心律失常動物模型研究進(jìn)展

姜笑雨張連峰呂 丹*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021)

心律失常(cardiac arrhythmia)是指心臟沖動的頻率、節(jié)律、起源部位、傳導(dǎo)速率與激動次序異常。心律失常通常是由遺傳易感性、環(huán)境因素(食物誘導(dǎo)及物理化學(xué)刺激等)和心血管或其他疾病之間的相互作用而產(chǎn)生的。 心律失常能夠?qū)е滦脑葱遭?sudden cardiac death, SCD),可占所有死亡的25%[1]。 觸發(fā)活動或自律性增強(qiáng)可導(dǎo)致異常脈沖的形成以及心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)異常,使原來具有正常自律性的心肌細(xì)胞產(chǎn)生異常沖動的發(fā)放,成為異常自律性心肌細(xì)胞,甚至使原本不具有自律性的心肌細(xì)胞具有自律性,從而導(dǎo)致心律失常。 離子通道的異常表達(dá)或功能改變、心臟蘭尼堿受體2(RyR2)異常等均可誘導(dǎo)心律失常。

目前,在臨床上心律失?？刹捎盟幬?、導(dǎo)管消融術(shù)及植入裝置(控制心力衰竭的植入式心臟除顫器等)等治療手段[2]。 盡管對心律失常患者的治療已獲得一定療效,但對心律失常發(fā)病機(jī)制的研究仍不十分清楚。 優(yōu)良的動物模型能夠很好地復(fù)制臨床患者表型,同時作為研究工具,能夠用作發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)措施研究的必備材料。

目前在心律失常分子基礎(chǔ)、發(fā)病機(jī)制等研究中,經(jīng)常使用的動物模型包括小鼠,大鼠,兔,犬,山羊和豬等。 小鼠及大鼠的優(yōu)點(diǎn)是基因背景信息齊全,商品化試劑豐富,易繁殖,相對經(jīng)濟(jì),心臟活力強(qiáng),心電圖穩(wěn)定等。 而大動物的優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好,實(shí)驗(yàn)操作對動物造成的損傷相對較小,存活率高,并且更符合人體解剖和血流動力學(xué)的特點(diǎn)。 但不同物種心律失常動物模型的表型特點(diǎn)及制備方法各異,所以本文對國內(nèi)外心律失常動物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié),包括模型應(yīng)用的物種特點(diǎn),制備原理,以及模型應(yīng)用等。

1 小鼠心律失常模型

小鼠因其飼養(yǎng)成本低、繁殖迅速、體型小、操作簡便、背景清楚以及各種成熟的商業(yè)化試劑多等原因,日益成為發(fā)現(xiàn)基因功能、探索細(xì)胞過程、研究人類疾病機(jī)制、加速藥物研發(fā)和藥效評估的重要動物模型。 由于CRISPR/Cas9 基因組編輯的技術(shù)手段的成熟,小鼠模型已廣泛應(yīng)用于描述特定基因和信號通路在心律失常發(fā)病機(jī)制中的作用的研究中。然而,鑒于小鼠較小的心臟體積,這使一些干預(yù)措施受到限制,甚至是不可能的。 此外,小鼠心律失常的電生理特性和機(jī)制與人類有很大不同,導(dǎo)致小鼠心律失常模型的進(jìn)一步發(fā)展受到限制。 目前在小鼠動物模型中,常見的心律失常類型包括心房顫動,心室顫動以及房室傳導(dǎo)阻滯等。

1.1 小鼠房顫模型

心房顫動(Atrial Fibrillation, AF)是一種具有高發(fā)生率、高死亡率的常見心律失常。 Chen 等[3]及Guo 等[4]麻醉小鼠后,通過食管電極進(jìn)行心房起搏,成功誘發(fā)小鼠房顫。 Pan 等[5]及 Maruyama 等[6]構(gòu)建αMyHC-FKBP12 轉(zhuǎn)基因小鼠成功建立房顫模型,其機(jī)制可能與FKPB12 介導(dǎo)的INa 失調(diào)有關(guān)。 總結(jié)以往研究報(bào)道,房顫鼠模型并不能模擬人類房顫的典型觸發(fā)因素,所以仍需建立更合適的動物模型。

1.2 小鼠室顫模型

王振濤等[7]成功利用氯仿誘發(fā)小鼠室顫。 Luja等[8-9]發(fā)現(xiàn)缺血再灌注小鼠可以導(dǎo)致室顫。 缺血再灌注時,機(jī)體會產(chǎn)生大量的氧自由基,加重細(xì)胞膜的不穩(wěn)定性,降低線粒體膜電位,引起細(xì)胞損傷,引發(fā)心律失常[10-11]。

1.3 小鼠房室傳導(dǎo)阻滯模型

房室傳導(dǎo)阻滯(atrioventricular block, AVB)是一種危及生命的心律失常,AVB 大型動物模型由于耗費(fèi)資源多,并且不能廣泛用于標(biāo)準(zhǔn)臺式研究等原因,發(fā)展受限。 因此,小動物模型便顯得格外重要,正確反映臨床指標(biāo)的AVB 小動物模型將加速對疾病進(jìn)展和病理生理學(xué)的理解以及治療策略的發(fā)展[12]。 Bignolais 等[13]人使用射頻消融中斷房室結(jié)的傳導(dǎo),在小鼠體內(nèi)成功建立了AVB 模型。

2 大鼠心律失常模型

大鼠在心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)和藥物代謝等方面比小鼠更接近于人類,大鼠是評估試驗(yàn)藥物心臟電生理效應(yīng)和研究心血管疾病中離子通道分布及作用的重要工具,大鼠模型可以彌補(bǔ)大型動物(如豬犬羊等)和小型動物(如小鼠)的缺點(diǎn),在心腦血管疾病相關(guān)研究中仍占主導(dǎo)地位,手術(shù)操作和術(shù)后研究較為廣泛[14]。 近年來,由于CRISPR/Cas9 等核酸酶技術(shù)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)的成熟和廣泛應(yīng)用,使各類大鼠動物模型迅速發(fā)展,SD 和Wistar 是其中最常用的背景品系[15-16]。

與小鼠相似,大鼠同樣具備繁殖快、飼養(yǎng)管理成熟、經(jīng)濟(jì)及背景清晰等優(yōu)勢。 與小鼠相比,其體積更大,解剖操作相對簡易,對疾病抵抗力更高。但大鼠同樣因?yàn)樾呐K大小、心率、耗氧量、收縮力等的差異,使其心律失常的電生理特性,如動作電位形態(tài)和持續(xù)時間、離子通道分布等與人類有很大不同。 目前在大鼠動物模型中,常見的心律失常類型包括心房顫動、室性心動過速、房室傳導(dǎo)阻滯等。

2.1 大鼠房顫模型

小鼠因?yàn)樾姆刻‰y以容納多折返環(huán)等原因,導(dǎo)致其房顫模型的建立尚處于起步階段。 而大動物因操作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)成本高及個體差異大等原因,亦對應(yīng)用有所限制。 因此,建立大鼠房顫模型,對提高新藥篩選效率、理解疾病過程以及研究房顫發(fā)生機(jī)制具有重大意義。

Lv 等[17]通過尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液,成功建立大鼠房顫模型,并用該模型驗(yàn)證了miR-27b-3p 通過靶向 Wnt3a 可以調(diào)控 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路,從而減輕心房顫動大鼠的心房纖維化。 乙酰膽堿能夠與大鼠心房肌細(xì)胞M2(毒蕈堿受體M2亞型)受體結(jié)合,進(jìn)而激活乙酰膽堿依賴性鉀通道,縮短動作電位時程和有效不應(yīng)期[18-19]。 L 型鈣離子電流是動作電位平臺期除極的主要電流,大鼠體內(nèi)瞬時注入大量Ca2+,導(dǎo)致鈣通道蛋白表達(dá)降低,鈣離子內(nèi)流減少,心房肌細(xì)胞動作電位除極減慢,有效不應(yīng)期縮短,促使房顫發(fā)生[20]。 Guasch等[21]以大鼠為研究對象,通過活動平板高強(qiáng)度運(yùn)動建立房顫大鼠模型,其機(jī)制可能與自主神經(jīng)變化、心房擴(kuò)張和纖維化有關(guān)。 其中,迷走神經(jīng)的促進(jìn)尤其重要,它通過增強(qiáng)壓力反射反應(yīng)和心肌細(xì)胞對膽堿能刺激的敏感性而發(fā)生。 李閱歷等[22]以大鼠為模型,經(jīng)食道起搏,建立AF 模型。 該造模方式具有成功率高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、造模周期短,發(fā)病機(jī)制以及病理改變與臨床接近等優(yōu)點(diǎn),是較理想的方法之一。

2.2 大鼠室性心動過速模型

目前室性心動過速模型的建立都是在心梗的基礎(chǔ)上經(jīng)由藥物或電刺激誘導(dǎo)制備的,但這類模型在可誘導(dǎo)性或誘發(fā)后模型的穩(wěn)定性等方面還有很大不足。 迄今為止,心梗后室性心動過速仍無非常理想的動物模型。

開胸法結(jié)扎左前降支建立急性心肌梗死動物模型,腹腔注射異丙腎上腺素,通過程序電刺激方法已成功建立室性心動過速大鼠模型,其機(jī)制可能與異丙腎上腺素通過興奮β1 和β2 受體,使心肌收縮力加強(qiáng),心律加快,房室傳導(dǎo)加速,并能引起異位節(jié)律有關(guān)[23]。 這種模型的誘發(fā)率高,誘發(fā)后模型維持比較穩(wěn)定,為研究心梗后心律失常的發(fā)生機(jī)制及分子基礎(chǔ)等提供了一種較為理想的動物模型。

2.3 大鼠房室傳導(dǎo)阻滯模型

轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以顯示自發(fā)性房室傳導(dǎo)阻滯,但其阻滯的程度和持久性是不可預(yù)測的,因?yàn)锳VB 是轉(zhuǎn)基因修飾的副作用,而不是直接效應(yīng)[24]。因此,轉(zhuǎn)基因小鼠AVB 模型應(yīng)用受限,仍需建立其他物種的AVB 模型。

在大鼠中線胸骨心包切開之后,將乙醇注入房室交界區(qū),建立房室傳導(dǎo)阻滯模型,其機(jī)制可能與乙醇注入心臟組織可造成心肌細(xì)胞溶解、凋亡、缺血壞死或直接導(dǎo)致心臟組織化學(xué)損傷有關(guān)[25-27]。然而,重復(fù)的乙醇注射會導(dǎo)致心肌的整體損傷、心室腔內(nèi)的凝固、全身并發(fā)癥和最終的死亡[28]。 導(dǎo)管消融雖是目前治療房顫的前沿技術(shù), 但在動物模型應(yīng)用中需要使用符合嚙齒類動物大小的定制射頻消融導(dǎo)管,阻礙了常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的廣泛實(shí)施[29]。 Kim等[30]通過心外膜下向房室結(jié)區(qū)域輸送電能并隨后纖維化,成功獲得大鼠長期存活的AVB 模型。 Kim等建立的方法是一種不同于以前在嚙齒類動物中創(chuàng)造AVB 的方法,即房室結(jié)區(qū)域細(xì)胞毒性化學(xué)物質(zhì)注射[31],或使用定制的射頻消融導(dǎo)管射頻房室結(jié)消融[13,32],或大鼠右側(cè)開胸后,利用細(xì)針通過電烙術(shù)在心外膜下向AVN 區(qū)域傳遞熱量[33]。

3 兔心律失常模型

兔子模型被廣泛用于實(shí)驗(yàn)性心臟電生理研究,因?yàn)榕c較大的動物(如狗、羊、豬等)相比,其成本較低,同時與較小的動物(如大鼠、小鼠等)相比,其提供了人類心臟電生理活動的合理近似值。 在波長和心臟大小之間的關(guān)系、強(qiáng)瞬時外向Ito 電流以及復(fù)極IKr 和IKs 電流的類似動力學(xué)方面,兔子的心臟電生理特征已被證明與人類的相匹配[34]。

由于兔房顫引起的電生理改變與人類一致,因此利用兔進(jìn)行房顫病理過程以及發(fā)病機(jī)制的研究比較合理。 但是,兔房顫持續(xù)時間相對較短,并且通常需要藥理學(xué)誘導(dǎo)。 此外,與小鼠、大鼠相比,很少有基因修飾的兔心律失常模型。 兔對外源性膽固醇吸收率高,對高脂血癥清除能力相對較低,是研究高脂血癥對心律失常影響中常見的動物模型。目前在兔動物模型中,常見的心律失常類型包括心房顫動、心室顫動等。

3.1 兔房顫模型

分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈、肺靜脈,然后在肺靜脈主干任意處使用自制雙電極電刺激,成功建立兔房顫模型[35]。 將電極置于左心房或右心房,進(jìn)行心內(nèi)膜或心外膜起搏,也可成功建立房顫模型,這可能與電刺激引起心肌電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)有關(guān)。 采用靜脈注射乙酰膽堿合并氯化鈣(Ach-CaCl2)混合溶液,也能成功制備兔房顫模型[36-38]。

3.2 兔室顫模型

由于大型動物很難獲得和維持,小鼠和大鼠大多發(fā)生非持續(xù)性心室顫動,這種顫動在沒有缺血/再灌注或鈣超載的情況下很難發(fā)生,此外,如果需要電生理定位,小鼠和大鼠的心臟太小,無法支持多個電極等原因,兔子模型在室顫研究中便顯得格外重要。 兔子作為中等大小的動物,因其具有易于獲得和維護(hù),心臟足夠大可以進(jìn)行各種測試的優(yōu)點(diǎn),適合建立室顫模型。 兔麻醉后,分左心室、右心室兩組分別進(jìn)行刺激。 在左心室組,導(dǎo)管通過左頸總動脈引入左心室。 右心室組打開胸腔,經(jīng)右頸靜脈將導(dǎo)管導(dǎo)入右心室。 兩種模型都能實(shí)現(xiàn)持續(xù)性室顫,其中左心室組采用的實(shí)驗(yàn)條件在誘發(fā)持續(xù)性心室顫動方面更具生理學(xué)意義且更有效[39]。 國內(nèi)外學(xué)者描述的誘發(fā)室顫的主要方法是缺血/再灌注、使用心律失常藥物或電刺激心臟。 然而,前兩種方法具有局限性,即缺血/再灌注法能夠引起活性氧產(chǎn)生加劇、細(xì)胞鈣濃度增加等從而導(dǎo)致心臟纖維壞死,結(jié)構(gòu)扭曲;藥物的使用會干擾心臟正常的生理情況,對結(jié)果造成影響。 相比之下,心臟的電刺激會導(dǎo)致折返性心律失常,而不會影響心肌細(xì)胞[40-41]。

4 犬心律失常模型

與小鼠、大鼠、兔模型相比,大型動物的心率等電生理特點(diǎn)與人類相似。 但大動物模型因成本高、繁殖周期長、基因打靶困難及所需化合物劑量大等原因,所以不適合新化合物篩選,同時大動物研究,不易被倫理接受,進(jìn)一步限制了應(yīng)用。 目前在犬動物模型中,常見的心律失常類型主要是心房顫動。

分離犬右外頸靜脈,將雙刺激電極經(jīng)頸靜脈進(jìn)入心臟,雙電極分別放在犬的右心室尖端和右心耳同時進(jìn)行電刺激,可成功誘發(fā)房顫[42]。 Saengklub等[43]通過將雙極起搏導(dǎo)管經(jīng)左頸靜脈放置于右心耳以及注射去氧腎上腺素的方式,成功建立AF 模型。 大多數(shù)麻醉劑會影響自主神經(jīng)平衡,并且許多麻醉劑是潛在的副交感神經(jīng)阻滯劑。 快速心房起搏能夠減少心房有效不應(yīng)期,減慢心房傳導(dǎo),并增加電生理異質(zhì)性[44]。 腎上腺素能神經(jīng)刺激可以增加左右心房不應(yīng)期和心房內(nèi)不應(yīng)期之間的差異,從而造成心房不應(yīng)期的異質(zhì)性,引起自發(fā)的動作電位[45]。 李暉等[46]對犬的心房進(jìn)行高頻刺激也成功誘發(fā)犬房顫模型。

5 山羊心律失常模型

羊由于心率與人較為接近,也被成功應(yīng)用于房顫模型研究。 Opaˇci'c 等[47]對山羊心房進(jìn)行電刺激建立房顫模型。 Angel 等[48]用同樣的方法,也成功誘發(fā)山羊房顫。

6 豬心律失常模型

豬與其他大型動物如羊、狗相比,在心臟大小和冠狀動脈解剖、血液動力學(xué)、生理和生物化學(xué)等方面與人類更具相似性,并且具有大量與人類相同的酶、蛋白質(zhì)等,因此特別適用于心律失常的藥物研究和開發(fā)。 但豬同樣也具有大型動物的缺點(diǎn),如可獲得性較低、成本較高、實(shí)驗(yàn)耗時長、大多數(shù)機(jī)構(gòu)缺乏合適的動物設(shè)施以及社會對其用于實(shí)驗(yàn)的接受程度普遍較低等原因。 Lee 等[49]將豬麻醉后行胸骨正中切開,將刺激電極置于左心耳成功誘導(dǎo)房顫。 這種房顫誘導(dǎo)方法起效快、可復(fù)制、可持續(xù),更易于新技術(shù)和方法的評估。 Liang 等[50]通過經(jīng)皮電刺激的方法成功誘導(dǎo)豬室顫模型。

7 小結(jié)與展望

動物模型的建立不僅有助于對心律失常的病理生理機(jī)制的深入理解,而且有助于新藥物、新設(shè)備或新干預(yù)手段的發(fā)現(xiàn)和檢測。 理想的動物模型不僅要概括導(dǎo)致心律失常的因果鏈的各個組成部分,還要概括整個過程中的每一步。 多年來,國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道了很多種心律失常動物模型的建立方法,本文對小鼠、大鼠及兔等心律失常動物模型的建立進(jìn)行了比較和總結(jié)。 正常小鼠由于心房較小,難以容納多折返環(huán)等原因,使得一些干預(yù)措施受到限制,甚至是不可能的,因此小鼠房顫、室顫等心律失常模型應(yīng)用較少。 而大鼠在心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)和藥物代謝等方面比小鼠更接近于人類,使其成為評估試驗(yàn)藥物心臟電生理效應(yīng)和研究心血管疾病中離子通道分布及作用的重要工具,大鼠房顫模型應(yīng)用較為廣泛。 同時,由于小鼠、大鼠的心臟大小、心率、耗氧量、收縮力等與人類具有差異,使其心律失常的電生理特性,如動作電位形態(tài)和持續(xù)時間、離子通道分布等與人類有很大不同,所以其進(jìn)一步的發(fā)展受到限制。 大動物心律失常模型仍具有非常重要的研究價值,但大動物模型成本高,不適合標(biāo)準(zhǔn)臺式研究,不易被倫理接受。

因?yàn)樾穆墒С４_切的電生理機(jī)制以及病理過程仍不十分清楚,并且心律失常類型不同其發(fā)生機(jī)制也不完全相同等原因,給新藥的研究和應(yīng)用帶來難度,所以動物模型的使用十分重要。 現(xiàn)有的動物模型往往由單一致病因素引發(fā),癥狀表現(xiàn)單一,不能全面體現(xiàn)出心律失常的發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn)的復(fù)雜性,與人類心律失常表現(xiàn)的癥狀多樣性存在一定差距,并且不能完全滿足模擬臨床特征的實(shí)驗(yàn)研究需要。 因此,心律失常動物模型未來的研究應(yīng)盡可能全面地模擬人類臨床疾病病理進(jìn)程,大小鼠模型應(yīng)朝著更接近人類電生理學(xué)特征、臨床表現(xiàn)等方向進(jìn)行,而大動物模型則應(yīng)注重降低成本、增加倫理普及等。 相信隨著科技的發(fā)展,研究者們能夠不斷完善研究方法及評價體系,發(fā)現(xiàn)更適合人類心律失常研究的多樣化的精準(zhǔn)動物模型。