水稻巨大胚突變體N2-52堊白形成機(jī)制研究

葛鑫源,劉世家,李欣,燕海剛,王永祥,傅玉雙,單壯壯,張文偉,王益華,江玲

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/長(zhǎng)江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)中心,江蘇 南京 210095)

堊白是由于稻米胚乳中淀粉顆粒排列疏松、顆粒間存在間隙,引起光的折射而產(chǎn)生的,根據(jù)堊白在籽粒中的部位,將其劃分為腹白、心白和背白[1]。描述堊白的綜合指標(biāo)有2個(gè),即堊白率和堊白度,堊白嚴(yán)重的水稻在加工過(guò)程中易斷,整精米率降低,蒸煮后米粒斷裂,影響食味品質(zhì)。減少堊白率和降低堊白度是稻米品質(zhì)改良的主攻目標(biāo),深入研究堊白的形成及產(chǎn)生堊白的分子機(jī)制是育種上克服這一不利性狀的前提。堊白是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀,受環(huán)境和基因型的共同作用。已報(bào)道與水稻堊白形成有關(guān)的QTL有 82個(gè),分布于除第4染色體外的11條染色體上[1],其中第8染色體27個(gè),第9染色體18個(gè)(數(shù)據(jù)來(lái)源網(wǎng)站 http://www.gramene.org/archive/qtl)。Wx位點(diǎn)是影響堊白形成的主效QTL之一[2]。此外,已知多個(gè)與淀粉合成相關(guān)的基因影響堊白的形成,包括OsPPDKB[1]、SSⅢa[3]、PHO1[3]、BT1[3]和OsPKpα1[4],這些基因的突變均可導(dǎo)致淀粉顆粒的形態(tài)異常和堊白的產(chǎn)生。但是,關(guān)于堊白形成與淀粉合成之間的具體聯(lián)系,目前仍不明確。

巨大胚基因(giant embryo,GE)編碼1個(gè)細(xì)胞色素P450超家族的CYP78A亞家族成員[5]。GE突變會(huì)導(dǎo)致水稻籽粒的胚增大、胚乳縮小,并影響胚發(fā)育、莖頂端分生組織的維持和籽粒產(chǎn)量。GE還在短鏈脂肪酸代謝中發(fā)揮作用。雖然GE在胚和胚的小葉上皮中表達(dá)[6],但GE突變體胚乳出現(xiàn)了堊白表型[5],原因尚待闡明。

本研究室之前篩選到的1個(gè)水稻巨大胚突變體N2-52,具有明顯的堊白表型。本研究分析N2-52籽粒理化性質(zhì)、淀粉顆粒和造粉體形態(tài),比較不同灌漿時(shí)期、籽粒不同部位的淀粉合成酶積累量,測(cè)定蔗糖合酶活性;通過(guò)分析N2-52胚乳淀粉合成途徑的變化,探討GE基因影響堊白形成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和農(nóng)藝性狀觀察

在粳稻品種‘寧粳2號(hào)’經(jīng)甲磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)化學(xué)誘變獲得的M2代群體中,篩選出穩(wěn)定遺傳的巨大胚突變體N2-52。將N2-52與秈稻品種‘N22’雜交獲得F1種子,并衍生得到F2突變基因定位群體。2018年正季將N2-52及其野生型種植在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓實(shí)驗(yàn)基地,分別隨機(jī)選取 20株成熟植株,考察株高、穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀。

1.2 成熟種子橫斷面的掃描電鏡觀察及半薄切片樣品制備和觀察

在日立 S-3000N 型掃描電子顯微鏡(加速電壓5 kV)下觀察N2-52及其野生型成熟種子的橫斷面。

在水稻開(kāi)花后 9 d,選取96個(gè)籽粒的胚乳,在緊鄰胚下的胚乳部位,用單面刀片將胚乳切成厚度為 1～2 mm 的薄片,在4 ℃條件下于戊二醛固定液中過(guò)夜;在-20 ℃冰箱中脫水、滲透,在室溫下用100% LR White樹(shù)酯進(jìn)行包埋,封口膜封好,60 ℃烘箱放置48 h聚合。修樣后用切片機(jī)切片,樣品厚度1 μm,用撈樣器將切片撈至干凈的載玻片上,60 ℃烤片至水分蒸發(fā)干凈;在樣品上適量滴加 1% I2-KI 溶液著色,顯微鏡下觀察淀粉顆粒并拍攝照片。

1.3 脂肪、蛋白、總淀粉、直鏈淀粉含量的測(cè)定

將N2-52及其野生型種子去殼后碾磨成糙米粉,過(guò)150 μm 篩,烘干至恒重。稱取3.000 g 糙米粉,重復(fù)3次,采用 FOSS 公司的全自動(dòng)脂肪測(cè)定儀測(cè)定脂肪含量,并根據(jù)糙米重,換算成每粒糙米的脂肪含量。

使用FOSS公司KJELTEC2300型全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定總氮含量,換算成蛋白質(zhì)含量(轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.95),之后換算成每粒糙米的蛋白含量。

采用Megazyme總淀粉含量測(cè)定試劑盒(愛(ài)爾蘭Megazyme國(guó)際有限公司),利用酶解法,并根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的方法(a)進(jìn)行測(cè)定,再換算成每粒糙米的淀粉含量。

直鏈淀粉含量的測(cè)定按照《水稻、玉米、谷子籽粒直鏈淀粉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn):GB 7648—1987》 的方法。

1.4 米粉的尿素膨脹體積測(cè)定

配制0～9 mol·L-1尿素溶液,并用2 mol·L-1醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.0。稱取20 mg精米粉,加入1.5 mL EP管中,分別向每個(gè)EP管加入不同濃度的尿素溶液1 mL,混合均勻后在25 ℃、200 r·min-1振蕩24 h;室溫下8 000g離心20 min,靜置1 h。3次重復(fù)。淀粉顆粒在尿素中的溶解度用膨脹體積來(lái)衡量,即膨脹體積=總體積-上清液的體積。

1.5 米粉的黏度分析

稱取N2-52及其野生型精米米粉樣品(過(guò)150 μm篩)各3.000 g至鋁杯中,加入25 mL ddH2O(樣品、鋁杯預(yù)先烘干至恒重)。重復(fù)3次。采用瑞典波通公司(Perten)的快速黏度分析儀(RVA)測(cè)定米粉的黏度特性,用Excel 2019繪圖分析。

1.6 基因的圖位克隆

通過(guò)雜交獲得N2-52(♀)/‘N22’(♂)的F2種子,去殼后挑選與突變體表型一致的籽粒提取DNA,使用本實(shí)驗(yàn)室已有的分子標(biāo)記,用44個(gè)極端個(gè)體進(jìn)行連鎖分析,確定連鎖區(qū)間后增加標(biāo)記并從F2種子中進(jìn)一步挑選極端個(gè)體750個(gè),開(kāi)發(fā)標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位(表1)。標(biāo)記的開(kāi)發(fā)基于Graneme網(wǎng)站和Primer Premier 5.0軟件。

表1 N2-52突變基因精細(xì)定位所用的分子標(biāo)記Table 1 Markers for fine mapping of the mutant locus of N2-52

1.7 蛋白免疫印跡分析

分別提取開(kāi)花后9 d和成熟時(shí)的種子、N2-52堊白部位及其野生型對(duì)應(yīng)部位的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。使用ExpressPlus預(yù)制膠(4%～20%)進(jìn)行電泳,電泳完成后使用eBlot L1蛋白轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上(Minipore 0.45 μm),使用封閉液(5%脫脂奶粉,PBST溶解)封閉1 h。轉(zhuǎn)入含有一抗(1∶10 000)的新封閉液中孵育1 h。PBST漂洗PVDF膜3次,每次10 min。再將膜轉(zhuǎn)入含有二抗(1∶5 000)的封閉液中孵育 1 h,重復(fù)漂洗。使用ECL發(fā)光液檢測(cè)。所用抗體為ADP葡萄糖焦磷酸化酶小亞基Ⅱb(ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit Ⅱb,AGPS Ⅱb)、顆粒結(jié)合淀粉合酶Ⅰ(granule bound starch synthaseⅠ,GBSSⅠ)、淀粉分支酶Ⅰ(branching enzymeⅠ,BEⅠ)、淀粉分支酶Ⅱb(branching enzymeⅡb,BEⅡb)、淀粉合酶Ⅱa(starch synthaseⅡa,SSⅡa),由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司制備,內(nèi)參抗體為Anti-Actin。

1.8 蔗糖合酶活性測(cè)定

蔗糖合酶活性測(cè)定參照韓小花[7]的方法。分別取開(kāi)花后9 d的種子5粒,剝殼后研磨,將粉末置于2.0 mL的EP管中,按0.1 g·mL-1的比例加入提取液,4 ℃、13 000 r·min-1離心20 min,取上清液再離心 10 min,取上清液用于酶活性測(cè)定,重復(fù)3次。蔗糖合酶活性測(cè)定步驟:在10 mL洗凈烘干的玻璃管中加入50 mmol·L-1蔗糖50 μL、50 mmol·L-1MgCl250 μL、Hepes(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonicacid)緩沖液500 μL、酶提取液50 μL,振蕩搖勻后30 ℃預(yù)熱10 min,加入50 mmol·L-1尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)50 μL、50 mmol·L-1蔗糖溶液50 μL,30 ℃水浴10 min。向各反應(yīng)管中加入2 mmol·L-1NaOH 100 mL,沸水浴10 min 終止反應(yīng)。待冷卻至室溫后,加入3.5 mL 30% HCl和1 mL 0.1%間苯二酚,80 ℃水浴10 min,冷卻后使用分光光度計(jì)在480 nm處測(cè)定酶活性。100 mL酶提取液配方:50 mmol·L-1Hepes、2 mmol·L-1MgCl2、50 mmol·L-1β-巰基乙醇、12.5%甘油。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻巨大胚突變體N2-52表型分析

相較于野生型,突變體成熟種子具有巨大胚,同時(shí),胚下方和籽粒腹部下方產(chǎn)生了堊白(圖1-A)。N2-52成熟種子的粒長(zhǎng)和粒厚與野生型種子相比無(wú)明顯差異,粒寬則顯著高于野生型,堊白粒率極顯著高于野生型。N2-52植株的每穗粒數(shù)和結(jié)實(shí)率極顯著低于野生型,千粒重顯著低于野生型,株高顯著高于野生型(圖1-B),但穗長(zhǎng)無(wú)明顯差異(表2)。

圖1 N2-52及其野生型(WT)的成熟籽粒(A)和植株表型(B)Fig.1 Phenotype of N2-52 and the wild-type(WT)mature seeds(A)and plants(B)

表2 N2-52及其WT的主要農(nóng)藝性狀Table 2 Main agronomic traits of N2-52 and the WT

2.2 N2-52堊白部位的掃描電鏡觀察

對(duì)N2-52堊白部位及其野生型成熟種子的相同位置(圖中紅色方框位置)橫斷面進(jìn)行掃描電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)N2-52籽粒的橫斷面淀粉顆粒排列疏松,呈不規(guī)則的球體或棒狀(圖2-A、B、C),而野生型籽粒淀粉顆粒排列緊密,呈規(guī)則多面體(圖2-D、E、F)。

圖2 N2-52及其WT成熟種子橫斷面掃描電鏡觀察Fig.2 Scanning electron microscopy observation to the cross sections of N2-52 and the WT grains A、D. 種子橫斷面;B、C、E、F. N2-52的堊白部位和野生型相應(yīng)區(qū)域(A和D紅色矩形區(qū)域)。A,D. The cross sections of grains;B,C,E,F. The chalky part of N2-52 and the counterpart of the wild-type,corresponding to red rectangle in A and D separately.

2.3 半薄切片觀察

取開(kāi)花后9 d種子制作半薄切片,發(fā)現(xiàn)N2-52胚乳中淀粉顆粒排列疏松,小淀粉顆粒明顯增多,正常發(fā)育的造粉體減少,胞內(nèi)局部出現(xiàn)空腔(圖3-A紅色箭頭所示);野生型胚乳中的淀粉顆粒排列緊密,造粉體發(fā)育正常(圖3-B)。推測(cè)N2-52胚乳中空腔是由淀粉顆粒填充不足造成的。

圖3 花后9 d N2-52(A)及其WT(B)胚乳半薄切片觀察Fig.3 Semi-thin sections observation to N2-52(A)and the WT(B)endosperm at 9 days after flowering箭頭示空腔位置。Arrows indicate empty position.

2.4 N2-52籽粒的脂肪、總蛋白含量和淀粉成分分析

N2-52成熟籽粒的蛋白質(zhì)含量比野生型高12.5%,脂肪含量降低42.4%。每粒野生型種子含淀粉 15.1 mg,而每粒N2-52種子僅有12.2 mg,但是它的直鏈淀粉含量比野生型高27%(表3),推測(cè)N2-52的淀粉合成受阻。

表3 N2-52及其WT種子的主要化學(xué)成分Table 3 Major chemical components of N2-52 and the WT seeds

2.5 米粉的尿素膨脹實(shí)驗(yàn)

在低濃度尿素溶液(0～3 mol·L-1)中,N2-52米粉膨脹體積略高于野生型;在尿素濃度為4～6 mol·L-1時(shí),N2-52膨脹體積顯著高于野生型,而在高濃度尿素溶液中(8～9 mol·L-1)野生型米粉膨脹體積極顯著高于N2-52(圖4)。說(shuō)明N2-52基因突變改變了淀粉顆粒的結(jié)構(gòu),從而改變淀粉在尿素中的溶解度。

圖4 尿素濃度對(duì)N2-52及其WT米粉膨脹體積的影響Fig.4 Effects of the urea concentration on swelling volume of starch powered from grains of N2-52 and the WT

2.6 快速黏度分析儀(RVA)分析淀粉的黏度特性

相較于野生型,N2-52淀粉的黏度曲線比較平緩,總體上低于野生型(圖5)。在黏度曲線的特征值方面,N2-52淀粉峰值黏度、崩解值、熱漿黏度和冷膠黏度均顯著高于野生型,而消減值則顯著低于野生型(表4),說(shuō)明N2-52基因突變改變了突變體淀粉的黏度特性。

圖5 N2-52及其WT淀粉的黏度特性分析Fig.5 Viscosity profile analysis of N2-52 and the WT starch

表4 N2-52及其WT淀粉的黏度特性Table 4 The pasting properties of N2-52 and the WT starch

2.7 N2-52突變基因的精細(xì)定位

在N2-52(♀)/‘N22’(♂)的F2群體中,一共鑒定到與突變體相似表型性狀的種子1 127粒,而正常的種子有3 621粒,經(jīng)卡方分析χ2=2.057,符合3∶1的理論分離比例。利用圖位克隆的方法,挑選出44個(gè)與突變體相似表型性狀的F2個(gè)體進(jìn)行定位,將突變基因連鎖于第7染色體長(zhǎng)臂N7-31與N7-32標(biāo)記之間(圖6-A)。進(jìn)一步利用750個(gè)極端個(gè)體將基因定位于標(biāo)記LX-12與LX-13之間,該區(qū)間物理距離為42 kb(圖6-B)。根據(jù)水稻數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)數(shù)據(jù),該區(qū)間共有5個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF,圖6-C),測(cè)序發(fā)現(xiàn)只有ORF 3即Os07g0603700在其編碼區(qū)第2個(gè)外顯子的第1 529個(gè)堿基由C突變?yōu)锳(圖6-D),導(dǎo)致翻譯的提前終止。通過(guò)序列(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)比對(duì),確定突變基因Os07g0603700為之前報(bào)道的水稻巨大胚基因GE[5-6,8]。

圖6 N2-52突變基因的圖位克隆Fig.6 Map-based cloning of the mutated gene from N2-52 A. N2-52突變基因與標(biāo)記N7-31和N7-32連鎖;B. 利用750個(gè)極端個(gè)體將N2-52基因定位于42 kb區(qū)間內(nèi);C. N2-52的基因預(yù)測(cè)(紅色箭頭為突變基因);D. Os07g0603700的基因結(jié)構(gòu),N2-52中發(fā)生T→A的單堿基突變。A. The N2-52 gene was linked with the markers N7-31 and N7-32;B. Using 750 individuals,the N2-52 gene was located in the 42 kb interval;C. The prediction of N2-52 candidate genes(the red arrow indicates the mutant gene);D. The gene structure of Os07g0603700,a single base mutation of T to A in N2-52.

2.8 N2-52籽粒淀粉合成酶的蛋白免疫印跡分析和酶活性測(cè)定

對(duì)N2-52開(kāi)花后9 d種子以及成熟種子(整粒和堊白部位)淀粉合成酶的蛋白量進(jìn)行免疫印跡分析。N2-52成熟籽粒中GBSSⅠ和BEⅠ蛋白量上升,而B(niǎo)EⅡb、SSⅡa蛋白量下降;其堊白部位的BEⅠ、BEⅡb、SSⅡa下降而GBSSⅠ上升,且沒(méi)有檢測(cè)到AGPSⅡb。在N2-52開(kāi)花后9 d種子中,BEⅠ、BEⅡb和SSⅡa蛋白量均下降,而GBSSⅠ上升(圖7-A)。對(duì)開(kāi)花后9 d的N2-52和野生型種子的蔗糖合酶活性進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)N2-52的蔗糖合酶活性顯著上升(圖7-B)。

圖7 N2-52及其WT淀粉合成酶的免疫印跡分析(A)和酶活性測(cè)定(B)Fig.7 Western blot analysis(A)and relative activities(B)of starch synthetases of N2-52 and the WT

3 討論

胚乳是水稻籽粒的營(yíng)養(yǎng)貯藏部位,其品質(zhì)也是影響水稻經(jīng)濟(jì)的主要因素。胚乳堊白影響水稻籽粒的外觀以及整精米率,是水稻品質(zhì)育種最主要的改良目標(biāo)之一[9],其遺傳特性復(fù)雜,堊白形成的原因和調(diào)控機(jī)制還不明確[1]。

本文通過(guò)對(duì)巨大胚突變體N2-52的研究,圖位克隆了GE基因。N2-52中GE基因的單堿基突變,導(dǎo)致巨大胚和堊白的表型。在之前的研究中,發(fā)現(xiàn)GE基因編碼CYP78A家族的細(xì)胞色素P450,抑制水稻盾片細(xì)胞生長(zhǎng),維持莖頂端分生組織的生理狀態(tài)[8];而對(duì)于胚中表達(dá)的GE與胚乳中的淀粉合成途徑之間的聯(lián)系尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)野生型和N2-52籽粒的理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),突變體的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;掃描電鏡和半薄切片觀察發(fā)現(xiàn),N2-52堊白部位的淀粉顆粒排列松散、分布稀疏。在N2-52成熟籽粒的堊白部位,多個(gè)淀粉合成酶的表達(dá)發(fā)生變化,包括AGPS Ⅱb、BEⅠ、BEⅡb、SSⅡa、GBSSⅠ。水稻胚乳的發(fā)育成熟是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程[10],由多種酶共同調(diào)控完成[11-14]。AGPS Ⅱb作為AGPase的小亞基,負(fù)責(zé)胚乳發(fā)育中后期淀粉的合成;GBSSⅠ負(fù)責(zé)催化直鏈淀粉的長(zhǎng)葡聚鏈的延伸[15];BEⅠ催化產(chǎn)生DP≥16的長(zhǎng)鏈支鏈淀粉;BEⅡb負(fù)責(zé)產(chǎn)生支鏈淀粉的同時(shí)降解具有分支的水溶性多聚糖,BEⅡb的基因突變會(huì)產(chǎn)生淀粉顆粒變小的表型;SSⅡa主要負(fù)責(zé)合成水稻中長(zhǎng)鏈支鏈淀粉[11]。因此,這些淀粉合成酶在籽粒灌漿中對(duì)淀粉的合成和積累起不可或缺的作用,推測(cè)這些酶的表達(dá)變化,使N2-52堊白部位的淀粉合成途徑受阻、淀粉顆粒結(jié)構(gòu)改變從而產(chǎn)生堊白。N2-52成熟籽粒的直鏈淀粉含量相對(duì)于野生型顯著增加,與GBSSⅠ表達(dá)上調(diào)的結(jié)果相一致。

CYP78A家族的細(xì)胞色素P450主要表達(dá)于胚和胚的小葉上皮中[16],而GE功能的喪失可以改變盾片的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[8]。由于盾片為胚的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng),盾片結(jié)構(gòu)的改變使更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入胚中,產(chǎn)生巨大胚的表型[8]。在本研究中,N2-52成熟籽粒的堊白位于胚下方和腹部下方,胚下方的堊白可能由于胚的異常發(fā)育,導(dǎo)致進(jìn)入灌漿籽粒的碳源被過(guò)度消耗,使胚乳淀粉的合成受阻而產(chǎn)生。腹部下方的堊白除淀粉合成受阻外還可能由于其距胚較遠(yuǎn)[10],碳源運(yùn)輸不足,導(dǎo)致淀粉填充不足進(jìn)而產(chǎn)生。蔗糖作為水稻籽粒淀粉合成的碳源物質(zhì),直接影響庫(kù)源器官之間的裝卸[17]。突變體中蔗糖合酶活性的上升,反映了淀粉合成的一種補(bǔ)償性上升。綜上所述,GE基因突變可能造成胚乳淀粉合成受阻,從而改變淀粉顆粒的結(jié)構(gòu),產(chǎn)生了堊白。

Nagasawa等[5]的研究未從淀粉合成的角度來(lái)解析GE突變體堊白形成的原因。本研究對(duì)N2-52的淀粉合成途徑進(jìn)行了初步分析,發(fā)現(xiàn)GE突變導(dǎo)致淀粉合成酶的表達(dá)變化,但其如何影響淀粉合成,還有待進(jìn)一步研究。N2-52的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探究堊白形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),對(duì)理解水稻淀粉合成和改良水稻品種具有一定意義。