lncRNA-NAS對湖羊睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌的影響及其靶基因鑒定

趙潔,史陳博,楊花,王鋒,張艷麗

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)羊業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 南京 210095)

睪丸間質(zhì)細胞(Leydig cells,LC)主要功能是分泌睪酮,睪酮的正常分泌是維持雄性動物第二特征和調(diào)控繁殖能力的重要因素[1-2]。在哺乳動物體內(nèi),睪酮合成和分泌受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控。由下丘腦合成并分泌促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH),GnRH作用于垂體組織,使其分泌促卵泡生成素(follicle stimulating hormone,FSH)和促黃體素(luteinizing hormone,LH)。LH作用于LC合成睪酮。睪酮分泌量到達所需水平能夠抑制下丘腦合成GnRH,抑制垂體合成FSH和LH,機體可通過反饋調(diào)節(jié)方式維持睪酮的正常水平[3-4]。除此之外,睪酮的分泌亦受到轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾綜合調(diào)控,但對其細胞內(nèi)機制和相關(guān)的分子機制尚未闡明。近年來,長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)備受關(guān)注,lncRNA是一種長度大于200 nt但不能編碼蛋白質(zhì)的RNA,并與DNA或蛋白質(zhì)共同發(fā)揮調(diào)控功能[5-6]。lncRNA主要分為4類:基因組lncRNA是可以在不同基因組區(qū)域進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控;內(nèi)含子lncRNA是指由基因內(nèi)含子區(qū)域進行轉(zhuǎn)錄而來;正義型lncRNA為由編碼基因的正義鏈轉(zhuǎn)錄得到;反義型lncRNA則是由基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄而來[7]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與調(diào)控家畜性腺功能、性別決定、性激素分泌、減數(shù)分裂、精子發(fā)生和胎盤形成等各個生理過程。通過對小鼠性成熟前、后睪丸進行l(wèi)ncRNA測序分析,篩選到3 025個差異lncRNA,如Sox9和C-kit等睪丸發(fā)育關(guān)鍵基因[8-9];對豬性成熟前、后睪丸進行l(wèi)ncRNA測序,篩選得到101個差異lncRNA[10]。目前,關(guān)于lncRNA在精子發(fā)生和睪丸發(fā)育中的研究在不斷豐富,然而相關(guān)lncRNA的機制研究多集中于睪丸精母細胞[2]和精原干細胞[3-4];而睪丸間質(zhì)細胞作為雄性生殖中睪酮激素的來源細胞,關(guān)于lncRNA調(diào)控睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌的研究鮮有報道。

本課題組前期篩選了湖羊睪丸性成熟前、后差異lncRNA,篩選出1 118個差異lncRNA和7 253個差異基因,差異基因主要富集于精子發(fā)生、精子活力、類固醇激素分泌[11]。因此,本研究在前期篩選的性成熟差異lncRNATCONS_01767570(命名為lncRNA-NAS)基礎(chǔ)上,以睪丸間質(zhì)細胞為對象,探究lncRNA-NAS的組織表達差異及對睪酮分泌、細胞增殖和凋亡的影響,并對lncRNA-NAS可能作用的靶基因進行進一步分析,為從lncRNA角度探究睪酮分泌的調(diào)控機制提供新的思路和理論依據(jù),豐富綿羊生殖生理的分子調(diào)控理論。

1 材料與方法

1.1 湖羊組織樣品采集和睪丸間質(zhì)細胞分離

在江蘇省泰州市海倫羊業(yè)有限公司選取5日齡(5 D)、3月齡(3 M)、9月齡(9 M)和2年齡(2 Y)不同生長階段湖羊公羊,每組3只,經(jīng)頸靜脈放血致死后立即屠宰,取心臟、肝、脾、腎、空腸、睪丸組織放于凍存管中,投入液氮中凍存,隨后帶回實驗室-80 ℃冰箱保存。3 M湖羊睪丸用預(yù)冷的體積分數(shù)為75%乙醇浸泡30 s,預(yù)冷滅菌生理鹽水清洗3次后,立即帶回實驗室用于細胞分離。

取出睪丸,用75%乙醇浸泡和滅菌生理鹽水清洗后,再將其移至超凈臺內(nèi),用手術(shù)剪剝離外圍脂肪組織及附睪部分,剝開睪丸組織取出約1 cm3組織,在無菌培養(yǎng)皿中將其剪成糊狀移入50 mL離心管中,加入40 mL 1 mg·mL-1的膠原酶(Gibco),在37 ℃水浴鍋中消化15 min后,用等體積的含15%血清的DMEM/F12(Gibco)終止消化。吹打均勻后使用40 μm細胞篩過濾2次,1 500 r·min-1離心5 min,DPBS清洗細胞3次后,用含15%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液重懸并接種到培養(yǎng)皿中,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中2 h后,吸出培養(yǎng)液,去除未貼壁細胞,更換新的培養(yǎng)液。

1.2 RT-qPCR檢測及l(fā)ncRNA-NAS序列設(shè)計合成

使用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取湖羊心臟、肝、脾、腎、空腸、睪丸組織及睪丸間質(zhì)細胞的RNA,RNA質(zhì)量檢測合格后,用反轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)lncRNA測序得到的序列信息,通過Primer-BLAST設(shè)計lncRNA-NAS、Nanos3、Bax、Bcl-2和GAPDH基因的引物對序列(表1)。將RT合成的cDNA作為模板,進行qPCR檢測。加樣體系:SYBR Green Master 10 μL,上、下游引物各0.8 μL,cDNA 1 μL,補加超純水至20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個循環(huán);72 ℃ 10 min。用2-ΔΔCT法對有效數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.3 睪丸間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染試驗

將睪丸間質(zhì)細胞傳代至6孔板中,等其長到60%～70%匯合度時,進行轉(zhuǎn)染試驗。

小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)的轉(zhuǎn)染:向lncRNA-NASsiRNA和對照組siRNA 序列中分別添加125 μL和62.5 μL RNase-free H2O。分別取6 μL siRNA與125 μL Opti-MEM培養(yǎng)液進行混合。取6 μL稀釋的Lipofectamine 3000與125 μL Opti-MEM培養(yǎng)液混合,靜置5 min后,移出細胞培養(yǎng)液,DPBS清洗細胞2次,將上述混合液移至6孔板中,用新鮮培養(yǎng)液補至2 mL。細胞培養(yǎng)48 h后,收集培養(yǎng)上清液和細胞,檢測上清液中的睪酮含量及睪酮分泌相關(guān)基因的表達。

1.4 轉(zhuǎn)染后睪酮含量檢測

根據(jù)綿羊睪酮測定試劑盒(CSB-E1317Sh,上海卡邁舒)說明書,分別在轉(zhuǎn)染后0和48 h檢測空白對照組、陰性對照組和試驗組細胞培養(yǎng)上清液中的睪酮含量。

1.5 Western blot檢測

分別按照組織和細胞蛋白提取說明書提取不同生長階段湖羊睪丸組織和LC的蛋白,使用BCA蛋白檢測試劑盒(碧云天)檢測蛋白濃度,進行蛋白變性后,取40 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳(200 V)0.5 h后,轉(zhuǎn)膜(60 V)2 h,用脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。加一抗(Bax抗體,1∶1 000稀釋;Bcl-2抗體,1∶500稀釋;ACTIN抗體,1∶4 000稀釋),4 ℃孵育過夜后,加二抗(HRP標記羊抗兔IgG,1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h。用ECL發(fā)光液顯影并拍照,用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后睪丸間質(zhì)細胞增殖

使用CCK-8 Kit(碧云天)檢測細胞增殖率。將細胞按密度為每孔2×103個細胞,接種于96孔板中,待細胞增殖到60%進行轉(zhuǎn)染,對照組不加siRNA。細胞每組設(shè)6個重復(fù)孔,分別在轉(zhuǎn)染24、48和72 h后加入10 μL CCK-8試劑,孵育3 h,用酶標儀檢測吸光度值(A450)。

1.7 lncRNA-NAS序列確定及靶基因的預(yù)測

根據(jù)本課題組前期試驗結(jié)果[11],即通過Illumina HiSeq平臺對5 D、3 M、9 M和2 Y湖羊睪丸組織進行l(wèi)ncRNA高通量測序分析,篩選差異表達lncRNA,并利用順式作用和反式作用對lncRNA的靶基因進行預(yù)測。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 lncRNA-NAS在湖羊組織中的差異表達分析

如圖1所示:lncRNA-NAS在湖羊心臟、肝、脾、腎、空腸、睪丸組織中均有表達,且在睪丸中的表達量顯著高于其他組織(P<0.05)。lncRNA-NAS在睪丸中的表達量隨著年齡(5 D、3 M、9 M和2 Y)增長而呈現(xiàn)上升趨勢,其中2 Y組的表達量顯著高于5 D、3 M和9 M組(P<0.05),9 M的表達量顯著高于5 D和3 M(P<0.05),5 D和3 M的表達量差異不顯著(P>0.05)。

圖1 lncRNA-NAS mRNA在湖羊不同組織(A)及不同發(fā)育階段睪丸中(B)的表達量Fig.1 Expression level of lncRNA-NAS mRNA in different tissues(A)and sheep testis of different developmental stages(B) 1)5 D:5日齡5-day-old;3 M:3月齡3-month-old;5 M:5月齡5-month-old;2 Y:2周歲2-year-old;2)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. 下同。The same as follows.

2.2 湖羊睪丸間質(zhì)細胞的鑒定及siRNA lncRNA-NAS的篩選

如圖2-A所示:對體外分離培養(yǎng)的湖羊睪丸間質(zhì)細胞進行標記基因3β-HSD和CYP11a1鑒定。通過對睪丸間質(zhì)細胞進行siRNA干擾,結(jié)果(圖2-B)顯示:siRNA lncRNA-NAS3干擾效果最好,lncRNA-NAS的表達量顯著降低(P<0.05)。

圖2 siRNA 干擾間質(zhì)細胞后lncRNA-NAS的表達Fig.2 The expression level of lncRNA-NAS after siRNA interfering with Leydig cellsA. 睪丸間質(zhì)細胞鑒定圖Identification of testis Leydig cells;B. siRNA lncRNA-NAS的篩選The screen of siRNA lncRNA-NAS.

2.3 干擾lncRNA-NAS對湖羊睪丸間質(zhì)細胞睪酮激素分泌和相關(guān)基因及蛋白表達的影響

如圖3所示:相比對照組,siRNA lncRNA-NAS3轉(zhuǎn)染組,細胞培養(yǎng)液中睪酮含量顯著升高(P<0.05);睪酮分泌相關(guān)基因3β-HSD與CYP11a1mRNA表達量顯著升高(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果也顯示,經(jīng)siRNA lncRNA-NAS3轉(zhuǎn)染,CYP11a1蛋白相對表達量也顯著高于對照組(P<0.05)。

圖3 siRNA lncRNA-NAS3干擾睪丸間質(zhì)細胞后睪酮含量和相關(guān)基因及蛋白表達量的變化Fig.3 The changes of testosterone content and the expression level of related genes and protein with siRNA lncRNA-NAS3 interfering Leydig cells

2.4 干擾lncRNA-NAS后對睪丸間質(zhì)細胞凋亡和增殖相關(guān)基因和蛋白的影響

如圖4所示:經(jīng)過siRNA lncRNA-NAS3轉(zhuǎn)染48 h后,試驗組較對照組中BaxmRNA表達水平顯著降低(P<0.05),Bcl-2mRNA表達水平顯著升高(P<0.05),Bax/Bcl-2值顯著降低(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示,siRNA lncRNA-NAS3處理組Bcl-2的蛋白相對表達量顯著高于對照組(P<0.05),Bax蛋白相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)。使用siRNA lncRNA-NAS3干擾24、48和72 h后,睪丸間質(zhì)細胞的增殖活力增強(P>0.05)。

圖4 siRNA lncRNA-NAS3干擾后睪丸間質(zhì)細胞凋亡和增殖相關(guān)基因及蛋白的變化Fig.4 The changes of apoptosis and proliferation related genes and proteins with siRNA lncRNA-NAS3 interfering Leydig cells

2.5 lncRNA-NAS靶基因的預(yù)測及功能驗證

根據(jù)前期測序結(jié)果[11]篩選出7個lncRNA-NAS靶基因(表2),分別為IL27RA、RLN3、RFX1、DCAF15、PODNL1、CC2D1A及Nanos3。對目的基因功能進行研究,得出Nanos3為生殖關(guān)鍵基因,對于睪丸發(fā)育及精子發(fā)生具有重要作用。lncRNA-NAS與Nanos3均位于5號染色體上,lncRNA-NAS大小為942 bp,Nanos3大小為1 680 bp。為進一步驗證二者的調(diào)控關(guān)系,對lncRNA-NAS干擾后發(fā)現(xiàn),Nanos3表達量較陰性對照組顯著升高(P<0.05)(圖5-A),證明二者存在調(diào)控關(guān)系。圖5-B為lncRNA-NAS在睪丸間質(zhì)細胞中的功能示意圖,可見lncRNA-NAS可通過調(diào)控靶基因Nanos3對睪丸間質(zhì)細胞增殖、凋亡及睪酮分泌產(chǎn)生影響。

表2 預(yù)測lncRNA-NAS靶基因的相關(guān)信息Table 2 The information of predict target gene of lncRNA-NAS

圖5 siRNA lncRNA-NAS3干擾后Nanos3變化(A)及l(fā)ncRNA-NAS功能示意圖(B)Fig.5 The change of Nanos3 with siRNA lncRNA-NAS3 interfering Leydig cells(A) and lncRNA-NAS function diagram(B)

3 討論

長鏈非編碼RNA(lncRNA)在哺乳動物睪丸發(fā)育及精子生成等過程起著重要的調(diào)控作用[5]。Zhu等[12]發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA具有組織特異性,在睪丸發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。Liang等[13]篩選出241種特異表達的lncRNA,參與蛋白質(zhì)編碼以維持精原干細胞的存活和自我更新。Nishant等[14]發(fā)現(xiàn)長度約為2.4 kb的lncRNAmrhl位于小鼠8號染色體上;Ganesan等[15]證明lncRNAmrhl可以與染色質(zhì)相互作用,共同調(diào)節(jié)精子發(fā)生和成熟;Arun等[16]研究證明在小鼠精原干細胞 中,lncRNAmrhl可以與Ddx5/p68共同作用,調(diào)控Wnt信號通路。Lee等[17]在A型精原細胞及圓形精子中發(fā)現(xiàn)特異表達的lncRNA,利用qPCR和Northern等方法發(fā)現(xiàn)Spga-lncRNA 1和Spga-lncRNA 2在精原細胞中特異表達。Ni等[18]在附睪尾中發(fā)現(xiàn)特異表達的lncRNAHongrES2,其能夠調(diào)節(jié)精子成熟。Zhang等[19]研究證明lncRNADmr參與干細胞有絲分裂和減數(shù)分裂,并且可以通過調(diào)控基因Sohlh1和Stra8以加快和抑制精子發(fā)生進程。Trovero等[20]研究小鼠精子發(fā)生過程中l(wèi)ncRNA轉(zhuǎn)錄圖譜時發(fā)現(xiàn)不同生精階段lncRNA表達模式與蛋白質(zhì)變化具有緊密關(guān)系。Gao等[21]在檢測牛睪丸發(fā)育時,發(fā)現(xiàn)在牛間質(zhì)細胞和支持細胞中均有大量lncRNA及順式靶基因存在,其共同調(diào)節(jié)睪丸發(fā)育。已有的研究主要集中在各級生精細胞中,但是關(guān)于lncRNA影響睪丸間質(zhì)細胞分泌睪酮的研究鮮見報道。

本試驗基于本課題組前期測序結(jié)果[11],選擇性成熟前、后湖羊睪丸差異lncRNA-NAS進行功能驗證。定量檢測發(fā)現(xiàn)lncRNA-NAS在心、肝、脾、腎、空腸、睪丸中均有表達,并在睪丸中高表達。隨著日齡增長,湖羊睪丸中l(wèi)ncRNA-NAS表達量呈上升趨勢,這為繼續(xù)探究lncRNA-NAS是否參與睪酮分泌提供支撐。哺乳動物的睪丸LC有胚胎型和成年型[22]。隨著雄性動物年齡增加,睪酮合成中必需的FSH和LH分泌量減少,睪酮無法正常合成,致使雄性動物出現(xiàn)體重增加、肌肉量減少、疲勞等癥狀[23]。鑒于此,選取3月齡湖羊睪丸分離LC,3β-HSD與CYP11a1特異性基因的表達已確保LC的高純度和高活力。通過選取有效siRNA lncRNA-NAS3抑制lncRNA-NAS表達,發(fā)現(xiàn)細胞上清液中睪酮分泌激素含量顯著上升,睪酮分泌相關(guān)基因3β-HSD與CYP11a1mRNA和蛋白較對照組顯著升高,細胞凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2表達顯著降低,睪丸間質(zhì)細胞增殖呈上升趨勢,證明該lncRNA-NAS能夠?qū)ΣG酮分泌進行調(diào)節(jié)。

本試驗通過在線工具預(yù)測lncRNA-NAS可能作用的靶基因有9個,2個為未知基因,其余7個有功能注釋的分別為IL27RA、RLN3、RFX1、DCAF15、PODNL1、CC2D1A和Nanos3。但是在lncRNA-NAS表達量降低后,只有靶基因Nanos3表達發(fā)生變化。Nanos3主要功能為調(diào)控睪丸發(fā)育及睪酮分泌過程[20-24],Nanos3是Nanos基因家族一員,是一類RNA結(jié)合蛋白,靠近C端位置,為2個具有保守性的鋅指結(jié)構(gòu)。小鼠Nanos基因家族主要為Nanos1、Nanos2和Nanos3。敲除小鼠Nanos1基因后,雌性小鼠和雄性小鼠依然保持生殖能力;敲除Nanos2基因后,雄性小鼠喪失繁殖能力,雌性小鼠保持生殖能力[25];敲除Nanos3基因后,雌性小鼠和雄性小鼠都失去生殖能力[2]。Nanos3能夠調(diào)控生殖細胞的正常分化,Nanos3基因敲除后,Bax凋亡通路被激活,PGC無法正常遷移至生殖嵴,到達后腸及生殖嵴周圍后發(fā)生細胞凋亡,由此可知其對形成正常生殖細胞具有重要作用[26]。因此,推測lncRNA-NAS可能通過影響靶基因Nanos3的表達調(diào)控睪丸間質(zhì)細胞的分泌。

綜上,lncRNA-NAS參與湖羊睪酮分泌并調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細胞增殖和凋亡。通過siRNA lncRNA-NAS干擾,初步驗證lncRNA-NAS調(diào)節(jié)湖羊睪丸間質(zhì)細胞的睪酮分泌,并有可能通過靶基因Nanos3發(fā)揮作用。