溫速度快以及血管內介入方法可以協同應用的巨大優(yōu)勢。局部低溫林格氏液灌注后直腸溫度僅從(37.5±0.2)℃降為(37.1±0.2)℃(P<0.05)。所監(jiān)測的主要生理體征指標(血壓、動脈血氧含量、呼吸頻率、心率等)均在正常范圍波動。所有模型動物均能耐受局部低溫,未出現手術并發(fā)癥導致的生命體征變化和行為學改變。以上結果顯示,血管內局部低溫對于靈長類動物模型具有安全性。

2 低溫治療方法在靈長類動物腦缺血模型中的應用

2.1 ET-1 模型制作

內皮素-1(endothelin-1, ET-1) 是一種血管收縮劑,常用來誘導嚙齒類動物和狨猴局部腦缺血[19]。近期有研究報道,采用ET-1 成功誘導恒河猴局部腦缺血[6]。ET-1 可誘導非人靈長類動物局灶性腦缺血是研究腦卒中機制及腦卒中后修復的潛在的模型。

以上研究中,通過局部開顱手術,暴露靈長類動物的大腦中動脈,局部給予ET-1 后,大腦中動脈閉塞,實現局部腦缺血。術后影像學研究顯示,注射ET-1 后7 d 出現梗死灶、腦水腫等表現,行為學評估發(fā)現,模型動物出現手部精細運動障礙等神經功能缺損癥狀。局部注射ET-1 的方法易于操作,但是每只模型動物對于ET-1 反應不完全相同,而且不能控制缺血和再通時間,出現的臨床癥狀通常較輕[20]。

目前有文獻報道給予大鼠ET-1 誘導局部腦缺血后,局部低溫可以減輕神經損傷。但是,尚無靈長類動物模型的相關報道。由于注射ET-1 需要開顱,所以首選低溫方法應該是置入鈦冷卻板低溫或冰帽低溫。優(yōu)點是可以直接針對大腦物理降溫,液體溫度、作用時間、流速都是可控的。也可以在再灌注后連接自體血低溫或血管內低溫。

2.2 動脈夾閉模型制作

研究者通常采用翼點入路法開顱,然后進行動脈夾閉造成局部腦缺血。此方法優(yōu)點是動脈夾簡便易行很容易得到,缺血和再通時間均可控。缺點是由于手術中需要開顱,導致顱內壓改變,因此出現的造模后相關并發(fā)癥,術后創(chuàng)傷感染幾率大增,影響術后行為學評估嚴重時危及實驗動物生命[7,15,21-22]。

Schwartz 等[7]和 Huang 等[23]在狒狒上進行動脈夾閉模型的制作,血管閉塞是通過在左側大腦前動脈近端至前交通動脈處,右側大腦前動脈近端、左側鎖骨內動脈閉塞處持續(xù)放置微型動脈夾來完成的。血管夾閉持續(xù)1 ～2 h,然后取出夾子以便再灌注[7,15,21,23]。

由于該模型制備過程中已經開顱,因此可以連接冷熱交換器進行局部低溫,通過熱交換等放實現局部快速降溫。同時,也可以給予該模型全身低溫方法,觀察低溫(深度、持續(xù)時間、延遲)等因素對明確血管再通情況下的神經保護作用[15]。另外,由于該方法已經開顱操作,不建議再進行血管內低溫或介入手術引導的局部低溫,降低低溫方法對于模型的影響以及重復手術對動物造成二次傷害。

2.3 血管內介入方法制備腦缺血模型

運用血管內介入的方法進行造模手術,將導管由股動脈以介入方法放入MCA 分支,阻斷血流2～3 h。栓子可以選用球囊、血栓,血栓模型梗死后使用重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)溶栓并給予自體血低溫或血管內低溫干預[8,24-26]。此方法接近臨床,基本模擬了臨床上血栓梗塞,但是缺點在于:血栓位置很難控制,梗死位置不固定,或者血栓有自溶現象[24]。

由于該方法已經采用介入方法,因此非常適合進行自體血低溫或局部微導管介導的低溫干預方法。這兩種方法均可以通過控制液體流速和流量的方法實現低溫的準確調節(jié)[15]。我們團隊近期研究顯示,通過微導管局部注射低溫鹽水,可能實現局部低溫,對恒河猴局部腦缺血模型具有明確的神經保護作用,同時并未影響動物模型的重要生理指標[8]。

3 動物倫理問題

非人靈長類動物研究應遵守“減少”、“替代”、“優(yōu)化”(Reduce,Replace,Refinement,3R)原則,動用非人靈長類動物之前應該先經過其他基礎實驗驗證,例如:細胞→嚙齒類動物→比格犬→非人靈長類動物。采用統(tǒng)計學方法,以達到盡量減少非人靈長類動物的使用,尊重動物生命、減少浪費。在手術過程及術后治療過程中選擇恰當的麻醉方式,減少動物痛苦程度。

以各種非人靈長類動物腦缺血模型為基礎。相信可以在科研與臨床之間起到良好的轉化功能。有重大的研究意義。因此可以根據不同的實驗需要運用不同的腦缺血模型模擬不同的臨床情況,建立重復性好、死亡率低、容易控制、梗死面積相對均一的模型以滿足不同的實驗目的。